Name: identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation
Uploaded: 2020-05-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation at JoVE.com

Agradecemos à Sra. Karla Gorena pela assistência técnica na citometria de fluxo. L.S. é apoiado pelo China Scholarship Council e Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. é apoiado pelo Departamento de Ciências Clínicas do Laboratório, Faculdade de Ciências Médicas Aplicadas, Universidade de Jouf, Sakaka, Arábia Saudita. X.D.L. é apoiado pelo UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund e pelo Max and Minnei Voelcker Fund.

Os procedimentos experimentais descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas Health San Antonio.
1. Mancha de ponto para mostrar a presença de estruturas dsRNA no RNA total HDM
<ol><li>Isolamento total do RNA de alérgenos, insetos e alergênicos não-insetos<ol>
<li>Coloque hdm, insetos ou animais não-insetos coletados vivos ou obtidos comercialmente em tubos de 50 mL, e congele rapidamente com líquido-N2. Em se...

<ol>
	<li>Strachan, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hay+fever,+hygiene,+and+household+size.">Hay fever, hygiene, and household size.</a> BMJ. 299, 1259-1260 (1989).</li><li>Schuijs, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farm+dust+and+endotoxin+protect+against+allergy+through+A20+induction+in+lung+epithelial+cells.">Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells.</a> Science. 349, 1106-1110 (2015).</li><li>Stein, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+and+Asthma+Risk+in+Amish+and+Hutterite+Farm+Children.">Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children.</a> New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).</li><li>Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Endogenous+Nucleic+Acids+by+the+Innate+Immune+System.">Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System.</a> Immunity. 44, 739-754 (2016).</li><li>Schlee, M., Hartmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discriminating+self+from+non-self+in+nucleic+acid+sensing.">Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing.</a> Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).</li><li>Wu, J., Chen, Z. 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Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html">https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html</a> (2018)</li><li>Weber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).</li><li>Barral, P. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+Th1/Th2+paradigm+towards+a+Toll-like+receptor/T-helper+bias.">From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).</li><li>McNally, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+administration+of+dsRNA+analog+poly(I:C)+induces+interferon-alpha+receptor-dependent+accumulation+of+antigen+experienced+T+cells+in+the+airways.">Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways.</a> PLoS One. 7, 51351 (2012).</li><li>Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+with+dsRNA+adjuvant+ARNAX+induces+antigen-specific+tumor+shrinkage+without+cytokinemia.">Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia.</a> Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).</li><li>Toussi, D. N., Massari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Adjuvant+Effect+of+molecularly+defined+Toll-Like+Receptor+Ligands.">Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands.</a> Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).</li><li>She, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Sensing+of+Aeroallergen-Associated+Double-Stranded+RNA+Triggers+an+IFN+Response+and+Modulates+Type+2+Lung+Inflammation.">Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation.</a> Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).</li><li>Fujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+inflammation+and+cytokine+dynamics+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+from+a+mouse+model+of+bronchial+asthma+during+A(H1N1)pdm09+influenza+infection.">Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection.</a> Science Reports. 7, 9128 (2017).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Autonomous+Memory+Alveolar+Macrophages+Requires+T+Cell+Help+and+Is+Critical+to+Trained+Immunity.">Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity.</a> Cell. 175, 1634-1650 (2018).</li><li>Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+techniques+for+bronchoalveolar+lavage+in+translational+respiratory+research:+Paving+the+way+to+develop+novel+therapeutic+moieties.">Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties.</a> Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Salahuddin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+and+Matched+Blood+for+Alveolar+Macrophage+and+CD4++T-cell+Immunophenotyping+and+HIV+Reservoir+Assessment.">Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).</li><li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-Stranded+RNA+Is+Detected+by+Immunofluorescence+Analysis+in+RNA+and+DNA+Virus+Infections,+Including+Those+by+Negative-Stranded+RNA+Viruses.">Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li><li>Monsion, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Detection+of+Long+dsRNA+in+Vitro+and+in+Vivo+Using+the+dsRNA+Binding+Domain+from+FHV+B2+Protein.">Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein.</a> Front Plant Sci. 9, 70 (2018).</li><li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+sex+dimorphisms+contribute+to+the+severity+of+bleomycin-induced+lung+injury+and+fibrosis.">Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).</li><li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+murine+airway+responsiveness+and+lipopolysaccharide-induced+inflammation.">Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).</li><li>Gueders, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+asthma:+a+comparison+between+C57BL/6+and+BALB/c+strains+regarding+bronchial+responsiveness,+inflammation,+and+cytokine+production.">Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production.</a> Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).</li></ol>

O protocolo atual descreve como avaliar as propriedades imunoestimulatórias do RNA microbiano associado ao alérgeno e seus impactos no desenvolvimento da inflamação pulmonar eosinofílica em um modelo de camundongo de asma alérgica. Embora os DSRNAs longos sejam conhecidos como intermediários de replicação de muitos vírus que podem potencialmente ativar respostas de interferon em células de mamíferos, suas presenças em alérgenos HDM têm sido desconhecidas até nosso trabalho recente15</sup...

Com base na hipótese de higiene originalmente proposta por Strachan1, a exposição infantil a fatores microbianos ambientais, como a endotoxina, pode proteger contra o desenvolvimento de transtornos alérgicos2,,3. Durante infecções microbianas, por exemplo, infecções virais, a detecção imune inata de ácidos nucleicos estranhos (RNA/DNA) desencadeia respostas de defesa do hospedeiro4,,5,,6. No entanto, a existência e prevalência de ácidos nucleicos imunogênicos, como espécies de RNA (dsRNA) de dupla-encalhadas em ácaros domésticos (HDM) ou outros alérgenos de insetos permanecem desconhecidas. Este protocolo foi projetado para determinar se os alérgenos hdm ou insetos e não-insetos contêm espécies de dsRNA longas que podem ativar uma resposta imune protetora para neutralizar o desenvolvimento de inflamação pulmonar eosinofílica grave em um modelo de camundongo de asma alérgica. Aqui, fornecemos três métodos simples e rápidos para avaliar os determinantes estruturais no RNA total HDM que são necessários para regular a inflamação pulmonar eosinofílica induzida por alérgenos.
O sistema imunológico mucosa é o maior órgão imunológico do corpo e serve como primeira linha de defesa hospedeira contra infecções microbianas e insultos alérgicos7,,8. O dsRNA longo, o intermediário de replicação de muitos vírus, é conhecido por funcionar como um padrão molecular associado ao patógeno (PAMP) para estimular potentemente respostas inatas via Toll like receptor 3 (TLR3) para induzir a expressão de genes estimulados por interferon (ISGs)9,,10,,11,12,13,14. Recentemente, mostramos que o RNA total hdm continha estruturas de dsRNA, o que regulava a expressão dos ISGs e reduzia a inflamação pulmonar eosinofílica grave quando administrado através da instilação intratraqueal em um modelo murino de asma alérgica induzida pelos extratos de HDM15. A gravidade das inflamações pulmonares é determinada pela análise dos tipos de células imunes na lavagem broncoalveolar (BAL) e no tecido pulmonar através da citometria de fluxo16,17,,18,,19,20.
Este protocolo inclui três ensaios: 1) detecção rápida de estruturas dsRNA com mancha de ponto RNA usando um anticorpo monoclonal de rato J2 que se liga especificamente ao dsRNA (≥40bp) de forma independente de sequência; 2) avaliação rápida para efeitos in vivo do RNA imunoestimulativo nos pulmões do camundongo medindo a indução de ISGs utilizando RT-qPCR; 3) quantificação precisa de eosinófilos em BAL e pulmão no contexto de inflamação pulmonar induzida pelo HDM utilizando a análise da citometria de fluxo.
Os ensaios acima podem ser usados para estudar não apenas doenças pulmonares alérgicas, mas também infecções bacterianas e virais respiratórias. Por exemplo, o anticorpo J2 específico dsRNA também pode ser usado em outras aplicações como cromatografia imunoaffinity, imunohistoquímica, ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA) e imunostaining21,,22,23. Além disso, várias aplicações a jusante da coleta de fluidos BAL podem ser utilizadas para quantificar conteúdos solúveis, como citocinas e quimiocinas usando ELISA, e perfil transcricional de células nas vias aéreas (por exemplo, macrófagos alveolares). Embora existam uma variedade de protocolos disponíveis na literatura para avaliar as condições pulmonares, a maioria desses protocolos muitas vezes se concentra na validação do alvo. Os procedimentos aqui descritos podem ser aplicados para identificar componentes em alérgenos ambientais que são importantes para regular o desenvolvimento de doenças alérgicas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.40 &#181;m Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>5010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Counting Beads</td>
			<td>Life Technologies Europe B.V.</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK-RBC lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond-N+ Membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560456</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117317</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0193-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15-0031-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103130</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-5931-82</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-5321-80</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>552126</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI34042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannual, 20G X 1.5&#8221;</td>
			<td>CADENCE SCIENCE</td>
			<td>9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cockroach</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. farinae</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pteronyssinus</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1156F03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Bath - Four Blocks</td>
			<td>Universal Medical, Inc.</td>
			<td>BSH1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earthworm</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL</td>
			<td>STEMCELLTM TECHNOLOGIES</td>
			<td>38056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (BD FACS Celesta)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott Labs</td>
			<td>sc-363629Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 anti-dsRNA monoclonal antibody</td>
			<td>SCICONS</td>
			<td>10010200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung digestion solution</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913050-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL tube</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU:116913100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-BeadBeater</td>
			<td>Homogenizers</td>
			<td>SKU:BS:607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000C</td>
			<td>Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply</td>
			<td>TSCND2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 21 G x 1 1/2 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat milk</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1706404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon string</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>3243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase III</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-6802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker or Small laboratory mixer</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>201100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPHERO AccuCount Fluorescent</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>ACFP-70-5</td>
			<td>1 to 10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spider</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cell medium</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 2400 UV</td>
			<td>LabX</td>
			<td>20447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasp</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation

Alérgenos ambientais, como ácaros domésticos (HDM) são frequentemente em formas complexas que contêm tanto proteínas alérgicas que impulsionam respostas aberrantes tipo 2 quanto substâncias microbianas que induzem respostas imunes inatas. Esses componentes microbianos associados ao alérgeno desempenham um papel importante na regulação do desenvolvimento de condições inflamatórias tipo 2, como asma alérgica. No entanto, os mecanismos subjacentes permanecem em grande parte indefinidos. O protocolo aqui apresentado determina as características estruturais e a atividade in vivo do RNA imunoestimulatório associado ao alérgeno. Especificamente, alérgenos comuns são examinados para a presença de espécies de RNA de dupla laminada (dsRNA) que podem estimular as respostas de IFN nos pulmões e conter o desenvolvimento de eosinofilia pulmonar grave em um modelo de camundongos de asma alérgica induzida por HDM. Aqui, incluímos os seguintes três ensaios: Mancha de ponto para mostrar as estruturas dsRNA no total de RNA isolado de alérgenos, incluindo espécies HDM, RT-qPCR para medir as atividades de HDM RNA na expressão de genes estimulantes de interferon (ISGs) em pulmões de camundongos e análise FACS para determinar os efeitos do RNA HDM sobre o número de eosinófilos em BAL e pulmão, respectivamente.

A presença de estruturas de dsRNA longas em HDM, insetos e animais pequenos não-insetos foi examinada por mancha de ponto usando um anticorpo monoclonal de camundongos específico dsRNA J2 (≥ 40bp). RNase III foi usado para digerir dsRNA em fragmentos de dsRNA de 12 a 15 bp, que eram indetectáveis por J2 (Figura 1).
A capacidade do RNA total hdm de estimular uma resposta imune inata nos pulmões do camundongo de forma dependente de dose foi analisada por RT-q...

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Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

Alérgenos ambientais, como ácaros domésticos (HDM), geralmente contêm substâncias microbianas que ativam respostas imunes inatas para regular a inflamação alérgica. O protocolo aqui apresentado demonstra a identificação de espécies de dsRNA em alérgenos HDM e caracterização de suas atividades imunogênicas na modulação da inflamação pulmonar eosinofílica.

Identificação e Caracterização de Espécies imunogênicas de RNA em Alérgenos HDM que modulam inflamação pulmonar eosinofílica

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

Este protocolo foi concebido para abordar uma questão muito importante e não resolvida sobre como substâncias microbianas presentes e alérgenos ambientais podem regular o desenvolvimento de inflamações alérgicas. Especificamente, os métodos aqui apresentados podem ajudar a responder se as espécies de RNA de duplar encalhadas em ácaros domésticos são imunogênicas in vivo e capazes de modular a inflamação pulmonar eosinofílica. As principais vantagens dessas técnicas são que elas são simples, eficientes, altamente reprodutíveis e podem ser realizadas usando ferramentas e equipamentos comumente usados.Esses métodos também podem ser utilizados para avaliar doenças pulmonares causadas por infecções virais respiratórias. Li She, uma estudante de pós-graduação no meu laboratório, ajudará a demonstrar o procedimento. Comece isolando o RNA total de alérgenos, insetos e alérgenos não-insetos.Transfira uma quantidade adequada de espécime para um tubo de dois mililitros contendo 1,4 milímetros de contas cerâmicos, e congele os tubos em um recipiente de nitrogênio líquido por aproximadamente 10 minutos. Adicione um mililitro de reagente de isolamento RNA à base de tiocianato de guanidinium em cada tubo. Em seguida, quebre os animais pequenos insetos e não-insetos com um disruptor de células de alta energia em velocidade máxima por 45 segundos.Esfrie a amostra no gelo e repita esse processo duas vezes. Transfira a solução para um novo tubo de 1,5 mililitro. Adicione 200 microlitadores de clorofórmio a cada tubo, e vórtice da amostra.Centrifugar os tubos a 14.000 vezes g por 14 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira a fase aquosa superior para um novo tubo contendo 500 microliters de isopropanol. Misture a amostra.Em seguida, centrifuá-lo a 14.000 vezes g por 14 minutos a quatro graus Celsius. Aspire cuidadosamente o supernascida. Em seguida, lave a pelota de RNA com 500 microliters de 75% de etanol, e centrífuga-a a 7.500 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Remova cuidadosamente todo o líquido. Seque a pelota e dissolva o RNA com 20 a 50 microliters de água sem RNase. Para detectar as estruturas de RNA de duplar encalhadas no RNA total, localmente dois microlitres da amostra de RNA de 200 nanogramas por microliter na membrana de nylon carregada positivamente.Cruze as amostras para a membrana a 1.200 microjoules por 100 em um crosslinker UV. Repita a mancha e o crosslinking mais duas vezes, o que resultará em um total de 1,2 microgramas de RNA por mancha. Bloqueie a ligação não específica com 5% de leite em TBS-T durante uma hora enquanto treme à temperatura ambiente.Em seguida, remova a solução de bloqueio e adicione o anticorpo RNA J2 anti-duplo-encalhado em uma diluição de 1 a 1.000 em 1% de leite em TBS-T. Incubar a membrana durante a noite com tremor a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave a membrana três vezes com TBS-T por cinco minutos por lavagem.Adicione o anticorpo secundário e incubar a membrana por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, repita as lavagens com TBS-T. Adicione o substrato e incubar a membrana por cinco a 15 minutos até que um sinal desejado seja visível.Pare a reação enxaguando a membrana com água duplamente destilada. Para coletar as amostras de pulmão, coloque os pulmões em papéis de tecido, e extirbe um pequeno pedaço de cada lobo pulmonar. Coloque cada peça em um tubo de dois mililitros contendo contas.Para coletar lavagem broncoalveolar, desinfetar um rato eutanizado com 70% de etanol, e usar uma tesoura para cortar a pele da área superior do abdômen até o pescoço. Puxe suavemente as glândulas salivares e o músculo esternoide com fórceps para expor a traqueia. Em seguida, coloque uma corda de nylon sob ele.Faça uma incisão na traqueia aproximadamente dois mililitros sob a laringe apenas o suficiente para inserir uma cânula, e nó a corda em torno da traqueia e cânula. Coloque uma seringa na extremidade da cânula e carregue-a com PBS-EDTA fresco. Em seguida, injete e aspire um mililitro da solução no pulmão.Retire a seringa da cânula e ejete a solução em um tubo de 15 mililitros. Repita este processo para gelo com PBS-EDTA fresco, e acumule o lavage. Centrifugar o tubo a 500 vezes g por sete minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, registe o volume e transfira o supernante para dois tubos de 1,5 mililitro sem perturbar a pelota. Depois de reutilizar a pelota, transfira 150 microliters em uma placa de 96 poços, e centrifugar a placa por sete minutos a 500 vezes g e quatro graus Celsius. Em seguida, inverta rapidamente a placa em papel de tecido para remover o supernante.Manche as células com anticorpos no tampão FACS na presença de anticorpos bloqueadores de 2,4G2 e incubar a placa em temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Após a coloração, centrifufique a placa para pelotar as células a 500 vezes g por sete minutos a quatro graus Celsius. Remova a solução de coloração invertendo a placa em papel de tecido.Adicione 100 microliters de tampão FACS para lavar as células e, em seguida, repita a centrifugação. Resuspenha as amostras em 150 microliters de tampão FACS e, em seguida, transfira-as para tubos FACS contendo 350 microliters adicionais de buffer. Adicione 25 microliters de contas de contagem a cada amostra e proceda com a análise de citometria de fluxo.A presença de longas estruturas de RNA de dois fios em ácaros, insetos e animais pequenos não-insetos foi examinada por mancha de ponto usando um anticorpo monoclonal de camundongos de dois fios, específico do RNA. RNase III foi usado para digerir o RNA de dois fios em fragmentos de par de base de 12 a 15, que eram indetectáveis por J2. A capacidade do RNA total de ácaros de poeira doméstica para estimular uma resposta imune inata nos pulmões do camundongo foi demonstrada pelo RT-qPCR. O tratamento RNase III aboliu a atividade imunoestimulatória do RNA total de ácaros de poeira doméstica, indicando que as estruturas de RNA de duplar encalhadas são essenciais para a atividade imunológica inata nos pulmões.O efeito inibidor do rna total de ácaros de poeira doméstica no desenvolvimento de uma inflamação pulmonar grave tipo dois foi avaliado com a análise FACS. A inflamação pulmonar eosinofílica foi induzida por extratos de ácaros, que foram tratados com ou sem RNase III. A degradação de longas espécies de RNA de dois fios resultou em inflamação pulmonar grave tipo dois, refletida pelo aumento do número de eosinófilos na lavagem broncoalveolar e nos pulmões.Notavelmente, o número de eosinófilos no grupo total tratado de RNA de ácaros é comparável ao grupo tratado com o extrato original de ácaro de poeira que continha endógenamente a longa espécie de RNA de duas cadeias. Ao tentar este protocolo, tenha muito cuidado ao injetar e recolher o fluido BAL, pois qualquer dano aos pulmões nesta fase pode alterar os resultados finais. Além desse procedimento, outros métodos como o ELISA podem ser realizados para analisar conteúdos solúveis não celulares presentes no fluido BAL.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem outras substâncias microbianas presentes em alérgenos ambientais, como fatores de RNA não duplamente encalhados que podem regular o desenvolvimento de inflamação pulmonar alérgica.

Research

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