Name: identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation
Uploaded: 2020-05-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation at JoVE.com

Vi tackar Ms Karla Gorena för tekniskt stöd i flöde cytometri. L.S. stöds av China Scholarship Council och Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate (CX201713068). H.H.A. stöds av Institutionen för kliniska laboratorievetenskaper, College of Applied Medical Sciences, Jouf University, Sakaka, Saudiarabien. X.D.L. stöds av UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund och Max och Minnei Voelcker Fund.

Experimentella förfaranden som beskrivs här godkändes av institutionella Animal Care and Use Committee of University of Texas Health San Antonio.
1. Dot blot för att visa förekomsten av DSRNA strukturer i HDM totalt RNA
<ol><li>Total RNA-isolering från allergener, insekter och non-insect allergener<ol>
<li>Sätt HDM, insekter eller icke-insektsdjur som samlats in levande eller erhålls kommersiellt i 50 ml-rör, och frys snabbt med flytande-N2. Förvara sedan vid -70 °C fö...

<ol>
	<li>Strachan, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hay+fever,+hygiene,+and+household+size.">Hay fever, hygiene, and household size.</a> BMJ. 299, 1259-1260 (1989).</li><li>Schuijs, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farm+dust+and+endotoxin+protect+against+allergy+through+A20+induction+in+lung+epithelial+cells.">Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells.</a> Science. 349, 1106-1110 (2015).</li><li>Stein, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+and+Asthma+Risk+in+Amish+and+Hutterite+Farm+Children.">Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children.</a> New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).</li><li>Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Endogenous+Nucleic+Acids+by+the+Innate+Immune+System.">Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System.</a> Immunity. 44, 739-754 (2016).</li><li>Schlee, M., Hartmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discriminating+self+from+non-self+in+nucleic+acid+sensing.">Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing.</a> Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).</li><li>Wu, J., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+sensing+and+signaling+of+cytosolic+nucleic+acids.">Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids.</a> Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).</li><li>O'Hara, A. M., Shanahan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+flora+as+a+forgotten+organ.">The gut flora as a forgotten organ.</a> EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).</li><li>. Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html">https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html</a> (2018)</li><li>Weber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).</li><li>Barral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+cytoplasmic+RNA+sensors+RIG-I+and+MDA-5:+Key+regulators+of+innate+immunity.">Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity.</a> Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).</li><li>Netea, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+Th1/Th2+paradigm+towards+a+Toll-like+receptor/T-helper+bias.">From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).</li><li>McNally, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+administration+of+dsRNA+analog+poly(I:C)+induces+interferon-alpha+receptor-dependent+accumulation+of+antigen+experienced+T+cells+in+the+airways.">Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways.</a> PLoS One. 7, 51351 (2012).</li><li>Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+with+dsRNA+adjuvant+ARNAX+induces+antigen-specific+tumor+shrinkage+without+cytokinemia.">Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia.</a> Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).</li><li>Toussi, D. N., Massari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Adjuvant+Effect+of+molecularly+defined+Toll-Like+Receptor+Ligands.">Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands.</a> Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).</li><li>She, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Sensing+of+Aeroallergen-Associated+Double-Stranded+RNA+Triggers+an+IFN+Response+and+Modulates+Type+2+Lung+Inflammation.">Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation.</a> Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).</li><li>Fujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+inflammation+and+cytokine+dynamics+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+from+a+mouse+model+of+bronchial+asthma+during+A(H1N1)pdm09+influenza+infection.">Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection.</a> Science Reports. 7, 9128 (2017).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Autonomous+Memory+Alveolar+Macrophages+Requires+T+Cell+Help+and+Is+Critical+to+Trained+Immunity.">Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity.</a> Cell. 175, 1634-1650 (2018).</li><li>Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+techniques+for+bronchoalveolar+lavage+in+translational+respiratory+research:+Paving+the+way+to+develop+novel+therapeutic+moieties.">Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties.</a> Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Salahuddin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+and+Matched+Blood+for+Alveolar+Macrophage+and+CD4++T-cell+Immunophenotyping+and+HIV+Reservoir+Assessment.">Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).</li><li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-Stranded+RNA+Is+Detected+by+Immunofluorescence+Analysis+in+RNA+and+DNA+Virus+Infections,+Including+Those+by+Negative-Stranded+RNA+Viruses.">Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li><li>Monsion, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Detection+of+Long+dsRNA+in+Vitro+and+in+Vivo+Using+the+dsRNA+Binding+Domain+from+FHV+B2+Protein.">Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein.</a> Front Plant Sci. 9, 70 (2018).</li><li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+sex+dimorphisms+contribute+to+the+severity+of+bleomycin-induced+lung+injury+and+fibrosis.">Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).</li><li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+murine+airway+responsiveness+and+lipopolysaccharide-induced+inflammation.">Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).</li><li>Gueders, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+asthma:+a+comparison+between+C57BL/6+and+BALB/c+strains+regarding+bronchial+responsiveness,+inflammation,+and+cytokine+production.">Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production.</a> Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).</li></ol>

Det nuvarande protokollet beskriver hur man utvärderar immunstimulerande egenskaper allergen-associerade mikrobiella RNA och deras effekter på utvecklingen av eosinofil lungcancer inflammation i en mus modell av allergisk astma. Även om långa dsRNAs är kända som replikering intermediärer av många virus som kan aktivera interferon svar i däggdjursceller, deras närvaro i HDM allergener har varit okänd tills vårt senaste arbete15. Kombinationen av RNA dot blot, RT-qPCR och FACS analys pre...

Baserat på hygienhypotesen som ursprungligen föreslogs av Strachan1, tidig barndom exponering för miljömässiga mikrobiella faktorer såsom endotoxin kan skydda mot utvecklingen av allergiska sjukdomar2,3. Vid mikrobiella infektioner, t.ex.4,5,6 Förekomsten och prevalensen av immunogena nukleinsyror såsom långa dubbelsträngade RNA-arter (dsRNA) i husdammmider (HDM) eller andra insektsallergener är dock fortfarande okända. Detta protokoll har utformats för att avgöra om HDM eller insekts- och non-insect allergener innehåller långa dsRNA-arter som kan aktivera ett skyddande immunsvar för att motverka utvecklingen av svår eosinofil lunginflammation i en musmodell av allergisk astma. Här erbjuder vi tre enkla och snabba metoder för att utvärdera de strukturella bestämningsfaktorerna i HDM totala RNA som krävs för att reglera allergen-inducerad eosinofil lunginflammation.
Den slemhinnan immunsystemet är den största immunsystemet i kroppen och fungerar som den första raden av värd försvar mot både mikrobiella infektioner och allergiska förolämpningar7,8. Den långa dsRNA, replikationen mellanliggande av många virus, är känd för att fungera som en patogen-associerade molekylära mönster (PAMP) för att kraftfullt stimulera medfödda svar via Toll som receptor 3 (TLR3) för att framkalla uttrycket av interferon stimuleras gener (ISGs)9,10,11,12,13,14. Vi har nyligen visat att HDM totala RNA innehöll dsRNA strukturer, som uppreglerade uttrycket av ISGs och minskade allvarliga eosinofila lunginflammation när de administreras via intratracheal instillation i en murine modell av allergisk astma framkallas av HDMextrakt 15. Svårighetsgraden av lunginflammationer bestäms genom att analysera immuncelltyperna i bronchoalveolar lavage (BAL) och lungvävnad via flödescytometri16,17,18,19,20.
Detta protokoll innehåller tre analyser: 1) snabb detektering av dsRNA-strukturer med RNA-punkt blot med hjälp av en mus monoklonal antikropp J2 som specifikt binder till dsRNA (≥40bp) på ett sekvensoberoende sätt; 2) snabb utvärdering för in vivo effekter av immunstimulerande RNA i mus lungor genom att mäta induktion av ISGs med HJÄLP AV RT-qPCR; 3) korrekt kvantifiering av eosinofiler i BAL och lunga i samband med HDM-inducerad lunginflammation med flöde cytometri analys.
Ovanstående analyser kan användas för att studera inte bara allergiska lungsjukdomar, men också respiratoriska bakteriella och virala infektioner. Till exempel kan dsRNA-specifika J2-antikroppar också användas i andra tillämpningar såsom immunoaffinitetkromatografi, immunohistokemi, enzymrelaterad immunsorbentanalys (ELISA) och immunbehållande21,22,23. Dessutom kan flera tillämpningar nedströms BAL-vätskeinsamling användas för att kvantifiera lösligt innehåll såsom cytokiner och chemokines med HJÄLP AV ELISA, och transkriptionell profilering av celler i luftvägarna (t.ex. alveolar makrofager). Även om det finns en mängd olika protokoll som finns i litteraturen för att utvärdera lungsjukdomar, fokuserar de flesta av dessa protokoll ofta på målvalideringen. De förfaranden som beskrivs här kan tillämpas för att identifiera komponenter i miljöallergener som är viktiga för att reglera utvecklingen av allergiska sjukdomar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.40 &#181;m Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>5010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Counting Beads</td>
			<td>Life Technologies Europe B.V.</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK-RBC lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond-N+ Membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560456</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117317</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0193-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15-0031-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103130</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-5931-82</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-5321-80</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>552126</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI34042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannual, 20G X 1.5&#8221;</td>
			<td>CADENCE SCIENCE</td>
			<td>9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cockroach</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. farinae</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pteronyssinus</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1156F03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Bath - Four Blocks</td>
			<td>Universal Medical, Inc.</td>
			<td>BSH1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earthworm</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL</td>
			<td>STEMCELLTM TECHNOLOGIES</td>
			<td>38056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (BD FACS Celesta)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott Labs</td>
			<td>sc-363629Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 anti-dsRNA monoclonal antibody</td>
			<td>SCICONS</td>
			<td>10010200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung digestion solution</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913050-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL tube</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU:116913100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-BeadBeater</td>
			<td>Homogenizers</td>
			<td>SKU:BS:607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000C</td>
			<td>Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply</td>
			<td>TSCND2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 21 G x 1 1/2 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat milk</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1706404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon string</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>3243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase III</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-6802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker or Small laboratory mixer</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>201100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPHERO AccuCount Fluorescent</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>ACFP-70-5</td>
			<td>1 to 10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spider</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cell medium</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 2400 UV</td>
			<td>LabX</td>
			<td>20447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasp</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation

Miljöallergener som dammkvalster (HDM) är ofta i komplexa former som innehåller både allergiska proteiner som driver avvikande typ 2-svar och mikrobiella ämnen som inducerar medfödda immunsvar. Dessa allergen-associerade mikrobiella komponenter spelar en viktig roll i regleringen av utvecklingen av typ 2 inflammatoriska tillstånd såsom allergisk astma. De underliggande mekanismerna är dock fortfarande i stort sett odefinierade. Protokollet presenteras här bestämmer strukturella egenskaper och in vivo verksamhet allergen-associerade immunstimulerande RNA. Specifikt undersöks vanliga allergener för förekomsten av dubbelsträngade RNA (dsRNA) arter som kan stimulera IFN svar i lungorna och begränsa utvecklingen av svår lungeosinofili i en mus modell av HDM-inducerad allergisk astma. Här har vi inkluderat följande tre analyser: Dot blot att visa dsRNA strukturer i totalt RNA isolerade från allergener inklusive HDM arter, RT-qPCR att mäta verksamheten i HDM RNA i interferon stimulerande gener (ISGs) uttryck i mus lungor och FACS analys för att bestämma effekterna av HDM RNA på antalet eosinofiler i BAL och lunga, respektive.

Förekomsten av långa dsRNA strukturer i HSM, insekter och icke-insekt små djur undersöktes av dot blot med hjälp av en dsRNA-specifik mus monoklonala antikroppar J2 (≥ 40bp). RNase III användes för att smälta dsRNA till 12–15 bp dsRNA-fragment, som inte kunde upptäckas av J2 (figur 1).
Förmågan hos HDM totala RNA att stimulera ett medfött immunsvar i muslungor på ett dosberoende sätt analyserades av RT-qPCR (figur 2,...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation at JoVE.com

Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

Miljöallergener som dammkvalster (HDM) innehåller ofta mikrobiella ämnen som aktiverar medfödda immunsvar för att reglera allergisk inflammation. Protokollet presenteras här visar identifiering av DSRNA arter i HDM allergener och karakterisering av deras immunogenic verksamhet i modulering eosinofila lungcancer inflammation.

Identifiering och karakterisering av immunogenic RNA Arter i HDM Allergener som modulerar Eosinofil lunginflammation

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

Detta protokoll var utformat för att ta itu med en mycket viktig och olöst fråga om hur mikrobiella ämnen närvarande och miljöalleraller kan reglera utvecklingen av allergisk inflammation. Specifikt kan de metoder som presenteras här hjälpa till att svara på om dubbelsträngade RNA-arter i husdammkvalster är immunogena in vivo och kan modulera eosinofil lunginflammation. De största fördelarna med dessa tekniker är att de är enkla, effektiva, mycket reproducerbara och kan utföras med vanliga verktyg och utrustning.Dessa metoder kan också användas för att utvärdera lungsjukdomar orsakade av luftvägsvirusinfektioner. Li Hon, en doktorand i mitt laboratorium, kommer att bidra till att visa förfarandet. Börja med att isolera totalt RNA från allergener, insekter och icke-insektsallergeens.Överför en ordentlig mängd exemplar i ett två milliliter rör som innehåller 1,4 millimeter keramiska pärlor, och frys rören i en behållare för flytande kväve i cirka 10 minuter. Tillsätt en milliliter guanidiniumtiocyanat-baserade RNA-isoleringsreagens till varje rör. Sedan bryta insekten och icke-insekt små djur med en högenergicellsstörare vid högsta hastighet i 45 sekunder.Kyl provet på is, och upprepa denna process två gånger. Överför lösningen till ett nytt 1,5-milliliterrör. Tillsätt 200 mikroliter kloroform till varje rör, och vortexa provet.Centrifugera rören vid 14, 000 gånger g i 14 minuter vid fyra grader Celsius. Överför sedan den övre vattenfasen till ett nytt rör som innehåller 500 mikroliter isopropanol. Blanda provet.Sedan centrifug det på 14, 000 gånger g i 14 minuter vid fyra grader Celsius. Aspirera försiktigt supernatanten. Tvätta sedan RNA pelleten med 500 mikroliter av 75%etanol, och centrifug den på 7, 500 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius.Ta försiktigt bort all vätska. Lufttorka pelleten, och lös upp RNA med 20 till 50 mikroliter av RNase-fritt vatten. För att upptäcka de dubbelsträngade RNA-strukturerna i det totala RNA, plats två mikroliter av 200-nanogram-per-microliter RNA prov på positivt laddade nylonmembran.Tvärkoppla proverna till membranet vid 1, 200 mikrojoule med 100 i en UV-crosslinker. Upprepa spotting och crosslinking ytterligare två gånger, vilket kommer att resultera i totalt 1,2 mikrogram RNA per blot. Blockera icke-specifik bindning med 5%mjölk i TBS-T i en timme medan du skakar i rumstemperatur.Ta sedan bort den blockerande lösningen, och tillsätt anti-dubbelsträngad RNA J2-antikropp vid en en-till-1, 000 utspädning i 1%mjölk i TBS-T. Inkubera membranet över natten med skakningar vid fyra grader Celsius. Nästa dag tvättar du membranet tre gånger med TBS-T i fem minuter per tvätt.Tillsätt sekundärantikroppen, och inkubera membranet i en timme vid rumstemperatur. Upprepa sedan tvättarna med TBS-T. Tillsätt underlaget, och inkubera membranet i fem till 15 minuter tills en önskad signal är synlig.Stoppa reaktionen genom att skölja membranet med dubbeldestillerat vatten. För att samla in lungproverna, placera lungorna på vävnadspapper, och punktskatt en liten bit av varje lunglob. Placera varje bit i ett två-milliliter rör som innehåller pärlor.För att samla bronchoalveolar lavage, desinficera en avlivad mus med 70%etanol, och använd sax för att skära huden från övre delen av buken till halsen. Dra försiktigt spottkörtlarna och sternohyoid muskeln isär med tärna för att exponera luftstrupen. Placera sedan en nylonsträng under den.Gör ett snitt i luftstrupen cirka två milliliter under struphuvudet precis tillräckligt för att sätta in en kanyl, och knut strängen runt luftstrupen och kanyl. Fäst en spruta i änden av kanylen, och ladda den med färsk PBS-EDTA. Injicera och aspirera sedan en milliliter av lösningen i lungan.Lossa sprutan från kanylen och mata ut lösningen i ett 15-milliliterrör. Upprepa denna process till is med färska PBS-EDTA, och pool lavage. Centrifugera röret vid 500 gånger g i sju minuter vid fyra grader Celsius.Spela sedan in volymen och överför supernatanten till två 1,5-milliliterrör utan att störa pelleten. Efter resuutering av pelleten, överför 150 mikroliter till en 96-brunnsplatta och centrifugera plattan i sju minuter vid 500 gånger g och fyra grader Celsius. Sedan snabbt invertera plattan på silkespapper för att ta bort supernatanten.Fläck cellerna med antikroppar i FACS buffert i närvaro av 2.4G2 blockerande antikropp, och inkubera plattan vid rumstemperatur i 30 minuter i mörker. Efter färgning centrifugera plattan till pellet cellerna vid 500 gånger g i sju minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort färgningslösningen genom att vända på plattan på mjukpapper.Tillsätt 100 mikroliter FACS-buffert för att tvätta cellerna och upprepa sedan centrifugeringen. Resuspend proverna i 150 mikroliter av FACS buffert, och sedan överföra dem till FACS rör som innehåller ytterligare 350 mikroliter av buffert. Tillsätt 25 mikroliter av räkna pärlor till varje prov, och fortsätt med flödescytometri analys.Förekomsten av långa dubbelsträngade RNA-strukturer i husdammkvalster, insekter och icke-insektssmiska smådjur undersöktes av dot blot med hjälp av en dubbelsträngad, RNA-specifik monoklonal antikropp. RNase III användes för att smälta den dubbelsträngade RNA i 12 till 15 baspar fragment, som var omöjlig att upptäcka av J2. Förmåga hus damm mite totalt RNA att stimulera en medfödd immunsvar i musen lungor visades av RT-qPCR. RNase III-behandlingen avskaffade den immunstimulatoriska aktiviteten hos husdammsummemets totala RNA, vilket indikerar att de dubbelsträngade RNA-strukturerna är nödvändiga för medfödd immunaktivitet i lungorna.Den hämmande effekten av hus damm mite totala RNA på utvecklingen av en allvarlig typ två lung inflammation utvärderades med FACS analys. Den eosinofila lungcancer inflammation var framkallas av damm mite extrakt, som behandlades med eller utan RNase III. Nedbrytningen av långa dubbelsträngade RNA-arter resulterade i allvarlig typ två lung inflammation, återspeglas av de ökade eosinofil nummer i bronchoalveolar lavage och lungor.I synnerhet är antalet eosinofiler i den totala RNA-behandlade gruppen för dammkikat jämförbart med den grupp som behandlats med det ursprungliga stoftkitetsextraktet som endogent innehåll de långa dubbelsträngade RNA-arterna. När du försöker detta protokoll, var mycket försiktig när du injicerar och minns BAL-vätskan, eftersom eventuella skador på lungorna i detta skede kan förändra slutresultaten. Förutom denna procedur, andra metoder som ELISA kan utföras för att analysera icke-cellulära lösliga innehåll som finns i BAL vätskan.Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare att utforska andra mikrobiella ämnen som finns i miljöalleraller, såsom icke-dubbelsträngade RNA-faktorer som kan reglera utvecklingen av allergiska lunginflammationer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Ett 1,5 timme Förfarande för identifikation av Enterococcus Arter Direkt från blododlingar

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Använda ägg från<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Som en<em&gt; In vivo</em&gt; Modell av inälvsmask-lunginflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction och 2-D-gelelektrofores Metoder för<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nukleokapsid Annealing-medierad elektrofores (NAME) Analys Tillåter snabb identifiering av HIV-1 nukleokapsiden Hämmare

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-medierad Isothermal Amplification (LAMP) Analyser för de artspecifika Upptäckt av<em&gt; Eimeria</em&gt; Som infekterar Kycklingar

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolering, karakterisering och funktionella Undersökning av tandkötts Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Inrättandet av en hög kapacitet Setup för screening av små molekyler som modulerar c-di-GMP Signalering i<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Funktionell karaktärisering av regulatoriska makrofager som inhiberar graftreaktiv immunitet

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolering, karakterisering och rening av makrofager från vävnader som påverkas av fetma-relaterade Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Precision-cut Mouse Lung skivor att visualisera Live Pulmonary dendritiska celler

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...