Name: identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation
Uploaded: 2020-05-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation at JoVE.com

Bayan Karla Gorena'ya akış sitometrisinde teknik yardım için teşekkür ederiz. L.S. Çin Burs Konseyi ve Hunan İl İnovasyon Vakfı Lisansüstü (CX201713068) tarafından desteklenir. H.H.A. Klinik Laboratuvar Bilimleri Bölümü, Uygulamalı Tıp Bilimleri Koleji, Jouf Üniversitesi, Sakaka, Suudi Arabistan tarafından desteklenmiştir. X.D.L. UT Health San Antonio School of Medicine Startup Fund ve Max ve Minnei Voelcker Fund tarafından desteklenir.

Burada açıklanan deneysel prosedürler Texas Üniversitesi Sağlık San Antonio Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. HDM toplam RNA dsRNA yapıların varlığını göstermek için nokta leke
<ol><li>Alerjenlerden, böceklerden ve böcek dışı alerjenlerden toplam RNA izolasyonu<ol>
<li>HDM, böcekler veya böcek olmayan hayvanlar canlı toplanan veya ticari olarak elde 50 mL tüpler içine koyun ve hızlı bir şekilde sıvı-N2ile don...

<ol>
	<li>Strachan, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hay+fever,+hygiene,+and+household+size.">Hay fever, hygiene, and household size.</a> BMJ. 299, 1259-1260 (1989).</li><li>Schuijs, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Farm+dust+and+endotoxin+protect+against+allergy+through+A20+induction+in+lung+epithelial+cells.">Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells.</a> Science. 349, 1106-1110 (2015).</li><li>Stein, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+and+Asthma+Risk+in+Amish+and+Hutterite+Farm+Children.">Innate Immunity and Asthma Risk in Amish and Hutterite Farm Children.</a> New England Journal of Medicine. 375, 411-421 (2016).</li><li>Roers, A., Hiller, B., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Endogenous+Nucleic+Acids+by+the+Innate+Immune+System.">Recognition of Endogenous Nucleic Acids by the Innate Immune System.</a> Immunity. 44, 739-754 (2016).</li><li>Schlee, M., Hartmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discriminating+self+from+non-self+in+nucleic+acid+sensing.">Discriminating self from non-self in nucleic acid sensing.</a> Nature Reviews Immunology. 16, 566-580 (2016).</li><li>Wu, J., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+sensing+and+signaling+of+cytosolic+nucleic+acids.">Innate immune sensing and signaling of cytosolic nucleic acids.</a> Annual Reviews Immunology. 32, 461-488 (2014).</li><li>O'Hara, A. M., Shanahan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+flora+as+a+forgotten+organ.">The gut flora as a forgotten organ.</a> EMBO Reports. 7 (7), 688-693 (2006).</li><li>. Focused Meeting 2018: Microbes and Mucosal Surfaces Available from: <a target="_blank" href="https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html">https://microbiologysociety.org/event/society-events-and-meetings/focused-meeting-2018-microbes-and-mucosal-surfaces.html</a> (2018)</li><li>Weber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-stranded+RNA+is+produced+by+positive-strand+RNA+viruses+and+DNA+viruses+but+not+in+detectable+amounts+by+negative-strand+RNA+viruses.">Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 80, 5059-5064 (2006).</li><li>Barral, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+cytoplasmic+RNA+sensors+RIG-I+and+MDA-5:+Key+regulators+of+innate+immunity.">Functions of the cytoplasmic RNA sensors RIG-I and MDA-5: Key regulators of innate immunity.</a> Pharmacology and Therapeutics. 124, 219-234 (2009).</li><li>Netea, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+Th1/Th2+paradigm+towards+a+Toll-like+receptor/T-helper+bias.">From the Th1/Th2 paradigm towards a Toll-like receptor/T-helper bias.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 3991-3996 (2005).</li><li>McNally, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intranasal+administration+of+dsRNA+analog+poly(I:C)+induces+interferon-alpha+receptor-dependent+accumulation+of+antigen+experienced+T+cells+in+the+airways.">Intranasal administration of dsRNA analog poly(I:C) induces interferon-alpha receptor-dependent accumulation of antigen experienced T cells in the airways.</a> PLoS One. 7, 51351 (2012).</li><li>Seya, T., Takeda, Y., Matsumoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+vaccines+with+dsRNA+adjuvant+ARNAX+induces+antigen-specific+tumor+shrinkage+without+cytokinemia.">Tumor vaccines with dsRNA adjuvant ARNAX induces antigen-specific tumor shrinkage without cytokinemia.</a> Oncoimmunology. 5, 1043506 (2016).</li><li>Toussi, D. N., Massari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Adjuvant+Effect+of+molecularly+defined+Toll-Like+Receptor+Ligands.">Immune Adjuvant Effect of molecularly defined Toll-Like Receptor Ligands.</a> Vaccines (Basel). 2, 323-353 (2014).</li><li>She, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Sensing+of+Aeroallergen-Associated+Double-Stranded+RNA+Triggers+an+IFN+Response+and+Modulates+Type+2+Lung+Inflammation.">Immune Sensing of Aeroallergen-Associated Double-Stranded RNA Triggers an IFN Response and Modulates Type 2 Lung Inflammation.</a> Journal of Immunology. 203, 2520-2531 (2019).</li><li>Fujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+inflammation+and+cytokine+dynamics+of+bronchoalveolar+lavage+fluid+from+a+mouse+model+of+bronchial+asthma+during+A(H1N1)pdm09+influenza+infection.">Pulmonary inflammation and cytokine dynamics of bronchoalveolar lavage fluid from a mouse model of bronchial asthma during A(H1N1)pdm09 influenza infection.</a> Science Reports. 7, 9128 (2017).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Autonomous+Memory+Alveolar+Macrophages+Requires+T+Cell+Help+and+Is+Critical+to+Trained+Immunity.">Induction of Autonomous Memory Alveolar Macrophages Requires T Cell Help and Is Critical to Trained Immunity.</a> Cell. 175, 1634-1650 (2018).</li><li>Dua, K., Shukla, S. D., Hansbro, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspiration+techniques+for+bronchoalveolar+lavage+in+translational+respiratory+research:+Paving+the+way+to+develop+novel+therapeutic+moieties.">Aspiration techniques for bronchoalveolar lavage in translational respiratory research: Paving the way to develop novel therapeutic moieties.</a> Journal of Biological Methods. 4, 73 (2017).</li><li>Van Hoecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+Lavage+of+Murine+Lungs+to+Analyze+Inflammatory+Cell+Infiltration.">Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).</li><li>Salahuddin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Bronchoalveolar+Lavage+Fluid+and+Matched+Blood+for+Alveolar+Macrophage+and+CD4++T-cell+Immunophenotyping+and+HIV+Reservoir+Assessment.">Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (148), e59427 (2019).</li><li>Son, K. N., Liang, Z., Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-Stranded+RNA+Is+Detected+by+Immunofluorescence+Analysis+in+RNA+and+DNA+Virus+Infections,+Including+Those+by+Negative-Stranded+RNA+Viruses.">Double-Stranded RNA Is Detected by Immunofluorescence Analysis in RNA and DNA Virus Infections, Including Those by Negative-Stranded RNA Viruses.</a> Journal of Virology. 89, 9383-9392 (2015).</li><li>Monsion, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Detection+of+Long+dsRNA+in+Vitro+and+in+Vivo+Using+the+dsRNA+Binding+Domain+from+FHV+B2+Protein.">Efficient Detection of Long dsRNA in Vitro and in Vivo Using the dsRNA Binding Domain from FHV B2 Protein.</a> Front Plant Sci. 9, 70 (2018).</li><li>Redente, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+sex+dimorphisms+contribute+to+the+severity+of+bleomycin-induced+lung+injury+and+fibrosis.">Age and sex dimorphisms contribute to the severity of bleomycin-induced lung injury and fibrosis.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 301, 510-518 (2011).</li><li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+murine+airway+responsiveness+and+lipopolysaccharide-induced+inflammation.">Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 177, 621-630 (2006).</li><li>Gueders, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+asthma:+a+comparison+between+C57BL/6+and+BALB/c+strains+regarding+bronchial+responsiveness,+inflammation,+and+cytokine+production.">Mouse models of asthma: a comparison between C57BL/6 and BALB/c strains regarding bronchial responsiveness, inflammation, and cytokine production.</a> Inflammation Research. 58, 845-854 (2009).</li></ol>

Mevcut protokol, alerjik astım bir fare modelinde alerjen ilişkili mikrobiyal RNA immünsiyonlaştırıcı özellikleri ve eozinofilik akciğer iltihabı gelişimi üzerindeki etkileri nasıl değerlendirilecektir açıklar. Uzun dsRNA'lar memeli hücrelerinde interferon yanıtlarını etkinhale getirebilen birçok virüsün replikasyon araları olarak bilinse de, HDM alerjenlerindeki varlıkları son çalışmamıza kadar bilinmemektedir15. Bu el yazmasında sunulan RNA nokta lekesi, RT-qPCR ve...

Hijyen hipotezi başlangıçta Strachantarafındanönerilen 1 , endotoksin gibi çevresel mikrobiyal faktörlere erken çocukluk maruz kalma alerjik bozuklukların gelişimine karşı koruyabilirsiniz2,3. Mikrobiyal enfeksiyonlar sırasında, örneğin, viral enfeksiyonlar, yabancı nükleik asitlerin doğuştan gelen bağışıklık tespiti (RNA / DNA) konak savunma yanıtlarıtetikler 4,5,6. Ancak, ev tozu akarları (HDM) veya diğer böcek alerjenlerinde uzun çift iplikli RNA (dsRNA) türleri gibi immünojenik nükleik asitlerin varlığı ve yaygınlığı bilinmemektedir. Bu protokol, HDM veya böcek ve böcek dışı alerjenlerin bir fare modelinde şiddetli eozinofilik akciğer iltihabı gelişimini etkisiz hale getirmek için koruyucu bir bağışıklık yanıtını aktive edebilen uzun dsRNA türleri içerip içermediğini belirlemek için tasarlanmıştır. Burada, alerjen kaynaklı eozinofilik akciğer iltihabını düzenlemek için gerekli olan HDM toplam RNA yapısal belirleyicileri değerlendirmek için üç basit ve hızlı yöntem sağlar.
Mukozal bağışıklık sistemi vücuttaki en büyük bağışıklık organıdır ve hem mikrobiyal enfeksiyonlara hem de alerjik hakaretlere karşı ev sahibi savunmanın ilk satırı olarak hizmet vermektedir7,8. Uzun dsRNA, birçok virüsün replikasyon ara, bir patojen ilişkili moleküler desen olarak işlev bilinmektedir (PAMP) güçlü reseptör gibi Toll aracılığıyla doğuştan gelen tepkileri uyarmak için 3 (TLR3) interferon uyarılmış genlerin ekspresyonu ikna etmek için (ISGs)9,10,11,12,13,14. Son zamanlarda HDM toplam RNA dsRNA yapıları içerdiğini göstermiştir, Hangi ISGs ekspresyonu upregulated ve HDM özleri tarafından indüklenen alerjik astım bir murine modelinde intratrakeal instillasyon yoluyla uygulandığında şiddetli eozinofilik akciğer iltihabı azaltılmış15. Akciğer iltihaplarının şiddeti, bronkoalveoler lavaj (BAL) ve akciğer dokusunda kantisat hücre tiplerinin akış sitometrisi16,17,18,,19,20ile analiz edilerek belirlenir.
Bu protokol üç tahlil içerir: 1) rna nokta lekeli dsRNA yapılarının hızlı bir şekilde saptanması, özellikle dsRNA'ya (≥40bp) diziden bağımsız bir şekilde bağlanan bir fare monoklonal antikor J2 kullanarak; 2) RT-qPCR kullanarak ISG'lerin indüksiyonölçerek fare akciğerlerinde immünsülatör RNA in vivo etkileri için hızlı değerlendirilmesi; 3) hdm kaynaklı akciğer iltihabı bağlamında BAL ve akciğer eozinofiller doğru nicel akış sitometri analizi kullanarak.
Yukarıdaki tahliller sadece alerjik akciğer hastalıkları, aynı zamanda solunum bakteriyel ve viral enfeksiyonları incelemek için kullanılabilir. Örneğin, dsRNA spesifik J2 antikor da immünaffinity kromatografi, immünohistokimya, enzim ekine bağlı immünosorbent tsay (ELISA) ve immünostaining21,,22,23gibi diğer uygulamalarda kullanılabilir. Buna ek olarak, BAL sıvı toplama nın alt akışında, ELISA kullanarak sitokinler ve kemokinler gibi çözünür içeriğin ölçülmesi ve hava yollarında hücrelerin transkripsiyonel profilinin (örn. alveoler makrofajlar) ölçülmesi için çeşitli uygulamalar kullanılabilir. Literatürde akciğer koşullarını değerlendirmek için çeşitli protokoller bulunmasına rağmen, bu protokollerin çoğu genellikle hedef doğrulamaya odaklanır. Burada açıklanan prosedürler alerjik hastalıkların gelişimini düzenleyen önemli olan çevresel alerjenlerde bileşenleri belirlemek için uygulanabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.40 &#181;m Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>5010.200V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tube</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Counting Beads</td>
			<td>Life Technologies Europe B.V.</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK-RBC lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amersham Hybond-N+ Membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11b V450 Rat (clone M1/70)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560456</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD11c PE-Cy7 (clone N418)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>117317</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD19 Alexa Flour 647 (clone 1D3)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0193-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD3e APC (clone 145-2C11)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15-0031-81</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse CD45 APC-Cy7 (clone: 30-F11)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103130</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Fixable Viabillity Dye eFluor 506</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65-0866-14</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (H+L), AP Conjugate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>S3721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Ly-6G FITC (clone RB6-8C5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-5931-82</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse MHC II APC-eFluor 780 (clone M5/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-5321-80</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse Siglec-F PE (clone E50-2440)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>552126</td>
			<td>1 to 200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI34042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see Table 5 for recipe)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannual, 20G X 1.5&#8221;</td>
			<td>CADENCE SCIENCE</td>
			<td>9920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1855485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cockroach</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>01-1234-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. farinae</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D. pteronyssinus</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denville Cell Culture Plates with lid, 96 well cell culture plate</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1156F03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Dry Bath - Four Blocks</td>
			<td>Universal Medical, Inc.</td>
			<td>BSH1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earthworm</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes, 5 mL</td>
			<td>STEMCELLTM TECHNOLOGIES</td>
			<td>38056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (BD FACS Celesta)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT-DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Vivo MAb anti-mouse CD16/CD32 (clone: 2.4G2)</td>
			<td>Bio X Cell</td>
			<td>BE0307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott Labs</td>
			<td>sc-363629Rx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP2618500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J2 anti-dsRNA monoclonal antibody</td>
			<td>SCICONS</td>
			<td>10010200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung digestion solution</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913050-CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix D, 2 mL tube</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>SKU:116913100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice (female, 8-12 weeks old, C57BL/6J)</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>#000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-BeadBeater</td>
			<td>Homogenizers</td>
			<td>SKU:BS:607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Beadbeater-16</td>
			<td>Biospec</td>
			<td>607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito</td>
			<td>Greer Laboratories</td>
			<td>B55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000C</td>
			<td>Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply</td>
			<td>TSCND2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 21 G x 1 1/2 in</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat milk</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1706404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon string</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>3243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase III</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase T1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-6802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker or Small laboratory mixer</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>201100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPHERO AccuCount Fluorescent</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>ACFP-70-5</td>
			<td>1 to 10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spider</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total cell medium</td>
			<td></td>
			<td>(see recipe in Table 5)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Stratalinker 2400 UV</td>
			<td>LabX</td>
			<td>20447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wasp</td>
			<td>San Antonio</td>
			<td>Note: Locally collected</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and characterization of immunogenic rna species in hdm allergens that modulate eosinophilic lung inflammation

Ev tozu akarları (HDM) gibi çevresel alerjenler genellikle anormal tip 2 yanıtları sürücü alerjik proteinler ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtları neden mikrobiyal maddeler hem içeren karmaşık formlarda bulunmaktadır. Bu alerjen ilişkili mikrobiyal bileşenler, alerjik astım gibi tip 2 inflamatuar koşulların gelişimini düzenleyen önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, altta yatan mekanizmalar büyük ölçüde tanımsız kalır. Burada sunulan protokol, alerjenilişkili immünsülatör RNA'nın yapısal özelliklerini ve in vivo aktivitesini belirler. Özellikle, ortak alerjenler akciğerlerde IFN yanıtlarını uyarabilir ve HDM kaynaklı alerjik astım bir fare modelinde şiddetli akciğer eozinofili gelişimini dizginlemek çift iplikli RNA (dsRNA) türlerinin varlığı için incelenir. Burada, aşağıdaki üç tahlilleri dahil ettik: HDM türleri de dahil olmak üzere alerjenlerden izole toplam RNA dsRNA yapıları göstermek için nokta leke, RT-qPCR interferon uyarıcı genlerde HDM RNA faaliyetlerini ölçmek için (ISGs) fare akciğerlerve FACS analizinde HDM RNA etkilerini belirlemek için BAL ve akciğer, sırasıyla.

HDM, böcekler ve böcek olmayan küçük hayvanlarda uzun dsRNA yapılarının varlığı dsRNA'ya özgü fare monoklonal antikor J2 (≥ 40bp) kullanılarak nokta lekesi ile incelendi. RNase III, DSRNA'yı 12-15 bp dsRNA parçalarıhalinde sindirmek için kullanıldı ve bunlar J2 tarafından saptanamadı (Şekil 1).
HDM total RNA'nın fare akciğerlerinde doğuştan gelen bir immün yanıtı doza bağımlı bir şekilde uyarabilme yeteneği RT-qPCR<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation at JoVE.com

Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

Ev tozu akarları (HDM) gibi çevresel alerjenler genellikle alerjik iltihabı düzenlemek için doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını aktive mikrobiyal maddeler içerir. Burada sunulan protokol HDM alerjenlerinde dsRNA türlerinin tanımlanmasını ve eozinofilik akciğer iltihabının modüle edilmesinde immünojenik faaliyetlerinin karakterizasyonunu göstermektedir.

Eozinofilik Akciğer İltihabını Modüle Eden HDM Alerjenlerinde İmmünojenik RNA Türlerinin Tanımlanması ve Karakterizasyonu

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

Bu protokol, mevcut mikrobiyal maddelerin ve çevresel alerjenlerin alerjik inflamasyon gelişimini nasıl düzenleyebileceği konusunda çok önemli ve çözülmemiş bir sorunu ele almak üzere tasarlanmıştır. Özellikle, burada sunulan yöntemler ev tozu akarları çift iplikli RNA türlerinin in vivo immünojenik olup olmadığını ve eozinofilik akciğer iltihabı modüle mümkün olup olmadığını cevap yardımcı olabilir. Bu tekniklerin başlıca avantajları basit, verimli, yüksek oranda tekrarlanabilir olmaları ve yaygın olarak kullanılan araç ve gereçler kullanılarak yapIlebilmektedir.Bu yöntemler solunum yolu viral enfeksiyonların neden olduğu akciğer hastalıklarını değerlendirmek için de kullanılabilir. Li She, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi, prosedürü göstermeye yardımcı olacak. Toplam RNA'yı alerjenlerden, böceklerden ve böcek dışı alerjenlerden izole ederek başlayın.Uygun miktarda numuneyi 1,4 milimetre seramik boncuk içeren iki mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpleri sıvı nitrojen kabındaki tüpleri yaklaşık 10 dakika dondurun. Her tüpe bir mililitre guanidinium tiyosiyanat bazlı RNA izolasyon reaktifi ekleyin. Sonra 45 saniye boyunca maksimum hızda yüksek enerjili hücre bozucu ile böcek ve böcek olmayan küçük hayvanlar kırın.Numuneyi buzüzerinde soğutun ve bu işlemi iki kez tekrarlayın. Çözeltiyi 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Her tüpe 200 mikrolitre kloroform ekleyin ve numuneyi girdaplayın.Tüpleri 14,000 kez 4 santigrat derecede 14 dakika santrifüj edin. Daha sonra üst sulu fazı 500 mikrolitre izopropanol içeren yeni bir tüpe aktarın. Örneği karıştırın.Sonra 14, 000 kez g 14 dakika 4 santigrat derece santrifüj. Supernatant'ı dikkatlice aspire edin. Daha sonra RNA peletini 500 mikrolitre %75 etanol ile yıkayın ve 7,500 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.Tüm sıvıyı dikkatlice çıkarın. Pelet hava kurutun ve RNA'yı 20 ila 50 mikrolitre RNase içermeyen suyla eritin. Toplam RNA'daki çift iplikli RNA yapılarını tespit etmek için, 200 nanogramlık mikrolitre başına mikrolitre RNA örneğini pozitif yüklü naylon membranüzerine noktalandırın.1, 200 microjoule 100 bir UV crosslinker örnekleri çapraz bağlantı. Lekeleme ve iki kez daha çapraz bağlama tekrarlayın, bu da leke başına toplam 1,2 mikrogram RNA ile sonuçlanır. Oda sıcaklığında sallayarak bir saat boyunca TBS-T%5 süt ile spesifik olmayan bağlamayı engelleyin.Daha sonra blokaj çözeltisini çıkarın ve TBS-T'de %1 sütte bire bir, 000 seyreltme de çift iplikçikli RNA J2 antikorekleyin. Membranı bir gecede dört santigrat derecede sallayarak kuluçkaya yatırın. Ertesi gün membranı tbs-T ile üç kez yıkayın ve yıkama başına beş dakika yıkayın.İkincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat boyunca membran kuluçka. Sonra TBS-T ile yıkıntıları tekrarlayın. Substrat ekleyin ve istenilen sinyal görünür olana kadar 5 ila 15 dakika boyunca membran kuluçka.Membranı çift distile suyla durulayarak reaksiyonu durdurun. Akciğer örneklerini toplamak için, doku kağıtları üzerine akciğerler ilerler ve her akciğer lobu küçük bir parça çıkarmak. Her parçayı boncuk içeren iki mililitrelik bir tüpiçine yerleştirin.Bronkoalveoler lavaj toplamak için,% 70 etanol ile bir ötenazi fare dezenfekte, ve boyun karın üst bölgesinden deri kesmek için makas kullanın. Yavaşça tükürük bezleri ve sternohyoid kas ayrı trakea ortaya çıkarmak için forceps ile çekin. Sonra altına bir naylon dize yerleştirin.Gırtlak altında yaklaşık iki mililitre trakea bir kesi yapmak sadece bir kanül eklemek için yeterli, ve trakea ve kanül etrafında dize düğüm. Kanülün ucuna bir şırınga takın ve taze PBS-EDTA ile yükleyin. Sonra enjekte ve akciğeriçine çözeltinin bir mililitre aspire.Şırıngayı kanülden ayırın ve çözeltiyi 15 mililitrelik bir tüpe atın. Taze PBS-EDTA ile buz bu işlemi tekrarlayın ve lavaj havuz. Tüpü 500 kez g'de dört santigrat derecede yedi dakika santrifüj edin.Sonra hacmi kaydedin ve pelet rahatsız etmeden iki 1.5 mililitrelik tüpler için supernatant aktarın. Pelet imal edildikten sonra, 150 mikrolitreyi 96 kuyulu bir plakaya aktarın ve plakayı 500 kez g ve 4 santigrat derecede yedi dakika santrifüj edin. Sonra hızlı bir şekilde supernatant kaldırmak için kağıt mendil üzerinde plaka ters.2.4G2 bloke antikor varlığında FACS tampon antikorları ile hücreleri leke ve karanlıkta 30 dakika boyunca oda sıcaklığında plaka kuluçka. Boyama sonra, dört santigrat derece yedi dakika boyunca 500 kez g hücreleri pelet için plaka santrifüj. Kağıt mendil üzerinde plaka ters çevirerek boyama çözeltisi çıkarın.Hücreleri yıkamak için 100 mikrolitre FACS arabelleği ekleyin ve sonra santrifüjü tekrarlayın. 150 mikrolitre FACS tamponundaki numuneleri yeniden askıya alın ve 350 mikrolitre ek tampon içeren FACS tüplerine aktarın. Her numuneye 25 mikrolitre sayma boncuk ekleyin ve akış sitometri analizine devam edin.Ev tozu akarları, böcekler ve böcek olmayan küçük hayvanlarda uzun çift iplikli RNA yapılarının varlığı çift iplikli, RNA'ya özgü fare monoklonal antikor kullanılarak nokta lekesi ile incelendi. RNase III, çift iplikli RNA'yı J2 tarafından tespit edilemeyen 12-15 baz çifti parçasına sindirmek için kullanıldı. Ev tozu akarı toplam RNA fare akciğerlerinde doğuştan gelen bir bağışıklık yanıtı uyarmak için yeteneği RT-qPCR tarafından gösterilmiştir. RNase III tedavisi ev tozu akarı toplam RNA immünstimülan aktivitesi ni ortadan kaldırarak, çift iplikli RNA yapılarının akciğerlerde doğuştan gelen bağışıklık aktivitesi için gerekli olduğunu belirtti.Ev tozu akarı toplam RNA'nın şiddetli tip iki akciğer iltihabı gelişimi üzerindeki inhibitör etkisi FACS analizi ile değerlendirildi. Eozinofilik akciğer iltihabı toz akar özleri tarafından indüklenen, rnase III ile veya olmadan tedavi edildi. Uzun çift iplikli RNA türlerinin bozulması şiddetli tip iki akciğer iltihabı ile sonuçlandı, bronkoalveoler lavaj ve akciğerlerde artan eozinofil sayıları ile yansıyan.Özellikle, toz akarı toplam RNA tedavi grubunda eozinofil sayısı endojen uzun çift iplikçikli RNA türleri içeren orijinal toz akarı ekstresi ile tedavi grup karşılaştırılabilir. Bu protokolü denerken, BAL sıvısını enjekte ederken ve geri toplarken çok dikkatli olun, çünkü bu aşamada akciğerlerde meydana gelen herhangi bir hasar nihai sonuçları değiştirebilir. Bu prosedüre ek olarak, BAL sıvısında bulunan hücresel olmayan çözünür içeriği analiz etmek için ELISA gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.Bu teknik, geliştirilmesinden sonra, araştırmacıların çevresel alerjenlerde bulunan diğer mikrobiyal maddeleri keşfetmelerinin önünü açmıştır, örneğin alerjik akciğer iltihabı gelişimini düzenleyen çift iplikçikli olmayan RNA faktörleri gibi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Belirlenmesi için 1.5 Saat Usulü Enterococcus</emDoğrudan Kan Kültürleri> Türler

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Gelen Yumurta kullanma<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Bir şekilde<em&gt; In vivo</emHelmint bağlı Akciğer iltihabı ve&gt; Model

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Toplam Protein Ekstraksiyon ve 2-D Jel Elektroforez Yöntemleri<em&gt; Burkholderia</em&gt; Türler

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Tavlama Dolayımlı Elektroforez (ADI) Testi HIV-1 Nükieokapsit inhibitörlerinin Hızlı tanımlanması sağlar

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Türler özgü Algılama Loop-aracılı İzotermal Amplifikasyon (LAMP) Tahliller<em&gt; Eimeria</em&gt; Tavuklar bulaştırmak ki

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

İzolasyon, Karakterizasyonu ve Dişeti Bağışıklık Hücre Ağı Fonksiyonel Sınav

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Greft Reaktif Bağışıklığı Engelleyen Düzenleyici Makrofajların Fonksiyonel Karakterizasyonu

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize&#39;a Fare Akciğer Dilimleri

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...