Name: high-throughput assays of critical thermal limits in insects
Uploaded: 2020-06-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects at JoVE.com

نشكر (إيلي مكابي) على مساعدتها في تربية الذبابة ويدعم هذا العمل من قبل وزارة الزراعة الأمريكية المعهد الوطني للأغذية والزراعة مشروع منحة 1010996 والمؤسسة الوطنية للعلوم منحة OIA -1826689 لN.M.T.

1. عالية الإنتاجية CTدقيقة المقايسة
<ol><li>تجميع العمود المعطف (الشكل 1أ، الشكل 2)<ol>
<li>قطع أوسع (7 سم × 6.35 سم × 0.3 سم) وأضيق (5.7 سم × 5.1 سم × 0.3 سم) أنابيب الاكريليك إلى أطوال متساوية (31.5 سم) مع المنشار (الشكل 2أ). هذه الأنابيب اثن...

<ol>
	<li>Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+variation,+thermal+extremes+and+the+physiological+performance+of+individuals.">Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals.</a> Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).</li><li>Angilletta, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).</li><li>Coumou, D., Rahms Torf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+weather+extremes.">A decade of weather extremes.</a> Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).</li><li>Wang, G., Dillon, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+geographic+convergence+in+diurnal+and+annual+temperature+cycling+flattens+global+thermal+profiles.">Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles.</a> Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).</li><li>MacMillan, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+cause+from+consequence:+A+systematic+approach+to+thermal+limits.">Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits.</a> Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).</li><li>Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+invitation+to+measure+insect+cold+tolerance:+Methods,+approaches,+and+workflow.">An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow.</a> Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).</li><li>Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+thermal+maximum:+History+and+critique.">The critical thermal maximum: History and critique.</a> Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).</li><li>Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unifying+indices+of+heat+tolerance+in+ectotherms.">Unifying indices of heat tolerance in ectotherms.</a> Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).</li><li>J&#248;rgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+assess+Drosophila+heat+tolerance:+Unifying+static+and+dynamic+tolerance+assays+to+predict+heat+distribution+limits.">How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits.</a> Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).</li><li>Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+rapid+measurement+of+thermal+tolerance+traits+in+studies+of+small+insects.">A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects.</a> Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).</li><li>Andersen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+assess+Drosophila+cold+tolerance:+Chill+coma+temperature+and+lower+lethal+temperature+are+the+best+predictors+of+cold+distribution+limits.">How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits.</a> Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).</li><li>Hu, X. P., Appel, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+of+critical+thermal+limits+and+temperature+tolerance+in+Formosan+and+eastern+subterranean+termites+(Isoptera:+Rhinotermitidae).">Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae).</a> Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).</li><li>Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+for+tolerance+to+high+temperatures+in+a+population+of+Drosophila+melanogaster.">Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster.</a> Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).</li><li>Overgaard, J., Kristensen, T. N., S&#248;rensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validity+of+thermal+ramping+assays+used+to+assess+thermal+tolerance+in+arthropods.">Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods.</a> PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).</li><li>Klok, C. J., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+thermal+limits,+temperature+tolerance+and+water+balance+of+a+sub-Antarctic+kelp+fly,+Paractora+dreuxi+(Lepidoptera:+Tineidae).">Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae).</a> Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).</li><li>Salachan, P. V., Burgaud, H., S&#248;rensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+thermal+limits:+Non-linear+reaction+norms+drive+disparate+thermal+acclimation+responses+in+Drosophila+melanogaster.">Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).</li><li>Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+acclimation+temperature+on+thermal+activity+thresholds+in+polar+terrestrial+invertebrates.">The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).</li><li>MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+gut+in+insect+chilling+injury:+Cold-Induced+disruption+of+osmoregulation+in+the+fall+field+cricket,+Gryllus+pennsylvanicus.">The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).</li><li>Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+measurement+of+heat+or+cold+resistance+of+small+insects.">A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects.</a> British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).</li><li>Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+maternal+variation+for+heat+resistance+in+drosophila+from+the+field.">Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field.</a> Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).</li><li>Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+chill-coma+onset+and+recovery+at+the+extremes+of+the+thermal+window+of+Drosophila+melanogaster.">The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).</li><li>S&#248;rensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+the+heat+hardening+response+in+an+Arctic+insect.">Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect.</a> Biology Letters. 15 (10), (2019).</li><li>Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-based+electronic+fall-through+probe+insect+counter+for+monitoring+infestation+in+stored+products.">A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products.</a> Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).</li><li>MacKay, T. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel.">The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel.</a> Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).</li><li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).</li><li>Garcia, M. J., Teets, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+stress+results+in+sustained+locomotor+and+behavioral+deficits+in+Drosophila+melanogaster.">Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).</li><li>Teets, N. M., Hahn, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+the+shape+of+cold-survival+curves+in+a+single+fly+population+suggests+potential+for+selection+from+climate+variability.">Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability.</a> Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).</li><li>Kelty, J. D., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+rapid+cold+hardening+by+cooling+at+ecologically+relevant+rates+in+Drosophila+melanogaster.">Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).</li><li>MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+insect+chill-coma.">Mechanisms underlying insect chill-coma.</a> Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).</li><li>Salachan, P. V., S&#248;rensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+thermal+limits+affected+differently+by+developmental+and+adult+thermal+fluctuations.">Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).</li><li>Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+robust+sex-specific+trade-off+between+cold+resistance+and+starvation+resistance+in+Drosophila+melanogaster.">Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).</li><li>Kelty, J. D., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cold-hardening+of+Drosophila+melanogaster+(Diptera:+Drosophilidae)+during+ecologically+based+thermoperiodic+cycles.">Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles.</a> Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).</li><li>Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insects+at+low+temperatures:+An+ecological+perspective.">Insects at low temperatures: An ecological perspective.</a> Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).</li></ol>

الطريقتان المفصلتان أعلاه تولدان بيانات عالية الإنتاجية للمقاييس ذات الصلة من الناحية الإيكولوجية للحدود الحرارية العليا والدنيا. وتستند هذه البروتوكولات إلى منهجيات سبق وضعها في البحوث المتعلقة بالقيود الحرارية للحشرات (ملخصة في Sinclair et al.) 6.يمكن الانتهاء من كل من البروت...

الحدود الحرارية للحشرات الاختلاف في الظروف البيئية، بما في ذلك درجة الحرارة، هو عامل رئيسي يؤثر على الأداء واللياقة البدنية والبقاء على قيد الحياة والتوزيع الجغرافي للكائنات الحية1،2. تحدد الحدود الحرارية العليا والدنيا النطاق النظري للبيئات التي يمكن أن يتسامح معها الكائن الحي ، وبالتالي ، فإن هذه الحدود هي تنبؤات مهمة لتوزيع النباتات والحيوانات ، خاصة في مواجهة تغير المناخ3،4. وهكذا، فإن البروتوكولات لقياس الحدود الحرارية بدقة هي أدوات مهمة لعلماء البيئة، وعلم وظائف الأعضاء، وعلماء الأحياء التطورية، وعلماء الأحياء المحافظة، من بين آخرين.
كما الحيوانات البرية الأكثر وفرة وتنوعا، وغالبا ما تستخدم الحشرات لقياس الحدود الحرارية. ويشيع استخدام الحد الأقصى الحراري الحرج (CTmax)وصغر حجم الحرارة الحرجة (CTmin)لتقييم الاختلاف داخل وفيما بين القطاعات في التسامح الحراري5،6،7. في حينيمكن قياس الحدالأقصى للأشعة المقطعية و المقطعية للنوعات الظاهرية متعددة، بما في ذلك النمو، والإخراج الإنجابي، والسلوك، يتم تطبيقها الأكثر شيوعاً على وظيفة الحركي5،6،7. وهكذا ، فإن الحد الأقصى للتصويرالمقطعي (يسمى أيضا الحرارة المنهزة) وMasctmin غالبا ما يتم تعريفه على أنه درجات الحرارة العالية والمنخفضة التي تفقد فيها الحشرات الوظيفة الحركية وغير قادرة على البقاء منتصبة5،6،7،8،9،10،11. CTmin يتزامن مع بداية الغيبوبة الباردة، وهو شلل عكسي الناجمة عن درجات الحرارة الباردة6. في حين أن الشلل عند الحدود الحرارية غالبا ما يكون عكسها، استمرار التعرض لهذه درجات الحرارة يؤدي إلى الموت الإيكولوجي5.
طرق مشتركة لقياس الحدود الحرارية وقد استخدمت مجموعة متنوعة من الأجهزة لقياس الحدود الحرارية (ملخصة في Sinclair et al.) 6.لفترة وجيزة، يتم تسخين الحشرات أو تبريدها في الحاضنات12،13، حاويات مغمورة في حمامات السوائل11،14،15،16، كتل الألومنيوم10،17، أو حاويات مغطاة18، ومراقبتها حتى تتوقف الحركة. لرصد الحشرات أثناء الفحص ، فإن الطريقة الأكثر شيوعًا هي المراقبة المباشرة ، حيث يتم مراقبة الأفراد بشكل مستمر في الوقت الفعلي أو بأثر رجعي مع الفيديو المسجل6،9،10،11،15،17. وفي حين أن أساليب المراقبة المباشرة لديها الحد الأدنى من متطلبات المعدات، إلا أنها تتطلب كثافة في العمالة والحد من الإنتاجية. بدلا من ذلك ، يمكن ملاحظة الحشرات بشكل غير مباشر عن طريق جمع الأفراد في أوقات منفصلة لأنها تقع من جثم6،19،20،21 أو استخدام رصد النشاط13.
11- إن الطرق غير المباشرة لقياس الحدود الحرارية هي عموماً أعلى إنتاجية وربما تكون أقل عرضة للخطأ من طرق المراقبة المباشرة. الأسلوب الأكثر شيوعاً للرصد غير المباشر يستخدم العمود سترة درجة الحرارة التي تسيطر عليها6،8،19،20،21. يتم وضع الحشرات داخل عمود مع الجثم ، ويتم التحكم في درجة حرارة الغرفة الداخلية عن طريق ضخ السوائل من حمام السوائل التي يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة من خلال البطانة المبسترة للعمود. الأفراد الذين يصلون إلى حد الحرارة يسقطون من جثمهم ويتم جمعهم في درجات حرارة منفصلة أو فترات زمنية. في حين أن هذه الطريقة تعمل بشكل جيد للتصويرالمقطعي دقيقة، فقد وجد غير مناسبللأشعة المقطعية ماكس، لأن الذباب يمشي طوعا من الجزء السفلي من العمود عندما تزيد درجة الحرارة. والطريقة الجديدة الموصوفة هنا تتحايل على هذه المسألة من خلال احتواء الذباب بشكل فردي أثناء القياسات الآلية.
وبالإضافة إلى طريقة المراقبة، يشيع استخدام نوعين من نظم الحرارة لتقييم الحدود الحرارية العليا. تتكون الأقوال الديناميكية من زيادة درجة الحرارة تدريجياً حتى يتم فقدان وظيفة المحرك. أن درجة الحرارة هي دينامية CTماكس7،8،9،13. في المقابل، تتكون المقايسات الثابتة من درجة حرارة مرهقة ثابتة حتى يتم فقدان الوظيفة الحركية. أن نقطة الوقت هي الحرارة ضربة قاضية الوقت (KDT الحرارة)، وتسمى أيضاماكس CT ثابت(sCT ماكس)في ورقة حديثة من قبل يورغنسن وآخرون7،,8،,9،,16،,22. على الرغم من أنCT ماكس والحرارة المقايسات الضربة القاضية (الحرارة KD المقايسات) تنتج المقاييس مع وحدات مختلفة، النمذجة الرياضية من الصفات اثنين يشير إلى أنها تعطي معلومات قابلة للمقارنة على التسامح الحرارة وكلاهما ذات الصلة بيئيا8،9. تؤدي المقايسات الديناميكية إلى درجة حرارة يمكن مقارنتها بالظروف البيئية ، وهي أفضل عندما تكون هناك اختلافات كبيرة في تحمل الحرارة ، مثل المقارنات بين الأنواع ذات المنافذ الحرارية المختلفة على نطاق واسع. ومع ذلك ، بسبب Q10 عالية لتراكم إصابات الحرارة ، قد يكون من الأفضل إجراء فحص ثابت للكشف عن أحجام التأثير الصغيرة ، مثل الاختلاف داخل معينة في تحمل الحرارة9. أيضا ، من الناحية العملية ، يتطلب الفحص الثابت معدات أقل تطورا من الفحص الديناميكي.
الهدف الهدف من هذه الورقة هو إضفاء الطابع الرسمي على أساليب المقايساتالمقطعية الدقيقة والحرارة KD التي يمكن استخدامها في البحوث المستقبلية لتقييم الحدود الحرارية للحشرات المتحركة. ويتم تكييف البروتوكولات من منهجيات سبق وضعها، وهي مصممة بحيث تكون عالية الإنتاجية، وآلية، وفعالة من حيث التكلفة. يمكن إتمام كل من الأقوال في فترة زمنية قصيرة (~2 ساعة)، مما يعني أنه يمكن إجراء تجارب متعددة في يوم واحد، مما ينتج كميات كبيرة من البيانات دون التضحية بالتكرار أو الدقة. مع هذا الإعداد، يمكن قياس تحمل الحرارة من 96 الذباب في وقت واحد، في حينأن العمود ل دقيقة CT يمكن أن تعقد أكثر من 100 الذباب، شريطة أن يكون هناك مساحة سطحية كافية لتجثم.
طريقة عالية الإنتاجية لمراقبة CTmin بتعديل منهجية العمود المبستر المشترك مع إضافة مستشعر الأشعة تحت الحمراء لحساب الذباب تلقائيًا. وقد اقترح شومان وآخرون استخدام جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء للعد لأول مرة في عام 199623 ولكن لم يتم اعتماده على نطاق واسع. إضافة جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء يسمح لتوليد البيانات المستمرة بدلا من جمع البيانات على فترات منفصلة. كما يقلل هذا البروتوكول من خطأ المجرب عن طريق التخلص من إدخال البيانات اليدوي والحاجة إلى تبديل أنابيب التجميع يدويًا أسفل العمود المُقَدَّد عند نقاط زمنية منفصلة.
يتم تعديل طريقة عالية الإنتاجية لتسجيل KDT الحرارة من دراستين سابقتين من التسامح الحراري في الحشرات10،12. يتم تخزين الذباب الفردي في لوحة 96 بئر في حاضنة درجة الحرارة يتم تسجيل الفيديو. يقلل هذا البروتوكول من تحيز المجرب في تحديد KDT الحرارة لأنه يمكن مراجعة التجارب والتحقق من ذلك عن طريق تشغيل التسجيل مرة أخرى. كما يوفر هذا البروتوكول مجموعة من البرامج النصية Python المخصصة التي يمكن استخدامها لتسريع تحليل الفيديو. استخدام الآبار الفردية يزيل التداخل الذي يمكن أن يحدث عندما يتحرك الأفراد الآخرين أو يسقطون ، والتي يمكن أن تكون مشكلة عندما يتم ملاحظة مجموعات من الأفراد في نفس الساحة10،17. وعلاوة على ذلك، فإن الحاضنة التي يتم التحكم فيها بدرجة حرارة توفر درجة حرارة مستقرة عبر جميع الآبار الـ 96، على عكس تدرج درجة الحرارة الذي لوحظ أحيانًا عبر كتلة ألمنيوم يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة10. لاحظ أيضاً أنه يمكن تكييف طريقة تسجيل 96 جيداً لقياسالحد الأقصى الديناميكي للتصوير المقطعي المحوسب ويحتمل أن يكون CTmin (انظر المناقشة).
لإثبات كل بروتوكول، تم مقارنة الحدود الحرارية للإناث الزميل Drosophila الكبار من خطوط مختارة من الفريق المرجعي الوراثي Drosophila melanogaster (DGRP)24. وقد تم اختيار هذه الخطوط لأن التجارب الأولية أشارت إلى اختلافات كبيرة في التسامح الحراري. وقد أثبتت هذه الأقوال أنها أساليب قوية للتمييز بين الاختلافات في التسامح الحراري. البروتوكولين التاليين ، عالية الإنتاجية CTmin المقايسة (القسم 1) وعالية الإنتاجية الحرارة KD مقايسة (القسم 2) ، ووصف الإجراءات اللازمة لإنتاج CTmin والحرارة KDT البيانات عن أي مرحلة حياة الحشرات motile قادرة على تركيب في الأجهزة ، مثل Drosophilaالكبار . للتصويرالمقطعي دقيقة من الضروري أيضا أن تكون الحشرة قادرة على جثم. هنا, كل مقايسة هو موضح في الكبار Drosophila melanogaster. ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات لـ "تصنيف" آخر أو مراحل الحياة6. قد تشمل التغييرات الطفيفة استخدام مواد جثم مع فتحات أكبر لاستيعاب عينات أكبر فيمقايسة دقيقة CT أو استخدام كاميرا ذات جودة أعلى لتمييز KDT خفية من حشرة بطيئة الحركة أو مرحلة الحياة في اختبار KD الحرارة. هذا البروتوكول لا يصف أساليب إعداد الذباب ، ولكن من المهم توحيد بروتوكولات تربية لضمان تكرار25 (انظر غارسيا وتيتس26 وتيتس وهان27). وتشمل البروتوكولات المقدمة معلومات عن كيفية بناء الأجهزة وإعدادها، وكيفية تسجيل القياسات، ووصف موجز لتحليل البيانات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps)</td>
			<td>Thermo Scientific; Waltham, MA</td>
			<td>153-5401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C922 Pro Stream Webcam</td>
			<td>Logitech; Newark, CA</td>
			<td>960-001087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular adjustable steel clamp &#8211; 5.08 cm to 7.62 cm</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear acrylic tubing &#8211; 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>44036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear acrylic tubing &#8211; 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>440515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear acrylic tubing &#8211; 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>44041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear silicone sealant</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tube (15 ml)</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Drill</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Funnel Monitor (DFM)</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td>DFM</td>
			<td>Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAM data collection software</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Records data input from the DFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Storage Lid</td>
			<td>FlySorter; Seatle, WA</td>
			<td>FS-96LID-5PK</td>
			<td>Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Storage Plate</td>
			<td>FlySorter; Seatle, WA</td>
			<td>FS-96PLATE-5PK</td>
			<td>Used to hold flies during in the sCTmax assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Tray</td>
			<td>FlySorter; Seatle, WA</td>
			<td>FS-TRAY-5PK</td>
			<td>Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass funnel</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>28950-75</td>
			<td>75mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gutter guard</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>~0.5 cm diameter openings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hacksaw</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heratherm Thermo Scientific incubator</td>
			<td>Thermo Scientific; Waltham, MA</td>
			<td>OMS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hose nylon adapters (2) &#8211; &#188; MNPT x 3/8</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>61135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun and glue</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnets</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software</td>
			<td>OMEGA; Norwalk, CT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMEGA thermocouple (Type T)</td>
			<td>OMEGA; Norwalk, CT</td>
			<td>5LRTC-TT-K-20-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic funnel</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>2&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubing - 0.6 cm diameter</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>62852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort ring</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>2&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort three-prong clamp</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial port connector (PSIU9)</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td>PSIU9</td>
			<td>Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam (2&#34; thick)</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uninterrupted Power Supply (PS9-1)</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td>PS9-1</td>
			<td>Power supply for the DFM and PSIU9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weld-on #4 Acrylic Cement</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>45737</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assays of critical thermal limits in insects

والحدود الحرارية العليا والدنيا للنباتات والحيوانات هي مؤشرات هامة لأدائها وبقائها وتوزيعاتها الجغرافية، وهي ضرورية للتنبؤ بالاستجابات لتغير المناخ. يصف هذا العمل بروتوكولين عاليي الإنتاجية لقياس الحدود الحرارية للحشرات: أحدهما لتقييم الحد الأدنى الحراري الحرج (CTmin)والآخر لتقييم الحرارة يهدم الوقت (KDT) استجابةً لجهد حراري ثابت. فيالمقايسة الدقيقة CT، يتم وضع الأفراد في عمود أكريليك سترة، تخضع لتراجع درجة الحرارة المنحدر، وتحسب لأنها تقع من قعقعتهم باستخدام جهاز استشعار الأشعة تحت الحمراء. في اختبار KDT الحرارة ، يتم احتواء الأفراد في لوحة 96 بئرًا ، توضع في حاضنة تم تعيينها إلى درجة حرارة ساخنة ومجهدة ، والفيديو المسجل لتحديد الوقت الذي لم يعد بإمكانهم البقاء فيه منتصبين والتحرك. توفر هذه البروتوكولات مزايا على التقنيات الشائعة الاستخدام. كل من المقايسات هي منخفضة التكلفة ويمكن أن تكتمل بسرعة نسبيا (~ 2 ح). المقايسة الدقيقة CT يقلل من خطأ المجرب ويمكن قياس عدد كبير من الأفراد في وقت واحد. يولد بروتوكول KDT الحرارة سجل فيديو لكل مقايسة وبالتالي يزيل التحيز المجرب والحاجة إلى مراقبة الأفراد باستمرار في الوقت الحقيقي.

تم قياس الحدود الحرارية(أي، دقيقة CT وKDT الحرارية) للإناث من الفريق المرجعي الوراثي Drosophila melanogaster (DGRP) لإثبات البيانات عالية الإنتاجية المتولدة من البروتوكولين الموصوفين. تم فحصالمقطع المقطعي باستخدام خطوط DGRP 714 (ن = 37) و913 (ن = 45). تم فحص KDT الحرارة ومقارنتها م?...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects at JoVE.com

High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects

الحدود الحرارية يمكن التنبؤ البيئات التي تتسامح مع الكائنات الحية، وهي معلومات قيمة في مواجهة التغير المناخي السريع. يتم وصفها هنا بروتوكولات عالية الإنتاجية لتقييم الحد الأدنى الحراري الحرج ووقت الضربة القاضية للحرارة في الحشرات. البروتوكولين تكبير الإنتاجية وتقليل تكلفة المقايسات.

عالية الإنتاجية المقايسة من الحدود الحرارية الحرجة في الحشرات

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are ...

والتسامح الحراري عنصر حاسم في توزيع الأنواع والاستجابات لتغير المناخ. هنا نقدم طرقا لتقييم الحرارة والتحمل البارد بسرعة في الحشرات الصغيرة. هذه الطرق لقياس التسامح الباردة، عن طريق الحد الأدنى الحراري الحرجة والتسامح الحرارة، عن طريق الحرارة طرقت أسفل الوقت هي الإنتاجية العالية، وشبه الآلي وتتطلب الحد الأدنى من المعدات.إثبات الإجراء سيكون ديفيد أود، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبري. لإعداد الحد الأدنى من الكاصير الحرارية الحرجة، والطاقة على درجة حرارة حوض السباحة السائل الضغط على زر التشغيل لتشغيل برنامج، ورفع والحفاظ على درجة حرارة الحمام إلى 25 درجة مئوية. انتظر من خمس إلى عشر دقائق للسماح لعمود الحمام السائل بالوصول إلى 25 درجة مئوية، قبل استبدال المكونات في أعلى العمود بمصفاة قطرها 5.08 سنتيمتر.اضغط على ما يقرب من 40 الذباب من قارورة الطعام الخاصة بهم في العمود من خلال القمع واستبدال القمع بسرعة مع المكونات، مع الحرص على عدم السماح لأي الذباب الهروب. إذن، اسمح للذباب أن يستقر التنصت في بعض الأحيان على المكونات السفلية لتشجيع الذباب على الصعود.بعد خمس دقائق، اضغط على زر البداية على كسب حمام السوائل، لبدء برنامج التهيّن الحراري الحرج. انقر لفتح برنامج تسجيل الزوجين الحرارية على الكمبيوتر وانقر فوق سجل لبدء تسجيل درجة الحرارة داخل العمود، كل ثانية لمدة المقايسة. تأكد من أن كل تسجيل درجة حرارة يتضمن الطابع الزمني الخاص بالثاني، بحيث يمكن دمج بيانات درجة الحرارة لاحقًا مع بيانات من شاشة قمع Drosophila.إضافة خمسة ملليلترات من 90٪ الإيثانول إلى أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 15 ملليلتر ووضع الأنبوب في رف تحت العمود. انقر أحيانًا على المكونات السفلية للعمود لإغراء أي ذباب في الأسفل لتسلقه. معظم الذباب سيكون على جثم أو بالقرب من أعلى العمود بنسبة 15 درجة مئوية.عند 15 درجة مئوية، ضع قمعًا زجاجيًا خارجيًا قطره 75 ملليمترًا في جهاز قياس قمع Drosophila. إزالة المكونات السفلية وجمع أي الذباب لا يزال على المكونات في الإيثانول. اضبط الحلقة المُعوَّرة، وشاشة القمع، والتّهم، بحيث تكون تحت العمود.تأكد من أن شفة القمع تختم أسفل العمود تمامًا وتُدخل أسفل القمع في أنبوب جمع 15 ملليلتر. افتح برنامج مراقبة قمع دروسوفيليا. سيبدأ البرنامج على الفور في تسجيل الوقت والتاريخ اللذين يصل فيهما الذباب إلى الحد الأدنى الحراري الحرج.الذباب الذي يصل إلى الحد الأدنى الحراري الحرج ، سيفقد وظيفته العصبية العضلية ويسقط من جثمه ، من خلال جهاز قمع Drosophila. لرصد ما إذا كان كل من الذباب قد وصلت إلى الحد الأدنى الحرارية الحرجة، كما تنخفض درجة الحرارة، والتحقق من المكونات العليا والجثم لمعرفة ما إذا كان أي الذباب لا تزال جاثمة. عندما جميع الذباب، وصلت إلى الحد الأدنى الحرارية الحرجة، ونقل رصد قمع Drosophila والقمع بعيدا عن فتح العمود.في مناسبات نادرة، قد يصل الذباب إلى الحد الأدنى الحراري الحرج، لكنه يبقى عالقًا في العمود. افتح المكونات العلوية لإزالة هذه الذبابات. لإعداد ارتفاع درجة الحرارة الإنتاجية هدمت أسفل فحص، واستخدام غطاء الطامح و الحاجز، لتحميل الذباب مخدّر ثاني أكسيد الكربون الفردية، في كل بئر من 96 تعديل جيدا لا لوحة أسفل وختم لوحة مع غطاء ضيق واضح المناسب.ثم ضع الطبق على إمدادات من الطعام واسمح للذباب بالتأقلم مع لوحة 96 بئرًا لمدة 48 ساعة على الأقل. في يوم الفحص ، قم بتعيين الحاضنة إلى 37.5 درجة مئوية ، بعد 30 دقيقة ضع لوحة ثقافة الذبابة في الحاضنة مع الجزء السفلي من اللوحة ضد الورقة البيضاء على الجزء السفلي من الدرج. لاحظ اتجاه أسماء العمود والصف على الدرج وفي إطار كاميرا الويب ووضع الشريط الملون على طول جوانب وحواف اللوحة للمساعدة في التحقق من الاتجاه.عندما اللوحة في موقف، إغلاق باب الحاضنة وانقر فوق سجل في برنامج تسجيل الفيديو. بعد ساعتين، تحقق من التسجيل لمعرفة ما إذا كان كل الذباب، قد وصلت إلى نقطة الراحة النهائية وتوقفت عن الحركة. عندما يتوقف كل الذباب عن الحركة، انقر فوق إيقاف والتخلص من الذباب.فتح ملف الفيديو وتسجيل الوقت ضربة قاضية من كل ذبابة في كل بئر. المقياس الأكثر اتساقا من الحرارة التي هدمت أسفل التوقف بين التجارب والملاحظات هو الوقت الذي تصل ذبابة بقعة الراحة النهائية. ثم تتبع الفيديو في الاتجاه المعاكس، مع التركيز على بئر واحد و مشيرا إلى الوقت الذي تتحرك فيه الذبابة لأول مرة قبالة بقعة الراحة النهائية.يمكن أن يكون من الصعب تحديد وقت الراحة النهائي لكل ذبابة. لضمان تحليل دقيق، من المهم أن تأخذ وقتك ومراقبة كل بئر بشكل فردي. في هذا التحليل التمثيلي، كان لدى الإناث من خط لوحة دروسفيلا المرجعية الوراثية، درجات حرارة أقل بكثير من متوسط الحد الأدنى الحراري من الإناث من خط DGRP 714.وبالإضافة إلى ذلك، فإن الحرارة هدمت الوقت في 37.5 درجة مئوية، تختلف اختلافا كبيرا بين الإناث من خطوط 73 و 461 DGRP. مع تعديلات طفيفة، يمكن استخدام هذه الطريقة لقياس الحرارة هدم الوقت، لقياس الصفات الأخرى التسامح الحراري، مثل فترة الانتعاش البرد غيبوبة أو الحد الأقصى الحراري الحرجة. ومن خلال الحد بشكل كبير من الوقت العملي للمحققين، سمحت هذه الطرق باستكشاف الاختلافات الجينية وسمات التسامح الحراري على نطاق لم يكن ممكناً من قبل.

Research

JoVE Journal

Biology

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

لا خيار للاختيار و- فحوصات لاختبار مقاومة للحشرات thaliana ألف مضغ

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

عالية الإنتاجية قياس وتصنيف ف العضوية في العينات البيئية

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

الإنتاجية العالية لرسم الخرائط المادية للالكروموسومات باستخدام الآلي<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

عالية الإنتاجية إبر دقيقة جدا لقنفذ البحر بيضات ملقحة

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

التعافي من اسماك الزرد الكبار قلوب للتطبيقات عالية الإنتاجية

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

عالية الإنتاجية<em&gt; دانيو Rerio</em&gt; طاقة الإنفاق الفحص

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...