Name: high-throughput assays of critical thermal limits in insects
Uploaded: 2020-06-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects at JoVE.com

אנו מודים לאלי מקייב על העזרה בהתענופת הזבובים. עבודה זו נתמכת על ידי משרד החקלאות הלאומי של ארצות הברית המכון הלאומי למזון וחקלאות הצוהר פרויקט מענק 1010996 והקרן הלאומית למדע להעניק OIA-1826689 כדי N.M.T.

1. תפוקה גבוההCT מינימום תוואי
<ol><li>הרכבת העמודה עם הז'קט (איור 1A, איור 2)<ol>
<li>חותכים את הצינורות האקריליים הרחבים ביותר (7 ס"מ על 6.35 ס"מ על 0.3 ס"מ) והצרים ביותר (5.7 ס"מ על 5.1 ס"מ על 0.3 ס"מ) לאריכות שוות (31.5 ס"מ) עםמסור (איור 2א'). ש?...

<ol>
	<li>Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+variation,+thermal+extremes+and+the+physiological+performance+of+individuals.">Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals.</a> Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).</li><li>Angilletta, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).</li><li>Coumou, D., Rahms Torf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+weather+extremes.">A decade of weather extremes.</a> Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).</li><li>Wang, G., Dillon, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+geographic+convergence+in+diurnal+and+annual+temperature+cycling+flattens+global+thermal+profiles.">Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles.</a> Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).</li><li>MacMillan, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+cause+from+consequence:+A+systematic+approach+to+thermal+limits.">Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits.</a> Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).</li><li>Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+invitation+to+measure+insect+cold+tolerance:+Methods,+approaches,+and+workflow.">An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow.</a> Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).</li><li>Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+thermal+maximum:+History+and+critique.">The critical thermal maximum: History and critique.</a> Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).</li><li>Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unifying+indices+of+heat+tolerance+in+ectotherms.">Unifying indices of heat tolerance in ectotherms.</a> Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).</li><li>J&#248;rgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+assess+Drosophila+heat+tolerance:+Unifying+static+and+dynamic+tolerance+assays+to+predict+heat+distribution+limits.">How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits.</a> Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).</li><li>Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+rapid+measurement+of+thermal+tolerance+traits+in+studies+of+small+insects.">A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects.</a> Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).</li><li>Andersen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+assess+Drosophila+cold+tolerance:+Chill+coma+temperature+and+lower+lethal+temperature+are+the+best+predictors+of+cold+distribution+limits.">How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits.</a> Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).</li><li>Hu, X. P., Appel, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+of+critical+thermal+limits+and+temperature+tolerance+in+Formosan+and+eastern+subterranean+termites+(Isoptera:+Rhinotermitidae).">Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae).</a> Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).</li><li>Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+for+tolerance+to+high+temperatures+in+a+population+of+Drosophila+melanogaster.">Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster.</a> Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).</li><li>Overgaard, J., Kristensen, T. N., S&#248;rensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validity+of+thermal+ramping+assays+used+to+assess+thermal+tolerance+in+arthropods.">Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods.</a> PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).</li><li>Klok, C. J., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+thermal+limits,+temperature+tolerance+and+water+balance+of+a+sub-Antarctic+kelp+fly,+Paractora+dreuxi+(Lepidoptera:+Tineidae).">Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae).</a> Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).</li><li>Salachan, P. V., Burgaud, H., S&#248;rensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+thermal+limits:+Non-linear+reaction+norms+drive+disparate+thermal+acclimation+responses+in+Drosophila+melanogaster.">Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).</li><li>Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+acclimation+temperature+on+thermal+activity+thresholds+in+polar+terrestrial+invertebrates.">The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).</li><li>MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+gut+in+insect+chilling+injury:+Cold-Induced+disruption+of+osmoregulation+in+the+fall+field+cricket,+Gryllus+pennsylvanicus.">The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).</li><li>Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+measurement+of+heat+or+cold+resistance+of+small+insects.">A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects.</a> British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).</li><li>Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+maternal+variation+for+heat+resistance+in+drosophila+from+the+field.">Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field.</a> Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).</li><li>Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+chill-coma+onset+and+recovery+at+the+extremes+of+the+thermal+window+of+Drosophila+melanogaster.">The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).</li><li>S&#248;rensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+the+heat+hardening+response+in+an+Arctic+insect.">Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect.</a> Biology Letters. 15 (10), (2019).</li><li>Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-based+electronic+fall-through+probe+insect+counter+for+monitoring+infestation+in+stored+products.">A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products.</a> Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).</li><li>MacKay, T. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel.">The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel.</a> Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).</li><li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).</li><li>Garcia, M. J., Teets, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+stress+results+in+sustained+locomotor+and+behavioral+deficits+in+Drosophila+melanogaster.">Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).</li><li>Teets, N. M., Hahn, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+the+shape+of+cold-survival+curves+in+a+single+fly+population+suggests+potential+for+selection+from+climate+variability.">Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability.</a> Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).</li><li>Kelty, J. D., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+rapid+cold+hardening+by+cooling+at+ecologically+relevant+rates+in+Drosophila+melanogaster.">Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).</li><li>MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+insect+chill-coma.">Mechanisms underlying insect chill-coma.</a> Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).</li><li>Salachan, P. V., S&#248;rensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+thermal+limits+affected+differently+by+developmental+and+adult+thermal+fluctuations.">Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).</li><li>Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+robust+sex-specific+trade-off+between+cold+resistance+and+starvation+resistance+in+Drosophila+melanogaster.">Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).</li><li>Kelty, J. D., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cold-hardening+of+Drosophila+melanogaster+(Diptera:+Drosophilidae)+during+ecologically+based+thermoperiodic+cycles.">Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles.</a> Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).</li><li>Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insects+at+low+temperatures:+An+ecological+perspective.">Insects at low temperatures: An ecological perspective.</a> Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).</li></ol>

שתי השיטות המפורטות לעיל יוצרות נתונים בעלי תפוקה גבוהה של מדדים רלוונטיים למען איכות המידע עבור מגבלות תרמיות גבוהות ונמונות. פרוטוקולים אלה מתבססים על מתודולוגיות שנקבעו בעבר המשותפות למחקר על מגבלות תרמיות של חרקים (המסוכמות בסינקלייר ואח'). 6. שני הפרוטוקולים ניתן להשל...

גבולות תרמיים של חרקים שינויים בתנאים סביבתיים, כולל טמפרטורה, הוא גורם מרכזי המשפיע על הביצועים, כושר, הישרדות, והפצה גיאוגרפית שלאורגניזמים 1,,2. מגבלות תרמיות עליונות ונמיכות קובעות את הטווח התיאורטי של סביבות אורגניזם יכול לסבול, ולכן, מגבלות אלה הן מנבאים חשובים של התפלגות צמחים ובעלי חיים, במיוחד לנוכחשינוי האקלים 3,4. לפיכך, פרוטוקולים למדי מידה מדויקת של מגבלות תרמיות הם כלים חשובים עבור אקולוגים, פיזיולוגים, ביולוגים אבולוציוניים וביולוגים לשימור, בין היתר.
כחיות הארציות השופעות והמגוונות ביותר, חרקים משמשים לעתים קרובות למדידות של גבולות תרמיים. מקסימום תרמי קריטי (CTמקסימום)ומינימה תרמית קריטית (CTmin)משמשים בדרך כלל להערכת וריאציה פנים-ו- interspecificבסובלנות תרמית 5,6,7. בעוד CTמקסימום ו CTדקות ניתן למדוד עבור פנוטיפים מרובים, כולל צמיחה, תפוקת הרבייה, והתנהגות, הם מוחלים בדרך כלל על פונקציית locomotor5,6,7. לפיכך, CTמקסימום (המכונה גם טמפרטורת נוקאאוט חום) ו CTדקות מוגדרים לעתים קרובות כטמפרטורות גבוהות ונמוכות שבו חרקים מאבדים את התפקוד המוטורי ואינם מסוגלים להישארזקוף 5,6,7,8,9,10,11. CTדקות עולה בקנה אחד עם תחילתה של תרדמת צינה, שיתוק הפיך הביא על ידי טמפרטורות קרות6. בעוד שיתוק בגבולות התרמיים הוא לעתים קרובות הפיך, חשיפה מתמשכת לטמפרטורות אלה מובילה למוות אקולוגי5.
שיטות נפוצות למדידת מגבלות תרמיות מגוון של ציוד שימשו כדי למדוד מגבלות תרמיות (מסוכם סינקלייר ואח '. 6. בקצרה, חרקים מחוממים או מקורריםבאינקובטורים 12,13,מכולות שקועות באמבטיותנוזלים 11,14,15,16,בלוקיאלומיניום 10,,17,או מכולותז'קט 18, ומעקב עד שהקטר מפסיק. כדי לפקח על חרקים במהלך ההתאסה, השיטה הנפוצה ביותר היא התבוננות ישירה, שבה אנשים מנוטרים ברציפות בזמן אמת או בדיעבד עםוידאו מוקלט 6,9,10,11,15,17. בעוד שיטות תצפית ישירה יש דרישות ציוד מינימליות, הם עבודה אינטנסיבית ולהגביל את התפוקה. לחלופין, ניתן לצפות בחרקים בעקיפין על ידי איסוף אנשים בזמנים דיסקרטייםכאשר הם נופלים מספנות 6,19,20,21 או באמצעות צגי פעילות13.
שיטות עקיפות למדידת מגבלות תרמיות הן בדרך כלל תפוקה גבוהה יותר ועלולות להיות פחות מועדות לטעויות מאשר שיטות תצפית ישירה. השיטה הנפוצה ביותר לניטור עקיף משתמשת בעמודה מבוקרת טמפרטורהעם ז'קטים 6,,8,,19,,20,,21. חרקים ממוקמים בתוך עמוד עם צבים, והטמפרטורה של התא הפנימי נשלטת על ידי שאיבת נוזלים מאמבט נוזלי מבוקר טמפרטורה דרך הבטנה הז'קט של הטור. אנשים שמגיעים לגבול התרמי שלהם נופלים מהמקום שלהם ונאספים בטמפרטורות דיסקרטיות או במרווחי זמן. בעוד שיטה זו פועלת היטב עבור CTדקות, זה נמצא לא מתאים CTמקסימום, כי זבובים מרצון לצאת מתחתית העמודה כאשר הטמפרטורה עולה. השיטה החדשה המתוארת כאן עוקפת בעיה זו על ידי כך שהיא מכילה זבובים באופן אישי במהלך מדידות אוטומטיות.
בנוסף לשיטת התצפית, שני סוגים של משטרי טמפרטורה משמשים בדרך כלל כדי להעריך את הגבולות התרמיים העליונים. ההתייענות הדינמית מורכבת מהגברת הטמפרטורה בהדרגה עד שהתפקוד המוטורי אובד; טמפרטורה זו היא CT דינמימקסימום7,8,9,13. לעומת זאת, ההתייחדות הסטטית מורכבת מטמפרטורה מלחיצה מתמדת עד לאיבוד התפקוד המוטורי; נקודת זמן זו היא זמן הנוקאאוט של החום (חום KDT), המכונה גםמקסימום CT סטטי (sCTmax)בניירשפורסם לאחרונהעל ידי יורגנסן ואח'7,8,9,,16,22. למרות CTמקסימום וחום נוקאאוט (חום KD assays) לייצר מדדים עם יחידות שונות, מידול מתמטי של שתי התכונות מציין שהם נותנים מידע דומה על עמידות חום ושניהםרלוונטיים מבחינה אקולוגית 8,9. בדיקות דינמיות מניבות טמפרטורה שניתן להשוות לתנאים סביבתיים, והן עדיפות כאשר יש הבדלים גדולים בסובלנות לחום, כגון השוואות בין מינים עם גומחות תרמיות שונות באופן נרחב. עם זאת, בשל Q10 גבוה להצטברות פציעות חום, שקע סטטי עשוי להיות עדיף לזיהוי גדלי אפקט קטן, כגון וריאציה תוך ספציפית בסובלנותחום 9. כמו כן, מבחינה מעשית, אסיי סטטי דורש ציוד פחות מתוחכם מאשר אסיי דינמי.
המטרה מטרת נייר זה היא להפוך שיטות לפורמלית עבור CTדקות וחום KD assays שניתן להשתמש במחקר עתידי כדי להעריך את הגבולות התרמיים של חרקים מוטיב. הפרוטוקולים מותאמים ממתודולוגיות שנקבעו בעבר ומתועדים להיות בעלי תפוקה גבוהה, אוטומטית וחסכונית. ניתן להשלים את שני ההתאסות תוך זמן קצר (~ 2 שעות), מה שאומר שניתן לערוך ניסויים מרובים ביום אחד, ולייצר כמויות גדולות של נתונים מבלי להקריב יכולת חזרה או דיוק. עם התקנה זו, ניתן למדוד בו-זמנית את עמידות החום של 96 זבובים, בעוד שהטור עבור CTmin יכול להכיל יותר מ-100 זבובים, בתנאי שיש שטח פנים מתאים לתפס.
שיטת התפוקה הגבוהה להתבוננות ב- CTmin משנה את מתודולוגיית העמודות הנפוצה עם תוספת של חיישן אינפרא אדום לספירת זבובים באופן אוטומטי. השימוש בחיישן אינפרא אדום לספירה הוצע לראשונה על ידי שומן ואח' בשנת 199623, אך לא אומץ באופן נרחב. התוספת של חיישן האינפרא-אדום מאפשרת יצירת נתונים רציפים במקום לאסוף נתונים במרווחי זמן שונים. פרוטוקול זה גם ממזער את שגיאת הניסוי על-ידי ביטול הזנת נתונים ידנית והצורך להחליף צינורות איסוף באופן ידני מתחת לעמודה הנספסת בנקודות זמן שונות.
שיטת התפוקה הגבוהה לתיעוד חום KDT משתנה משני מחקרים קודמים של עמידותלחום בחרקים 10,12. זבובים בודדים מאוחסנים בצלחת 96 באר באינקובטור מבוקר טמפרטורה ווידאו מוקלט. פרוטוקול זה ממזער הטיית ניסויים בקביעת KDT חום מכיוון שניתן לסקור ולאמת ניסויים על-ידי השמעת ההקלטה. פרוטוקול זה מספק גם קבוצה של קבצי Script מותאמים אישית של פיתון שניתן להשתמש בהם כדי להאיץ את ניתוח הווידאו. השימוש בארות בודדות מבטל הפרעות שעלולות להתרחש כאשר אנשים אחרים לנוע או ליפול, אשר יכול להיות בעיה כאשר קבוצות שלאנשים נצפו באותה זירה 10,17. יתר על כן, האינקובטור מבוקר טמפרטורה מספק טמפרטורה יציבה על פני כל 96 הבאות, בניגוד לטמפרטורה הדרגתית שנצפתה לעתים על פני בלוק אלומיניום מבוקרטמפרטורה 10. כמו כן, שים לב כי שיטת הקלטה 96 גם ניתן להתאים למדוד CTדינמי מקסימום ופוטנציאל CTדקות (ראה דיון).
כדי להדגים כל פרוטוקול, הגבולות התרמיים של נקבות מלנוגסטר דרוזופילה בוגרות מן השורות הנבחרות של לוח הייחוס הגנטי Melanogaster Drosophila (DGRP)הושוו 24. קווים אלה נבחרו מכיוון שניסויים ראשוניים הצביעו על הבדלים משמעותיים בסובלנות תרמית. אלה הוכחו כשיטות חזקות להפלות הבדלים בסובלנות תרמית. שני הפרוטוקולים הבאים, תפוקה גבוהה CTמינימום assay (סעיף 1) ו חום תפוקה גבוהה KD assay (סעיף 2), לתאר את הפעולות הדרושות כדי לייצר CTדקות וחום נתוני KDT עבור כל שלב חיי חרקים מוטיב מסוגל להתאים את האביזרים, כגון דרוסופילה למבוגרים. עבור CTדקות זה גם חיוני כי החרק להיות מסוגל לעמוד. כאן, כל תסה מדגים במלנוגסטר דרוזופילה למבוגרים. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בשינויים עבור מסה אחרים או שלביםחיים 6. שינויים קלים עשויים לכלול שימוש בחומר חריץ עם פתחים גדולים יותר כדי להכיל דגימות גדולות יותר ב- CTמינימום assay או שימוש במצלמה באיכות גבוהה יותר כדי להבחין KDT עדין של חרק נע לאט או שלב החיים בהאשה KD חום. פרוטוקול זה אינו מתאר שיטות להכנת זבובים, אך חשוב לתקנן פרוטוקולי גידול כדי להבטיחיכולת חזרה 25 (ראה גרסיה ו-Teets26 ו-Teets ו-Hahn27). הפרוטוקולים שסופקו כוללים מידע על אופן הבנייה וההגדרה של ההתאגנות, כיצד להקליט מדידות ותיאור קצר של ניתוח נתונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps)</td>
			<td>Thermo Scientific; Waltham, MA</td>
			<td>153-5401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C922 Pro Stream Webcam</td>
			<td>Logitech; Newark, CA</td>
			<td>960-001087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular adjustable steel clamp &#8211; 5.08 cm to 7.62 cm</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear acrylic tubing &#8211; 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>44036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear acrylic tubing &#8211; 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>440515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear acrylic tubing &#8211; 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>44041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear silicone sealant</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tube (15 ml)</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Drill</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Funnel Monitor (DFM)</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td>DFM</td>
			<td>Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAM data collection software</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Records data input from the DFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Storage Lid</td>
			<td>FlySorter; Seatle, WA</td>
			<td>FS-96LID-5PK</td>
			<td>Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Storage Plate</td>
			<td>FlySorter; Seatle, WA</td>
			<td>FS-96PLATE-5PK</td>
			<td>Used to hold flies during in the sCTmax assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Tray</td>
			<td>FlySorter; Seatle, WA</td>
			<td>FS-TRAY-5PK</td>
			<td>Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass funnel</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>28950-75</td>
			<td>75mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gutter guard</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>~0.5 cm diameter openings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hacksaw</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heratherm Thermo Scientific incubator</td>
			<td>Thermo Scientific; Waltham, MA</td>
			<td>OMS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hose nylon adapters (2) &#8211; &#188; MNPT x 3/8</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>61135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun and glue</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnets</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software</td>
			<td>OMEGA; Norwalk, CT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMEGA thermocouple (Type T)</td>
			<td>OMEGA; Norwalk, CT</td>
			<td>5LRTC-TT-K-20-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic funnel</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>2&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubing - 0.6 cm diameter</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>62852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort ring</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>2&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort three-prong clamp</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial port connector (PSIU9)</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td>PSIU9</td>
			<td>Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam (2&#34; thick)</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uninterrupted Power Supply (PS9-1)</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td>PS9-1</td>
			<td>Power supply for the DFM and PSIU9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weld-on #4 Acrylic Cement</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>45737</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assays of critical thermal limits in insects

גבולות תרמיים עלונים ונמונים של צמחים ובעלי חיים הם מנבאים חשובים של הביצועים שלהם, הישרדותם והתפלגויות גיאוגרפיות, והם חיוניים לחיזוי תגובות לשינויי האקלים. עבודה זו מתארת שני פרוטוקולים בתפוקה גבוהה למדידת מגבלות תרמיות של חרקים: האחד להערכת מינימה תרמית קריטית (CTmin), והשני להערכת זמן ההשבתה של חום (KDT) בתגובה לגורם לחץ חום סטטי. ב- CTמינימום assay, אנשים ממוקמים בעמודה אקריליק ז'קט, נתון לרמפת טמפרטורה יורדת, ונספר כפי שהם נופלים מהסחזים שלהם באמצעות חיישן אינפרא אדום. בחום KDT assay, אנשים כלולים צלחת 96 גם, ממוקם באינקובטור להגדיר למלחיץ, טמפרטורה חמה, וידאו הוקלט כדי לקבוע את הזמן שבו הם כבר לא יכולים להישאר זקוף ולזוז. פרוטוקולים אלה מציעים יתרונות על פני טכניקות נפוצות. שני המקרים הם בעלות נמוכה ותוקף להשלים במהירות יחסית (~ 2 שעות). ה-CTמינימום assay מפחית שגיאת experimenter והוא יכול למדוד מספר גדול של אנשים בו זמנית. פרוטוקול KDT חום יוצר תיעוד וידאו של כל תס"א ובכך מסיר הטיה experimenter ואת הצורך לפקח ברציפות על אנשים בזמן אמת.

המגבלות התרמיות (כלומר, CTmin וחום KDT) של נקבות מפאנל ההתייחסות הגנטית של דרוזופילה מלנוגסטר (DGRP) נמדדו כדי להדגים את נתוני התפוקה הגבוהה שנוצרו משני הפרוטוקולים המתוארים. CTmin היה assayed באמצעות קווי DGRP 714 (n = 37) ו 913 (n = 45). חום KDT היה eded בהשוואה קווי DGRP 189 (n = 42) ו 461 (n =...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects at JoVE.com

High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects

מגבלות תרמיות יכולות לחזות את סביבות אורגניזמים לסבול, שהוא מידע בעל ערך לנוכח שינוי האקלים המהיר. מתואר כאן פרוטוקולים בתפוקה גבוהה כדי להעריך מינימה תרמית קריטית וזמן נוקאאוט חום בחרקים. שני הפרוטוקולים ממקסמים את התפוקה וממזערים את עלות ההתייענות.

תפוקה גבוהה של מגבלות תרמיות קריטיות בחרקים

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are ...

סובלנות תרמית היא מרכיב קריטי בהפצות מינים ותגובות לשינויי האקלים. כאן אנו מספקים שיטות להערכת חום וסובלנות קרה במהירות בחרקים קטנים. שיטות אלה למדידת עמידות לקור, באמצעות המינימום התרמי הקריטי וסובלנות לחום, באמצעות חום המופל זמן הם תפוקה גבוהה, חצי אוטומטיים ודורשים ציוד מינימלי.הדגמת ההליך יהיה דוד Awde, פוסטדוק מהמעבדה שלי. כדי להקים תצהירה מינימלית תרמית קריטית, כוח על אמבטיית נוזלים מבוקרת טמפרטורה ולחץ על כפתור ההפעלה כדי להפעיל תוכנית, העלאת ושמירה על הטמפרטורה של האמבטיה ל 25 מעלות צלזיוס. המתן חמש עד עשר דקות כדי לאפשר לעמוד האמבטיה הנוזלי להגיע ל-25 מעלות צלזיוס, לפני החלפת התקע בחלק העליון של העמוד במסנן בקוטר 5.08 ס"מ.הקש על כ 40 זבובים מבקבוקון המזון שלהם לתוך העמוד דרך המשפך במהירות להחליף את המשפך עם התקע, דואג לא לתת לכל זבובים לברוח. אז תן לזבובים להתיישב. מדי פעם הקשה על התקע התחתון כדי לעודד את הזבובים לטפס.לאחר חמש דקות, לחץ על כפתור ההתחלה על הרווח אמבטיה נוזל, כדי להתחיל את תוכנית הרמפה מיני תרמית קריטית. לחץ כדי לפתוח את תוכנת ההקלטה הזוגית התרמית במחשב ולחץ על הקלט כדי להתחיל להקליט את הטמפרטורה בתוך העמודה, כל שנייה למשך ההתלהמה. ודא שכל הקלטת טמפרטורה כוללת את חותמת הזמן הספציפית לשניה, כך שניתן יהיה למזג נתוני טמפרטורה מאוחר יותר עם נתונים מהצג משפך דרוסופילה.הוסיפו חמישה מיליליטר של 90% אתנול לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר והניחו את הצינור במתלה מתחת לעמוד. מדי פעם הקש על התקע התחתון של העמוד כדי לפתות את כל הזבובים בתחתית לטפס. רוב הזבובים יהיו על עמוד או ליד החלק העליון של הטור על ידי 15 מעלות צלזיוס.ב 15 מעלות צלזיוס, מניחים משפך זכוכית בקוטר חיצוני 75 מילימטר לתוך צג משפך Drosophila. הסר את התקע התחתון ולאסוף את כל הזבובים עדיין על התקע באתנול. כוונן את טבעת ההתרעה, צג המשפך והמשפך, כך שהם יהיה מתחת לעמודה.ודא כי השפה של המשפך לאטום לחלוטין את החלק התחתון של העמודה ולהכניס את החלק התחתון של המשפך לתוך צינור אוסף 15 מיליליטר. פתח את תוכנת צג משפך דרוסופילה. התוכנה תתחיל מיד להקליט את השעה והתאריך שבהם הזבובים מגיעים למינימה התרמית הקריטית שלהם.זבובים מגיעים למינימה התרמית הקריטית שלהם, יאבדו את התפקוד הנוירומוסקולרי שלהם ויפלו מהמושכים שלהם, דרך צג משפך דרוסופילה. כדי לעקוב אם כל הזבובים הגיעו למינימה התרמית הקריטית שלהם, ככל שהטמפרטורה יורדת, בדוק את התקע העליון ואת התקע כדי לראות אם זבובים כלשהם עדיין יושבים. כאשר כל הזבובים, הגיעו למינימה התרמית הקריטית שלהם, הזז את צג משפך דרוסופילה והתרחק מפתיחת העמוד.במקרים נדירים, זבובים עשויים להגיע למינימה התרמית הקריטית שלהם, אך נשארים תקועים בעמודה. פתח את התקע העליון כדי להסיר זבובים אלה. כדי להקים חום תפוקה גבוהה הפיל את ההקפאה, להשתמש שאפתן ומכסה מחיצה, כדי לטעון זבובים בודדים פחמן דו חמצני הרגעה, לתוך כל באר שונה 96 אין צלחת תחתונה ולאטום את הצלחת עם מכסה ברור הדוק הולם.לאחר מכן מניחים את הצלחת על אספקת מזון ולאפשר את הזבובים להתאקלם 96 צלחת גם לפחות 48 שעות. ביום ההקפאה, להגדיר את החממה ל 37.5 מעלות צלזיוס, לאחר 30 דקות מניחים את צלחת תרבות זבוב לתוך החממה עם החלק התחתון של הצלחת על הנייר הלבן על החלק התחתון של המגש. שים לב לכיוון של שמות הטורים וה השורות היטב על המגש ובמסגרת מצלמת האינטרנט והצב סרט צבעוני לאורך הצדדים והקצוות של הלוח כדי לסייע באימות הכיוון.כאשר הצלחת נמצאת בעמדה, סגור את דלת החממה ולחץ על הקלט בתוכנת הקלטת הווידאו. לאחר שעתיים, בדוק את ההקלטה כדי לראות אם כל הזבובים, הגיעו למקום מנוחתם האחרון והפסיקו לזוז. כאשר כל הזבובים הפסיקו לזוז, לחץ על עצור והשליך את הזבובים.פתח את קובץ הווידאו והקלטת את זמן ההפלה של כל טיסה בכל באר. המדד העקבי ביותר של החום שהפיל את זמן ההשבתה בין הניסויים לתצפיות הוא הזמן שבו זבוב מגיע למקום מנוחתו הסופי. לאחר מכן לעקוב אחר הווידאו במהופך, התמקדות באר אחת ונוהגים את הזמן שבו לטוס הראשון נע את נקודת המנוחה הסופית שלה.קביעת זמן המנוחה הסופי של כל זבוב יכולה להיות קשה. כדי להבטיח ניתוח מדויק, חשוב לקחת את הזמן שלך ולהתבונן כל טוב בנפרד. בניתוח מייצג זה, נקבות מ קו פאנל התייחסות גנטי Drosophila, היה נמוך באופן משמעותי ממוצע טמפרטורות מינימה תרמית מאשר נקבות מ קו DGRP 714.בנוסף, החום הפיל את הזמן ב 37.5 מעלות צלזיוס, שונה באופן משמעותי בין הנקבות מ 73 ו 461 קווי DGRP. עם שינויים קלים, שיטה זו למדידת החום הפיל את הזמן, יכול לשמש כדי למדוד תכונות אחרות סובלנות תרמית, כגון זמן התאוששות תרדמת צונן או מקסימום תרמי קריטי. על ידי צמצום משמעותי של זמן הידיים לחוקרים, שיטות אלה אפשרו חקר של וריאציה גנטית תכונות סובלנות תרמית בקנה מידה שלא היה אפשרי בעבר.

Research

JoVE Journal

Biology

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

בחירה אין ברירה מבחני לבחינות ההתנגדות של thaliana א &#39;חרקים לעיסת

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

תפוקה גבוהה מדידה סיווג P אורגני דגימות סביבתיות

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...