Name: high-throughput assays of critical thermal limits in insects
Uploaded: 2020-06-15T14:00:00
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エリー・マッケイブのフライ飼育に対する支援に感謝します。この研究は、米国農務省食品農業ハッチプロジェクト助成金1010996と国立科学財団がOIA-1826689をN.M.T.に付与することによって支援されています。

1. ハイスループットCT分 アッセイ
<ol><li>ジャケット付きカラムを組み立てる(図1A、図2)<ol>
<li>最も広い(7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm)と最も狭い(5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm)のアクリルチューブをハックソーで等しい長さ(31.5 cm)に切ります(図2A)。これらの2つのチューブは、ジャケット柱の外側と最も内側の壁に?...

<ol>
	<li>Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+variation,+thermal+extremes+and+the+physiological+performance+of+individuals.">Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals.</a> Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).</li><li>Angilletta, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).</li><li>Coumou, D., Rahms Torf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+weather+extremes.">A decade of weather extremes.</a> Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).</li><li>Wang, G., Dillon, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+geographic+convergence+in+diurnal+and+annual+temperature+cycling+flattens+global+thermal+profiles.">Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles.</a> Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).</li><li>MacMillan, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+cause+from+consequence:+A+systematic+approach+to+thermal+limits.">Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits.</a> Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).</li><li>Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+invitation+to+measure+insect+cold+tolerance:+Methods,+approaches,+and+workflow.">An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow.</a> Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).</li><li>Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+thermal+maximum:+History+and+critique.">The critical thermal maximum: History and critique.</a> Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).</li><li>Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unifying+indices+of+heat+tolerance+in+ectotherms.">Unifying indices of heat tolerance in ectotherms.</a> Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).</li><li>J&#248;rgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+assess+Drosophila+heat+tolerance:+Unifying+static+and+dynamic+tolerance+assays+to+predict+heat+distribution+limits.">How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits.</a> Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).</li><li>Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+rapid+measurement+of+thermal+tolerance+traits+in+studies+of+small+insects.">A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects.</a> Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).</li><li>Andersen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+assess+Drosophila+cold+tolerance:+Chill+coma+temperature+and+lower+lethal+temperature+are+the+best+predictors+of+cold+distribution+limits.">How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits.</a> Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).</li><li>Hu, X. P., Appel, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+of+critical+thermal+limits+and+temperature+tolerance+in+Formosan+and+eastern+subterranean+termites+(Isoptera:+Rhinotermitidae).">Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae).</a> Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).</li><li>Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+for+tolerance+to+high+temperatures+in+a+population+of+Drosophila+melanogaster.">Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster.</a> Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).</li><li>Overgaard, J., Kristensen, T. N., S&#248;rensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validity+of+thermal+ramping+assays+used+to+assess+thermal+tolerance+in+arthropods.">Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods.</a> PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).</li><li>Klok, C. J., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+thermal+limits,+temperature+tolerance+and+water+balance+of+a+sub-Antarctic+kelp+fly,+Paractora+dreuxi+(Lepidoptera:+Tineidae).">Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae).</a> Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).</li><li>Salachan, P. V., Burgaud, H., S&#248;rensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+thermal+limits:+Non-linear+reaction+norms+drive+disparate+thermal+acclimation+responses+in+Drosophila+melanogaster.">Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).</li><li>Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+acclimation+temperature+on+thermal+activity+thresholds+in+polar+terrestrial+invertebrates.">The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).</li><li>MacMillan, H. A., Sinclair, B. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+maternal+variation+for+heat+resistance+in+drosophila+from+the+field.">Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field.</a> Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).</li><li>Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+chill-coma+onset+and+recovery+at+the+extremes+of+the+thermal+window+of+Drosophila+melanogaster.">The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).</li><li>S&#248;rensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+the+heat+hardening+response+in+an+Arctic+insect.">Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect.</a> Biology Letters. 15 (10), (2019).</li><li>Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-based+electronic+fall-through+probe+insect+counter+for+monitoring+infestation+in+stored+products.">A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products.</a> Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).</li><li>MacKay, T. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel.">The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel.</a> Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).</li><li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).</li><li>Garcia, M. J., Teets, N. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+rapid+cold+hardening+by+cooling+at+ecologically+relevant+rates+in+Drosophila+melanogaster.">Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).</li><li>MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+insect+chill-coma.">Mechanisms underlying insect chill-coma.</a> Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).</li><li>Salachan, P. V., S&#248;rensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+thermal+limits+affected+differently+by+developmental+and+adult+thermal+fluctuations.">Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).</li><li>Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+robust+sex-specific+trade-off+between+cold+resistance+and+starvation+resistance+in+Drosophila+melanogaster.">Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).</li><li>Kelty, J. D., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cold-hardening+of+Drosophila+melanogaster+(Diptera:+Drosophilidae)+during+ecologically+based+thermoperiodic+cycles.">Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles.</a> Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).</li><li>Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insects+at+low+temperatures:+An+ecological+perspective.">Insects at low temperatures: An ecological perspective.</a> Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).</li></ol>

上記の2つの方法は、温度制限の上限と下限に関する生態学的に関連する指標のハイスループットデータを生成します。これらのプロトコルは、昆虫の熱限界に関する研究に共通する以前に確立された方法論に基づいて構築される(Sinclairらにまとめた)。6.両方のプロトコルは、短時間(〜2時間)で完了し、大きなサンプルサイズのデータセットを生成し、再現性や精度を犠?...

昆虫の熱制限 温度を含む環境条件の変動は、生物の性能、フィットネス、生存、および地理的分布に影響を与える主要な要因である 1,,2。上下の熱限界は、生物が許容できる環境の理論的範囲を決定し、したがって、これらの限界は、特に気候変動33、44に直面して、植物および動物の分布の重要な予測値である。したがって、熱限界を正確に測定するためのプロトコルは、生態学者、生理学者、進化生物学者、および保全生物学者にとって重要なツールです。
最も豊富で多様な陸上動物として、昆虫は熱限界の測定に頻繁に使用されます。臨界熱最大(CTmax)および臨界熱小量体(CTmin)は、熱,公差5、6、76における内比および間比比変動を評価するために一般的に使用される。5CTmaxおよびCT最小は、成長、生殖出力、および挙動を含む複数の現象タイプについて測定することができるが、それらは最も一般的に、locomotor関数55、6、76,7に適用される。,7,8,9,10,11したがって、CTmax(ヒートノックダウン温度とも呼ばれる)とCT最小は、しばしば、昆虫が運動機能を失い、6直立状態を保つことができない高温と低温と定義される。CT分は寒冷昏睡の発症と一致し、寒い温度6によってもたらされる可逆性麻痺である。熱限界での麻痺はしばしば可逆的であるが、これらの温度への継続的な暴露は生態学的死に至る5.
熱制限の測定方法の一般的な方法 様々な装置が熱制限を測定するために使用されてきた(Sinclairらで要約されている)。6.簡単に言えば、昆虫は、インキュベーター12、13、液体浴に沈められた容器,1311、14、15、16、アルミニウム1614,15ブロック,1110、17、またはジャケット付き容器18で加熱または冷却され、移動が停止するまで監視される。10,17アッセイ中の昆虫を監視するために、最も一般的な方法は、個人が記録された,ビデオ6、9、10、11、15、179,10,でリアルタイムまたは遡及的に連続的に監視される直接観察15である17。611直接観察方法は、最小限の機器要件を持っていますが、それらは労働集約的であり、スループットを制限します。あるいは、昆虫は、止まり木6、19、20、2119,20から落ちる離6散時に個体を収集することによって間接的に観察することができるか、21または活動モニター13を使用する。
熱制限を測定する間接的な方法は、一般的に、直接観察方法よりも高いスループットと潜在的にエラーが発生しにくい方法です。間接監視の最も一般的な方法では、ジャケット温度制御カラム686、8、19、20、2119,20,21を使用します。,昆虫は止まり木のある柱の中に置かれ、内室の温度はカラムのジャケット付きの裏地を通って温度制御された流体浴から流体をポンピングすることによって制御される。熱限界に達した個人は止まり木から落ち、離散的な温度または時間間隔で収集されます。この方法はCTminに適していますが、温度が上昇するとハエが自発的にカラムの底から出て行くので、CTmaxには適していません。ここで説明する新しい方法は、自動測定中にハエを個別に含めることによって、この問題を回避します。
観測方法に加えて、2種類の温度レジームが一般的に、温度制限の上限を評価するために使用されます。動的アッセイは、モータ機能が失われるまで徐々に温度を上昇させることから成ります。温度は動的CTの最高77、8、9、138,9,13である。これに対して、静的アッセイは、モータ機能が失われるまで一定のストレス温度で構成されています。その時点は熱ノックダウン時間(熱KDT)であり、ヨルゲンセンら,,,77、8、9、16、22による最近の論文では静的CTマックス(sCTmax)とも呼ばれる。,891622CTの最大および熱ノックダウンアッセイ(熱KDアッセイ)は、異なる単位を持つメトリックを生成するが、2つの形質の数学的モデルは、それらが熱耐性に関する同等の情報を与え、両方とも生態学的に関連する8、99であることを示す。8動的アッセイは、環境条件と比較できる温度を生み出し、熱ニッチが大きく異なる種間の比較など、熱耐性に大きな違いがある場合に好ましい。しかしながら、熱損傷蓄積のためのQ10が高いため、熱耐性9の特異性変化などの小さな効果サイズを検出するために静的アッセイが好ましい場合がある。また、実際には、静的なアッセイは、動的なアッセイよりも洗練された装置を必要としません。
目的 本論文の目的は、今後の研究で使用できるCT分 および熱KDアッセイの方法を形式化し、運動性昆虫の熱限界を評価することです。プロトコルは、以前に確立された方法論から適応され、高スループット、自動化、およびコスト効率が高いように設計されています。どちらのアッセイも短時間(〜2時間)で完了することができ、反復性や精度を犠牲にすることなく、1日に複数の実験を行い、大量のデータを生成することができます。この設定により、96ハエの熱耐熱度を同時に測定することができ、CT最小 のカラムは、止まり木に十分な表面積があれば、100以上のハエを保持することができます。
CT分 を観察するためのハイスループット方法は、ハエを自動的にカウントするために赤外線センサーを追加して、共通のジャケットカラム方法論を変更します。計数用赤外線センサの使用は、1996年23 年にShumanらの最初の提案であったが、広く採用されていない。赤外線センサーの追加は、離散間隔でデータを収集するのではなく、連続的なデータを生成することができます。このプロトコルは、手動でのデータ入力を排除し、離散した時点でジャッキ列の下のコレクションチューブを手動で切り替える必要をなくすことで、実験者のエラーを最小限に抑えます。
熱KDTを記録するためのハイスループット方法は、昆虫10,12,12における熱耐性の2つの以前の研究から改変される。個々のハエは温度制御されたインキュベーターの96の井戸の版で貯られ、ビデオは記録される。このプロトコルは、実験を再生して確認できるため、熱KDTを決定する際の実験者のバイアスを最小限に抑えます。このプロトコルは、ビデオ分析を高速化するために使用できるカスタム Python スクリプトのセットも提供します。個々のウェルの使用は、他の個人が移動または転倒したときに発生する可能性のある干渉を排除し、これは、個体群が同じアリーナ10、17,17で観察されたときに問題になる可能性がある。さらに、温度制御インキュベーターは、温度制御されたアルミニウムブロック10にわたって時々観察される温度勾配とは異なり、96のウェル全体にわたって安定した温度を提供する。また、96ウェル記録方式は、動的CTマックスおよびCT最小の測定に適応することができることに注意してください(議論参照)。
各プロトコルを実証するために、ショウジョウバエメラノガスターの一部のラインから成体ショウジョウバエメラノガスターメスの熱限界を遺伝学的参照パネル(DGRP)と比較し、24を比較した。予備的な実験は熱耐性の有意な差を示したので、これらのラインが選択されました。これらのアッセイは、熱耐性の違いを識別するための堅牢な方法であることが判明した。以下の2つのプロトコルは、ハイスループットCT分アッセイ(セクション1)および高スループット熱KDアッセイ(セクション2)、成人よ性ショウジョウバエなどの装置に収まり得る任意のモチル昆虫寿命段階に対してCT分および加熱KDTデータを生成するために必要な行動を記述する。CT分の場合は、昆虫が止まり木にできることも不可欠です。ここでは、各アッセイが成人ショウジョウバエメラノガスターで実証されています。しかし、他の分類またはライフステージ6に変更が必要な場合があります。小さな変更には、CT分アッセイでより大きな標本を収容するために大きな開口部を持つ止まり材を使用するか、より高品質のカメラを使用して、ゆっくりと動く昆虫の微妙なKDTまたは熱KDアッセイのライフステージを識別することが含まれる場合があります。このプロトコルでは、ハエを準備する方法は記述されていませんが、反復性25を確保するために、飼育プロトコルを標準化することが重要です (ガルシアとティーツ26とティーツと Hahn27を参照)。提供されるプロトコルには、装置の構築とセットアップ方法、測定を記録する方法、およびデータ分析の簡単な説明が含まれます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps)</td>
			<td>Thermo Scientific; Waltham, MA</td>
			<td>153-5401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C922 Pro Stream Webcam</td>
			<td>Logitech; Newark, CA</td>
			<td>960-001087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular adjustable steel clamp &#8211; 5.08 cm to 7.62 cm</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear acrylic tubing &#8211; 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>44036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear acrylic tubing &#8211; 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>440515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear acrylic tubing &#8211; 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>44041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear silicone sealant</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tube (15 ml)</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Drill</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Funnel Monitor (DFM)</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td>DFM</td>
			<td>Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAM data collection software</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Records data input from the DFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Storage Lid</td>
			<td>FlySorter; Seatle, WA</td>
			<td>FS-96LID-5PK</td>
			<td>Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Storage Plate</td>
			<td>FlySorter; Seatle, WA</td>
			<td>FS-96PLATE-5PK</td>
			<td>Used to hold flies during in the sCTmax assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Tray</td>
			<td>FlySorter; Seatle, WA</td>
			<td>FS-TRAY-5PK</td>
			<td>Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass funnel</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>28950-75</td>
			<td>75mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gutter guard</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>~0.5 cm diameter openings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hacksaw</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heratherm Thermo Scientific incubator</td>
			<td>Thermo Scientific; Waltham, MA</td>
			<td>OMS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hose nylon adapters (2) &#8211; &#188; MNPT x 3/8</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>61135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun and glue</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnets</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software</td>
			<td>OMEGA; Norwalk, CT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMEGA thermocouple (Type T)</td>
			<td>OMEGA; Norwalk, CT</td>
			<td>5LRTC-TT-K-20-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic funnel</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>2&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubing - 0.6 cm diameter</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>62852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort ring</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>2&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort three-prong clamp</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial port connector (PSIU9)</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td>PSIU9</td>
			<td>Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam (2&#34; thick)</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uninterrupted Power Supply (PS9-1)</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td>PS9-1</td>
			<td>Power supply for the DFM and PSIU9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weld-on #4 Acrylic Cement</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>45737</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assays of critical thermal limits in insects

動植物の上下の熱制限は、その性能、生存、および地理的分布の重要な予測変数であり、気候変動への応答を予測するために不可欠です。この研究は、昆虫の熱限界を測定するための2つのハイスループットプロトコルを説明します:1つは臨界熱ミニマ(CT分)を評価し、もう1つは静的熱ストストレスに応じて熱ノックダウン時間(KDT)を評価するためのものです。CT分 アッセイでは、個人はアクリルジャケットのカラムに入れられ、温度ランプが低下し、赤外線センサーを使用して止まり木から落ちるとカウントされます。熱KDTアッセイでは、個人は96ウェルプレートに含まれ、ストレスの多い高温温度に設定されたインキュベーターに入れられ、ビデオは直立したままで動かなくなった時間を決定します。これらのプロトコルは、一般的に使用される技術よりも優れた利点を提供します。どちらのアッセイも低コストで、比較的迅速に完了できます(〜2時間)。CT分 アッセイは実験者の誤差を減らし、多数の個体を一度に測定できる。熱KDTプロトコルは、各アッセイのビデオ記録を生成し、実験者のバイアスとリアルタイムで個人を継続的に監視する必要性を除去します。

ショウジョウバエメラノガスター遺伝参照パネル(DGRP)からの女性の熱限界(すなわちCT分および熱KDT)を測定し、2つのプロトコルから生成される高スループットデータを実証した。CT分は、DGRP線714(n=37)および913(n=45)を用いてアッセイした。熱KDTをアッセイし、DGRP行189(n=42)および461(n=42)と比較し、ビデオファイルを手動で解析した。ビデオの視聴を...

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High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects

熱制限は、急速な気候変動に直面した場合に貴重な情報である生物が許容する環境を予測することができます。ここでは、昆虫の重要な熱ミニマと熱ノックダウン時間を評価するためのハイスループットプロトコルを説明します。両方のプロトコルは、スループットを最大化し、アッセイのコストを最小限に抑えます。

昆虫の臨界熱限界のハイスループットアッセイ

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are ...

熱耐性は、種の分布と気候変動への対応の重要な要素です。ここでは、小さな昆虫の熱と耐寒性を迅速に評価する方法を提供します。耐寒性を測定するためのこれらの方法は、臨界熱最小および熱耐熱を介して、熱ノックダウン時間を介して、高スループット、半自動化され、最小限の機器を必要とする。手順を実証することは、私の研究室のポスドクであるデビッド・アウデです。臨界熱最小アッセイを設定するには、温度制御された流体浴に電源を入れ、再生ボタンを押してプログラムを実行し、浴の温度を25°Cに上げて維持します。5~10分待って、流体浴室の柱が摂氏25度に達するまで、カラム上部のプラグを直径5.08センチメートルのフィルターに交換します。約40ハエを漏斗を通して列に入れ、ハエが逃げないように気をつけて、漏斗をプラグに素早く交換します。その後、ハエが落ち着くことを許可します。時折、ハエが登ることを奨励するために底のプラグをタップします。5分後、流体浴ゲインの開始ボタンを押して、臨界熱小量ランププログラムを開始します。コンピュータでサーマルカップル記録ソフトウェアを開き、記録をクリックして、アッセイの持続時間を毎秒、カラム内の温度記録を開始します。各温度記録に 2 番目のタイムスタンプが含まれていることを確認し、後で Dsosophila じょうごモニターのデータと温度データをマージできるようにします。90%エタノールの5ミリリットルを15ミリリットルの円錐遠心管に加え、チューブをカラムの下のラックに入れる。時折、柱の下部プラグをタップして、下のハエを誘惑して登ります。ハエのほとんどは止まり木の上か、15°Cの柱の頂上付近にあります。摂氏15度で、ショウジョウバエ漏斗モニターに75ミリメートルの外径ガラス漏斗を入れます。底部のプラグを取り外し、エタノールのプラグにハエを引き続き集めます。レトルトリング、じょうごモニター、漏斗を調整して、カラムの下に表示します。漏斗の唇が柱の底を完全に密封し、漏斗の底を15ミリリットルのコレクションチューブに挿入することを確認してください。ショウジョウバエの漏斗モニターソフトウェアを開きます。ソフトウェアはすぐにハエが彼らの重要な熱ミニマに達する時刻と日付の記録を開始します。彼らの重要な熱ミニマに達するハエは、神経筋機能を失い、ショウジョウバエ漏斗モニターを介して、彼らの止まり木から落ちる。すべてのハエが重要な熱ミニマに達しているかどうかを監視するには、温度が下がるにつれて、上部プラグと止まり木をチェックして、ハエがまだ止まっているかどうかを確認します。すべてのハエがクリティカルな熱ミニマに達したら、ショウジョウバエの漏斗モニターを動かし、カラムの開口部から離します。まれに、ハエは重大な熱小マに達するかもしれませんが、柱に立ち往生したままです。これらのハエを削除するには、上部のプラグを開きます。高スループットの熱を設定するには、アスピレーターと中隔蓋を使用して、個々の二酸化炭素鎮静ハエを、修正された96ウェル底板の各ウェルにロードし、明確なタイトフィット蓋でプレートを密封します。その後、食べ物の供給の上にプレートを置き、ハエが少なくとも48時間96ウェルプレートに順応できるようにします。アッセイの日に、インキュベーターを摂氏37.5度に設定し、30分後にフライカルチャープレートをトレイの底に白い紙に対してプレートの底を置いてインキュベーターに入れます。トレイとウェブカメラのフレームのウェル列と行の名前の向きを確認し、色付きのテープをプレートの側面とエッジに沿って配置して、方向を確認します。プレートが配置されたら、インキュベータードアを閉じ、ビデオ録画ソフトウェアの[録画]をクリックします。2時間後、すべてのハエが最後の休息場所に到達し、動きを停止したかどうかを確認するために録音をチェックしてください。すべてのハエが動かなくなったら、停止してハエを処分します。ビデオファイルを開き、各井戸の各フライのノックダウン時間を記録します。試験と観測の間のダウンタイムを打ち切った熱の最も一貫した尺度は、ハエが最終的な休息場所に到達する時間です。その後、単一の井戸に焦点を当て、フライが最初に最後の休息場所から移動する時間に注目して、逆にビデオを追跡します。各フライの最終的な休息時間を決定することは困難な場合があります。正確な分析を行うためには、時間をかけて、それぞれを個別に観察することが重要です。この代表的な分析では、ショウジョウバエ遺伝基準パネルラインからの雌は、DGRP線714からのメスよりも平均熱ミニマ温度が有意に低かった。さらに、熱は摂氏37.5度でノックダウン時間、73と461 DGRPラインから女性の間で有意に異なる。軽微な変更により、この方法は、ノックダウン時間を測定するために、チル昏睡回復時間または臨界熱最大量などの他の熱耐性特性を測定するために使用することができる。研究者の実践的な時間を大幅に短縮することにより、これらの方法は、これまで不可能であったスケールで遺伝的変異および熱耐性形質の探査を可能にしました。

Research

JoVE Journal

Biology

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

咀嚼昆虫にシロイヌナズナの抵抗をテストするための選択肢と無選択アッセイ

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

環境試料中の有機Pのハイスループット測定と分類

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

ハイスループット酵母プラスミドの過剰発現の画面

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピング<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

ハイスループットのアプリケーションのための大人のゼブラフィッシュハーツの回復

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

高スループット<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;エネルギー消費アッセイ

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...