Name: high-throughput assays of critical thermal limits in insects
Uploaded: 2020-06-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects at JoVE.com

Vi tackar Ellie McCabe för hjälp med fly uppfödning. Detta arbete stöds av United States Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture Hatch Project bidrag 1010996 och National Science Foundation bevilja OIA-1826689 till N.M.T.

1. HÖGPRESTERANDE CTmin-analys
<ol><li>Montering av den mantade kolonnen( Bild 1A, Bild 2)<ol>
<li>Skär det bredaste (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) och smalaste (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) akrylrör till lika långa (31,5 cm) med en bågfil (Figur 2A). Dessa två rör kommer att vara de yttre och innersta väggarna i den mantade kolonnen.</li>
		<li>Skär två ringar (2 cm brett) från det ...

<ol>
	<li>Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+variation,+thermal+extremes+and+the+physiological+performance+of+individuals.">Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals.</a> Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).</li><li>Angilletta, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thermal Adaptation: A Theoretical and Empirical Synthesis. , (2009).</li><li>Coumou, D., Rahms Torf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+weather+extremes.">A decade of weather extremes.</a> Nature Climate Change. 2 (7), 491-496 (2012).</li><li>Wang, G., Dillon, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+geographic+convergence+in+diurnal+and+annual+temperature+cycling+flattens+global+thermal+profiles.">Recent geographic convergence in diurnal and annual temperature cycling flattens global thermal profiles.</a> Nature Climate Change. 4 (11), 988-992 (2014).</li><li>MacMillan, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+cause+from+consequence:+A+systematic+approach+to+thermal+limits.">Dissecting cause from consequence: A systematic approach to thermal limits.</a> Journal of Experimental Biology. 222 (4), 191593 (2019).</li><li>Sinclair, B. J., Coello Alvarado, L. E., Ferguson, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+invitation+to+measure+insect+cold+tolerance:+Methods,+approaches,+and+workflow.">An invitation to measure insect cold tolerance: Methods, approaches, and workflow.</a> Journal of Thermal Biology. 53, 180-197 (2015).</li><li>Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+thermal+maximum:+History+and+critique.">The critical thermal maximum: History and critique.</a> Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).</li><li>Cooper, B. S., Williams, B. H., Angilletta, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unifying+indices+of+heat+tolerance+in+ectotherms.">Unifying indices of heat tolerance in ectotherms.</a> Journal of Thermal Biology. 33 (6), 320-323 (2008).</li><li>J&#248;rgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+assess+Drosophila+heat+tolerance:+Unifying+static+and+dynamic+tolerance+assays+to+predict+heat+distribution+limits.">How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits.</a> Functional Ecology. 33 (4), 629-642 (2019).</li><li>Hazell, S. P., Pedersen, B. P., Worland, M. R., Blackburn, T. M., Bale, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+rapid+measurement+of+thermal+tolerance+traits+in+studies+of+small+insects.">A method for the rapid measurement of thermal tolerance traits in studies of small insects.</a> Physiological Entomology. 33 (4), 389-394 (2008).</li><li>Andersen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+assess+Drosophila+cold+tolerance:+Chill+coma+temperature+and+lower+lethal+temperature+are+the+best+predictors+of+cold+distribution+limits.">How to assess Drosophila cold tolerance: Chill coma temperature and lower lethal temperature are the best predictors of cold distribution limits.</a> Functional Ecology. 29 (1), 55-65 (2015).</li><li>Hu, X. P., Appel, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+of+critical+thermal+limits+and+temperature+tolerance+in+Formosan+and+eastern+subterranean+termites+(Isoptera:+Rhinotermitidae).">Seasonal variation of critical thermal limits and temperature tolerance in Formosan and eastern subterranean termites (Isoptera: Rhinotermitidae).</a> Environmental Entomology. 33 (2), 197-205 (2004).</li><li>Rolandi, C., Lighton, J. R. B., de la Vega, G. J., Schilman, P. E., Mensch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+for+tolerance+to+high+temperatures+in+a+population+of+Drosophila+melanogaster.">Genetic variation for tolerance to high temperatures in a population of Drosophila melanogaster.</a> Ecology and Evolution. 8 (21), 10374-10383 (2018).</li><li>Overgaard, J., Kristensen, T. N., S&#248;rensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validity+of+thermal+ramping+assays+used+to+assess+thermal+tolerance+in+arthropods.">Validity of thermal ramping assays used to assess thermal tolerance in arthropods.</a> PLoS ONE. 7 (3), 1-7 (2012).</li><li>Klok, C. J., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+thermal+limits,+temperature+tolerance+and+water+balance+of+a+sub-Antarctic+kelp+fly,+Paractora+dreuxi+(Lepidoptera:+Tineidae).">Critical thermal limits, temperature tolerance and water balance of a sub-Antarctic kelp fly, Paractora dreuxi (Lepidoptera: Tineidae).</a> Journal of Insect Physiology. 43, 685-694 (1997).</li><li>Salachan, P. V., Burgaud, H., S&#248;rensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+thermal+limits:+Non-linear+reaction+norms+drive+disparate+thermal+acclimation+responses+in+Drosophila+melanogaster.">Testing the thermal limits: Non-linear reaction norms drive disparate thermal acclimation responses in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 118 (September), 103946 (2019).</li><li>Everatt, M. J., Bale, J. S., Convey, P., Worland, M. R., Hayward, S. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+acclimation+temperature+on+thermal+activity+thresholds+in+polar+terrestrial+invertebrates.">The effect of acclimation temperature on thermal activity thresholds in polar terrestrial invertebrates.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (10), 1057-1064 (2013).</li><li>MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+gut+in+insect+chilling+injury:+Cold-Induced+disruption+of+osmoregulation+in+the+fall+field+cricket,+Gryllus+pennsylvanicus.">The role of the gut in insect chilling injury: Cold-Induced disruption of osmoregulation in the fall field cricket, Gryllus pennsylvanicus.</a> Journal of Experimental Biology. 214 (5), 726-734 (2011).</li><li>Huey, R. B., Crill, W. D., Kingsolver, J. G., Weber, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+measurement+of+heat+or+cold+resistance+of+small+insects.">A method for rapid measurement of heat or cold resistance of small insects.</a> British Ecological Society. 6 (4), 489-494 (1992).</li><li>Jenkins, N. L., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+maternal+variation+for+heat+resistance+in+drosophila+from+the+field.">Genetic and maternal variation for heat resistance in drosophila from the field.</a> Genetics. 137 (3), 783-789 (1994).</li><li>Ransberry, V. E., MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+chill-coma+onset+and+recovery+at+the+extremes+of+the+thermal+window+of+Drosophila+melanogaster.">The relationship between chill-coma onset and recovery at the extremes of the thermal window of Drosophila melanogaster.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 84 (6), 553-559 (2011).</li><li>S&#248;rensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+of+the+heat+hardening+response+in+an+Arctic+insect.">Rapid induction of the heat hardening response in an Arctic insect.</a> Biology Letters. 15 (10), (2019).</li><li>Shuman, D., Coffelt, J. A., Weaver, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-based+electronic+fall-through+probe+insect+counter+for+monitoring+infestation+in+stored+products.">A computer-based electronic fall-through probe insect counter for monitoring infestation in stored products.</a> Transactions of the American Society of Agricultural Engineers. 39 (5), 1773-1780 (1996).</li><li>MacKay, T. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+melanogaster+Genetic+Reference+Panel.">The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel.</a> Nature. 482 (7384), 173-178 (2012).</li><li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A laboratory handbook. , (2005).</li><li>Garcia, M. J., Teets, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold+stress+results+in+sustained+locomotor+and+behavioral+deficits+in+Drosophila+melanogaster.">Cold stress results in sustained locomotor and behavioral deficits in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological and Integrative Physiology. 331 (3), 192-200 (2019).</li><li>Teets, N. M., Hahn, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+the+shape+of+cold-survival+curves+in+a+single+fly+population+suggests+potential+for+selection+from+climate+variability.">Genetic variation in the shape of cold-survival curves in a single fly population suggests potential for selection from climate variability.</a> Journal of Evolutionary Biology. 31 (4), 543-555 (2018).</li><li>Kelty, J. D., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+rapid+cold+hardening+by+cooling+at+ecologically+relevant+rates+in+Drosophila+melanogaster.">Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).</li><li>MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+insect+chill-coma.">Mechanisms underlying insect chill-coma.</a> Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).</li><li>Salachan, P. V., S&#248;rensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+thermal+limits+affected+differently+by+developmental+and+adult+thermal+fluctuations.">Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).</li><li>Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+robust+sex-specific+trade-off+between+cold+resistance+and+starvation+resistance+in+Drosophila+melanogaster.">Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).</li><li>Kelty, J. D., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cold-hardening+of+Drosophila+melanogaster+(Diptera:+Drosophilidae)+during+ecologically+based+thermoperiodic+cycles.">Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles.</a> Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).</li><li>Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insects+at+low+temperatures:+An+ecological+perspective.">Insects at low temperatures: An ecological perspective.</a> Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).</li></ol>

De två metoderna som beskrivs ovan genererar data med hög genomströmning av ekologiskt relevanta mätvärden för övre och nedre termiska gränser. Dessa protokoll bygger på tidigare etablerade metoder som är gemensamma för forskning om insektstermiska gränser (sammanfattas i Sinclair et al.) 6. Båda protokollen kan fyllas i på kort tid (~ 2 h vardera), producera datamängder med stora provstorlekar, inte offra repeterbarhet eller noggrannhet, och minimera experimenter fel genom att ...

Termiska gränser av insekter Variation i miljöförhållanden, inklusive temperatur, är en viktig faktor som påverkar prestanda, kondition, överlevnad och geografisk fördelning av organismer1,2. Övre och nedre termiska gränser bestämma det teoretiska utbudet av miljöer en organism kan tolerera, och, därför, dessa gränser är viktiga prediktorer för växt-och djurfördelningar, särskilt införklimatförändringarna 3,4. Således protokoll för att exakt mäta termiska gränser är viktiga verktyg för ekologer, fysiologer, evolutionsbiologer, och bevarande biologer, bland andra.
Som de mest förekommande och varierande landlevande djuren används insekter ofta för mätningar av termiska gränser. Kritisk termisk maxima (CTmax) och kritiska termiska minima (CTmin) används vanligen för att bedöma intra- och interspecifik variation i termisk tolerans5,6,7. Medan CTmax och CTmin kan mätas för flera fenotyper, inklusive tillväxt, reproduktiva produktionen, och beteende, de är vanligast tillämpas på rörelseaktivitet funktion5,6,7. Således ctmax (även kallad värme knockdown temperatur) och CTmin definieras ofta som de höga och låga temperaturer vid vilka insekter förlorar motorisk funktion och inte kan förbli upprätt5,6,7,8,9,10,11. CTmin sammanfaller med början av chill koma, en reversibel förlamning som väckts av kalla temperaturer6. Medan förlamning vid de termiska gränserna ofta är reversibel, fortsatt exponering för dessa temperaturer leder till ekologisk död5.
Gemensamma metoder för att mäta termiska gränsvärden En mängd olika apparater har använts för att mäta termiska gränser (sammanfattas i Sinclair et al.) 6. Kortvarigt, insekter värms upp eller kyls i inkubatorer12,13, behållare nedsänkta i vätskebad11,14,15,16, aluminiumblock10,17, eller mantade behållare18, och övervakas tills förflyttning upphör. För att övervaka insekter under analysen är den vanligaste metoden direkt observation, där individer kontinuerligt övervakas i realtid eller retrospektivt med inspelad video6,9,10,11,15,17. Medan direkta observationsmetoder har minimal utrustning krav, de är arbetsintensiva och begränsa genomströmning. Alternativt kan insekter observeras indirekt genom att samla in individer vid diskreta tider när de faller från sittpinnar6,19,20,21 eller med hjälp av aktivitetsmonitorer13.
Indirekta metoder för att mäta termiska gränser är i allmänhet högre-genomströmning och potentiellt mindre felbenägna än direkta observationsmetoder. Den vanligaste metoden för indirekt övervakning använder en mantad temperaturstyrd kolumn6,8,19,20,21. Insekter placeras inuti en kolonn med sittpinnar, och temperaturen i den inre kammaren styrs genom att pumpa vätska från ett temperaturkontrollerat vätskebad genom kolonnens mantlade foder. Individer som når sin termiska gräns faller från sin abborre och samlas in vid diskreta temperaturer eller tidsintervall. Medan denna metod fungerar bra för CTmin, har det hittats olämpligt för CTmax, eftersom flugor frivilligt gå ut ur botten av kolonnen när temperaturen ökar. Den nya metod som beskrivs här kringgår denna fråga genom att individuellt innehålla flugor under automatiserade mätningar.
Förutom observationsmetoden används ofta två typer av temperaturregimer för att bedöma övre termiska gränsvärden. Dynamiska analyser består av gradvis ökande temperatur tills motorisk funktion går förlorad; att temperaturen är den dynamiska CTmax7,8,9,13. I motsats till statiska analyser består av en konstant stressande temperatur tills motorisk funktion går förlorad; den tidspunkten är värme knockdown tid (värme KDT), även kallad den statiska CTmax (sCTmax) i en nyligen papper av Jørgensen et al.7,8,9,16,22. Även om CTmax och värme knockdown analyser (värme KD-analyser) producerar mätvärden med olika enheter, matematisk modellering av de två egenskaper indikerar de ger jämförbar information om värmetolerans och är både ekologiskt relevanta8,9. Dynamiska analyser ger en temperatur som kan jämföras med miljöförhållanden, och de är att föredra när det finns stora skillnader i värmetolerans, såsom jämförelser mellan arter med vitt skilda termiska nischer. På grund av den höga Q10 för värmeskada ackumulering kan dock en statisk analys vara att föredra för att upptäcka små effektstorlekar, såsom intraspecifik variation i värmetolerans9. Också, praktiskt taget, kräver en statisk analys mindre sofistikerad utrustning än en dynamisk analys.
Mål Målet med detta papper är att formalisera metoder för CTmin och värme KD analyser som kan användas i framtida forskning för att bedöma termiska gränserna för motila insekter. Protokollen är anpassade från tidigare etablerade metoder och är utformade för att vara höggenomströmning, automatiserad och kostnadseffektiv. Båda analyserna kan slutföras på kort tid (~ 2 h), vilket innebär att flera experiment kan genomföras på en enda dag, producera stora mängder data utan att offra repeterbarhet eller noggrannhet. Med denna uppställning kan värmetoleransen för 96 flugor mätas samtidigt, medan kolonnen för CTmin kan rymma mer än 100 flugor, förutsatt att det finns tillräcklig yta för perching.
Höggenomströmningsmetoden för att observera CTmin ändrar den vanliga jacketed kolonnmetodiken med tillsats av en infraröd sensor för att automatiskt räkna flugor. Användningen av en infraröd sensor för räkning föreslogs först av Shuman et al. 199623 men har inte antagits i stor utsträckning. Tillägget av den infraröda sensorn möjliggör generering av kontinuerliga data snarare än att samla in data med diskreta intervaller. Detta protokoll minimerar också experimenter fel genom att eliminera manuell datainmatning och behovet av att manuellt växla insamlingsrör under jacked kolumnen vid diskreta tidpunkter.
Höggenomströmningsmetoden för registrering av värme KDT modifieras från två tidigare studier av värmetolerans hosinsekter 10,12. Enskilda flugor lagras i en 96 brunnsplatta i en temperaturkontrollerad inkubator och video spelas in. Detta protokoll minimerar experimenter bias i att fastställa värme KDT eftersom experiment kan granskas och verifieras genom att spela upp inspelningen. Det här protokollet innehåller också en uppsättning anpassade Python-skript som kan användas för att snabba upp videoanalys. Användningen av enskilda brunnar eliminerar störningar som kan uppstå när andra individer flyttar runt eller faller över, vilket kan vara ett problem när grupper av individer observeras i samma arena10,17. Vidare ger den temperaturkontrollerade inkubatorn en stabil temperatur över alla 96 brunnar, till skillnad från den temperaturgradient som ibland observeras över ett temperaturkontrollerat aluminiumblock10. Observera också att 96 väl inspelningsmetoden kan anpassas för att mäta dynamisk CTmax och potentiellt CTmin (se Diskussion).
För att demonstrera varje protokoll jämfördes de termiska gränserna för vuxna Drosophila melanogaster-honor från utvalda linjer i Den genetiska referenspanelen för Drosophila melanogaster (DGRP)24. Dessa linjer valdes eftersom preliminära experiment indikerade betydande skillnader i termisk tolerans. Dessa analyser visade sig vara robusta metoder för att diskriminera skillnader i termisk tolerans. Följande två protokoll, ct min-analys med höggenomströmning (avsnitt 1) och hög genomströmningsvärme KD-analys (avsnitt 2), beskriver nödvändiga åtgärder för att ta fram CTmin och värme KDT-data för alla motila insektslivsstadium som kan passa i apparaturerna, såsom vuxna Drosophila. För CTmin är det också viktigt att insekten kan abborre. Här, varje analys påvisas i vuxna Drosophila melanogaster. Ändringar kan dock krävas för andra taxa- eller livsstadium6. Mindre förändringar kan inkludera att använda perching material med större öppningar för att rymma större exemplar i CTmin analys eller använda en högre kvalitet kamera för att urskilja den subtila KDT av en långsam rörelse insekt eller livsstadium i värmen KD analys. Detta protokoll beskriver inte metoder för att förbereda flugor, men det är viktigt att standardisera uppfödningsprotokoll för att säkerställa repeterbarhet25 (se Garcia och Teets26 och Teets och Hahn27). Protokollen som lämnas innehåller information om hur man bygger och ställer in apparaterna, hur man registrerar mätningar och en kort beskrivning av dataanalys.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps)</td>
			<td>Thermo Scientific; Waltham, MA</td>
			<td>153-5401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C922 Pro Stream Webcam</td>
			<td>Logitech; Newark, CA</td>
			<td>960-001087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular adjustable steel clamp &#8211; 5.08 cm to 7.62 cm</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear acrylic tubing &#8211; 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>44036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear acrylic tubing &#8211; 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>440515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear acrylic tubing &#8211; 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>44041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear silicone sealant</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tube (15 ml)</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Drill</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Funnel Monitor (DFM)</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td>DFM</td>
			<td>Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAM data collection software</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td></td>
			<td>Records data input from the DFM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Storage Lid</td>
			<td>FlySorter; Seatle, WA</td>
			<td>FS-96LID-5PK</td>
			<td>Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Storage Plate</td>
			<td>FlySorter; Seatle, WA</td>
			<td>FS-96PLATE-5PK</td>
			<td>Used to hold flies during in the sCTmax assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Food Tray</td>
			<td>FlySorter; Seatle, WA</td>
			<td>FS-TRAY-5PK</td>
			<td>Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass funnel</td>
			<td>Kimax</td>
			<td>28950-75</td>
			<td>75mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gutter guard</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>~0.5 cm diameter openings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hacksaw</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heratherm Thermo Scientific incubator</td>
			<td>Thermo Scientific; Waltham, MA</td>
			<td>OMS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hose nylon adapters (2) &#8211; &#188; MNPT x 3/8</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>61135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glue gun and glue</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnets</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software</td>
			<td>OMEGA; Norwalk, CT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OMEGA thermocouple (Type T)</td>
			<td>OMEGA; Norwalk, CT</td>
			<td>5LRTC-TT-K-20-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic funnel</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>2&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tubing - 0.6 cm diameter</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>62852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort ring</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>2&#34; diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort three-prong clamp</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serial port connector (PSIU9)</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td>PSIU9</td>
			<td>Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam (2&#34; thick)</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uninterrupted Power Supply (PS9-1)</td>
			<td>TriKinetics; Waltham, MA</td>
			<td>PS9-1</td>
			<td>Power supply for the DFM and PSIU9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weld-on #4 Acrylic Cement</td>
			<td>United States Plastic Corp., OH</td>
			<td>45737</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assays of critical thermal limits in insects

Övre och nedre termiska gränser för växter och djur är viktiga prediktorer för deras prestanda, överlevnad och geografiska distributioner, och är viktiga för att förutsäga svar på klimatförändringarna. Detta arbete beskriver två höggenomströmningsprotokoll för mätning av insekts termiska gränser: en för bedömning av kritiska termiska minima (CTmin), och den andra för bedömning av heat knock down-tid (KDT) som svar på en statisk värmestressor. I CTmin-analysen placeras individer i en akrylmantad kolonn, utsätts för en minskande temperaturramp, och räknas när de faller från sittpinnarna med hjälp av en infraröd sensor. I värmen KDT analys, individer finns i en 96 väl platta, placeras i en inkubator inställd på en stressande, varm temperatur, och video inspelad för att bestämma den tid då de inte längre kan förbli upprätt och flytta. Dessa protokoll erbjuder fördelar jämfört med vanligt förekommande tekniker. Båda analyserna är låg kostnad och kan slutföras relativt snabbt (~ 2 h). CTmin-analysen minskar experimenterfel och kan mäta ett stort antal individer på en gång. Den värme KDT protokollet genererar en videoinspelning av varje analys och därmed tar bort experimenter bias och behovet av att kontinuerligt övervaka individer i realtid.

De termiska gränserna (dvs, CTmin och värme KDT) för honor från Drosophila melanogaster Genetiska referenspanelen (DGRP) mättes för att visa de data med hög genomströmning som genereras från de två beskrivna protokollen. CTmin var assayed med hjälp av DGRP linjerna 714 (n = 37) och 913 (n = 45). Heat KDT analyserades och jämfördes med DGRP-linjerna 189 (n = 42) och 461 (n = 42), och videofiler analyserades manuellt. Den totala tiden för experim...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects at JoVE.com

High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects

Termiska gränser kan förutsäga de miljöer organismer tolererar, vilket är värdefull information inför snabba klimatförändringar. Beskrivs här är hög genomströmning protokoll för att bedöma kritiska termiska minima och värme knockdown tid i insekter. Båda protokollen maximerar genomströmningen och minimerar kostnaderna för analyserna.

Hög genomströmningsanalyser av kritiska termiska gränser hos insekter

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are ...

Termisk tolerans är en kritisk komponent i artfördelningar och svar på klimatförändringarna. Här tillhandahåller vi metoder för att snabbt bedöma värme och köldtolerans hos små insekter. Dessa metoder för att mäta kall tolerans, via den kritiska termiska minimum och värmetolerans, via värme nedslagen tid är hög genomströmning, halvautomatisk och kräver minimal utrustning.Demonstrera förfarandet kommer att David Awde, en postdoc från mitt laboratorium. För att ställa in en kritisk termisk minsta analys, makt på en temperaturkontrollerad vätska bad och tryck på play-knappen för att köra ett program, höja och bibehålla temperaturen i badet till 25 grader Celsius. Vänta fem till 10 minuter så att den flytande badrum kolumnen för att nå 25 grader Celsius, innan du byter kontakten på toppen av kolumnen med en 5,08 centimeter diameter filter.Tryck på cirka 40 flugor från deras matflaska in i kolonnen genom tratten och byt snabbt ut tratten med kontakten, var noga med att inte låta några flugor fly. Låt sedan flugorna bosätta sig. Ibland knacka botten kontakten för att uppmuntra flugorna att klättra.Efter fem minuter, tryck på startknappen på vätskebadet vinst, för att börja den kritiska termiska minima rampning programmet. Klicka för att öppna termiska par inspelning programvara på datorn och klicka på spela in för att börja spela in temperaturen inuti kolumnen, varje sekund under hela analysen. Se till att varje temperaturregistrering omfattar den tidsstämpel som är specifik för den andra, så att temperaturdata senare kan slås samman med data från drosophila-trattövervakaren.Tillsätt fem milliliter 90%etanol till ett 15 milliliter koniskt centrifugrör och placera röret i ett rack under kolonnen. Knacka ibland på kolonnens nedre kontakt för att locka några flugor på botten för att klättra. De flesta av flugorna kommer att vara på en abborre eller nära toppen av kolumnen med 15 grader Celsius.Vid 15 grader Celsius, placera en 75 millimeters ytterdiameter glas tratt i Drosophila tratt monitor. Ta bort botten kontakten och samla eventuella flugor fortfarande på kontakten i etanol. Justera retortringen, trattmonitorn och tratten, så att de ligger under kolonnen.Se till att trattens läpp helt tätar kolonnens botten och för in trattens botten i 15 milliliter uppsamlingsröret. Öppna programvaran för Drosophila-trattmonitorn. Programvaran kommer omedelbart att börja registrera tid och datum vid vilken flugorna når sina kritiska termiska minima.Flugor som når sin kritiska termiska minima, kommer att förlora sin neuromuskulära funktion och falla från sina sittpinnar, genom Drosophila tratt monitor. För att övervaka om alla flugorna har nått sina kritiska termiska minima, eftersom temperaturen minskar, kontrollera den övre kontakten och sittpinnarna för att se om några flugor fortfarande är uppflugen. När alla flugor, har nått sin kritiska termiska minima, flytta Drosophila tratt monitor och tratt bort från kolonnen öppning.Vid sällsynta tillfällen kan flugor nå sina kritiska termiska minima, men förblir fast i kolonnen. Öppna den övre kontakten för att ta bort dessa flugor. För att ställa upp en hög genomströmning värme knackade ner analys, använd en aspirator och septum lock, att ladda enskilda koldioxid sövda flugor, i varje brunn av en modifierad 96 väl ingen bottenplatta och försegla plattan med en tydlig åtsittande lock.Placera sedan plattan över en tillförsel av mat och låt flugorna acklimatisera sig till 96 brunnsplattan i minst 48 timmar. På dagen för analysen, ställ inkubatorn till 37,5 grader Celsius, efter 30 minuter placera flugodlingsplattan i inkubatorn med plattans botten mot vitboken på botten av facket. Observera orienteringen av brunnskolumnen och radnamnen på facket och i ramen för webbkameran och placera färgad tejp längs plattans sidor och kanter för att verifiera orienteringen.När plattan är i läge, stäng inkubatordörren och klicka på spela in i videoinspelningsprogrammet. Efter två timmar, kontrollera inspelningen för att se om alla flugor, har nått sin sista viloplats och slutade röra sig. När alla flugor har slutat röra sig, klicka på stopp och avyttra flugorna.Öppna videofilen och spela in knockdown-tiden för varje fluga i varje brunn. Det mest konsekventa måttet på den värme som slogs ned driftstopp mellan försöken och observationerna är den tidpunkt då en fluga når sin sista viloplats. Spåra sedan videon i omvänd, med fokus på en enda brunn och att man kan spela in den tid då flugan först flyttar från sin sista viloplats.Bestämma den slutliga vilotiden för varje fluga kan vara svårt. För att säkerställa en korrekt analys är det viktigt att ta din tid och att observera varje väl individuellt. I denna representativa analys, kvinnor från Drosophila genetiska referens panel linje, hade betydligt lägre medelvärde termisk minima temperaturer än honor från DGRP linje 714.Dessutom, värmen knackade ner tid på 37,5 grader Celsius, skiljer sig avsevärt mellan kvinnor från 73 och 461 DGRP linjer. Med mindre ändringar, denna metod för att mäta värmen knackade ner tid, skulle kunna användas för att mäta andra termiska tolerans egenskaper, såsom chill-koma återhämtningstid eller kritisk termisk maximal. Genom att avsevärt minska den praktiska tiden för utredarna, dessa metoder har gjort det möjligt att utforska genetisk variation och termisk tolerans egenskaper i en skala som inte tidigare var möjligt.

Research

JoVE Journal

Biology

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Valfrihet och No-val analyser för att testa Resistance A. thaliana att tugga Insekter

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Hög genomströmning Mätning och klassificering av organiska P i miljöprover

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Med hög kapacitet Jäst Plasmid Överuttryck skärm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Hög throughput screening av svamp Endoglucanase aktivitet i Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Hög kapacitet fysisk Kartläggning av kromosomer med hjälp av automatiserad<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Hög genomströmning Rening av Affinity-märkta rekombinanta proteiner

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Hög genomströmning microinjections av Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Återvinning av vuxna zebrafisk Hjärtan för hög genomströmning Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Hög genomströmning<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energi Utgifter analys

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...