Name: in vivo targeting of xenografted human cancer cells with functionalized fluorescent silica nanoparticles in zebrafish
Uploaded: 2020-05-08T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish at JoVE.com

Авторы благодарят г-жу Кейли Смит, г-жу Лорен Квок и г-на Александра Флору за корректорирование рукописи. H.F. признает грантовую поддержку со стороны NIH (CA134743 и CA215059), Американского онкологического общества (RSG-17-204 01-TBG) и Фонда Святого Болдрика. F.J.F.L. признает стипендию от Бостонского университета Инновационный центр-BUnano междисциплинарной подготовки в области нанотехнологий для рака (XTNC). I.S признает поддержку NSF (грант CBET 1605405) и NIH R41AI142890.

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) в Медицинской школе Бостонского университета в соответствии с протоколом No: PROTO201800543.
1. Поколение эмбрионов Каспер зебры
<ol><li>Выберите взрослых рыб Каспер, которые по кра?...

<ol>
	<li>Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+carriers+for+drug+delivery+in+cancer.">Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).</li><li>Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+nanoparticles+for+drug+delivery+in+cancer.">Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer.</a> Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).</li><li>Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance.">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).</li><li>Chinen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+Probes+for+the+Detection+of+Cancer+Biomarkers,+Cells,+and+Tissues+by+Fluorescence.">Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence.</a> Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).</li><li>Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+mesoporous+silica+nanoparticles+for+prescreening+of+cervical+cancer.">Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer.</a> Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).</li><li>Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models:+closing+the+gap+between+preclinical+data+and+trial+outcomes.">Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes.</a> Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).</li><li>Sharkey, F. E., Fogh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+in+the+use+of+nude+mice+for+cancer+research.">Considerations in the use of nude mice for cancer research.</a> Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).</li><li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+breast+cancer:+one+size+does+not+fit+all.">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li><li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung.">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li><li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases.">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).</li><li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer.">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li><li>Liu, S., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+cancer.">Zebrafish models for cancer.</a> Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Anderson, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TCA+cycle+transferase+DLST+is+important+for+MYC-mediated+leukemogenesis.">The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis.</a> Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).</li><li>Peerzade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+silica+nanoparticles+for+in+vivo+targeting+of+xenografted+human+tumors+and+cancer+cells+in+zebrafish.">Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish.</a> Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).</li><li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+cellulose+acetate+nanoparticles+for+imaging+tumors+through+systemic+and+topical+applications.">Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications.</a> Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).</li><li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+on+ultrabright+fluorescent+cellulose+acetate+nanoparticles+for+imaging+tumors+through+systemic+and+topical+applications.">Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications.</a> Data in Brief. 22, 383-391 (2019).</li><li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+medium+and+passaging+cell+lines.">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).</li><li>Rao, P. N., Engelberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hela+Cells:+Effects+of+Temperature+on+the+Life+Cycle.">Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle.</a> Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+and+ecology+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).</li></ol>

Протокол, описанный здесь использует зебры в качестве системы in vivo для проверки способности наночастиц распознавать и целевых метастатических раковых клеток человека. На успешное выполнение экспериментов может повлиять несколько факторов. Во-первых, эмбрионы должны быть полностью р?...

Разработка наночастиц, способных обнаруживать, нацеливать и уничтожать раковые клетки, представляет большой интерес как для физиков, так и для биомедицинских исследователей. Появление наномедицины привело к разработке нескольких наночастиц, таких как те, которые спрягаются с таргетингом лигандов и/или химиотерапевтическихпрепаратов 1,,2,,3. Добавленные свойства наночастиц позволяют их взаимодействие с биологической системой, зондирование и мониторинг биологических событий с высокой эффективностью и точностью наряду с терапевтическим применением. Наночастицы оксида золота и железа в основном используются в компьютерной томографии и магнитно-резонансной томографии, соответственно. В то время как энзиматическая деятельность наночастиц золота и оксида железа позволяет обнаруживать раковые клетки с помощью колоритных анализов, флуоресцентные наночастицы хорошо подходят для применения изображений in vivo4. Среди них, ультрабелые флуоресцентные наночастицы особенно полезны, из-за их способности обнаруживать рак на ранних стадиях с меньшим количеством частиц и снижениетоксичности 5.
Несмотря на эти преимущества, наночастицы требуют экспериментов с использованием моделей животных in vivo для выбора подходящих наноматериалов и оптимизации процесса синтеза. Кроме того, как и наркотики, наночастицы полагаются на модели животных для доклинического тестирования, чтобы определить их эффективность и токсичность. Наиболее широко используемой доклинической моделью является мышь, которая является млекопитающим, содержание которого стоит относительно дорого. Для исследований рака, либо генетически модифицированных мышей или ксенотрансплантированных мышей, как правило,используются 6,7. Продолжительность этих экспериментов часто охватывает от нескольких недель до нескольких месяцев. В частности, для исследований метастазирования рака раковые клетки непосредственно вводятся в кровеносную систему мышей в таких местах, как веныхвоста и селезенки 8,,9,,10. Эти модели представляют собой только конечные стадии метастазирования, когда опухолевые клетки экстравазают и колонизируют отдаленные органы. Кроме того, из-за проблем с видимостью, это особенно сложно контролировать миграцию опухолевых клеток и наночастиц ориентации опухолевых клеток у мышей.
Зебрафиш(Danio rerio) стала мощной позвоночной системой для исследований рака из-за его высокой плодовитости, низкой стоимости, быстрого развития, оптической прозрачности игенетических консерваций 11,,12. Еще одним преимуществом зебры над моделью мыши является оплодотворение рыбьих яиц ex utero, что позволяет контролировать эмбрионы на протяжении всего их развития. Эмбриональное развитие быстро у зебры, и в течение 24 часов послеферетия (hpf), позвоночных плоскости тела ужесформировано 13. К 72 л.с. яйца вылупляются из хориона, переходя от эмбриональной к стадии жарки. Прозрачность зебры, штамм Каспер, в частности 14, предоставляет уникальную возможность визуализировать миграцию раковых клеток и их распознавания и ориентации наночастиц в живом животном. Наконец, зебрафиш развивать свою врожденную иммунную систему на 48 л.с., с адаптивной иммунной системы отстает и только становится функциональным на 28 днейпослеференции 15. Этот разрыв во времени идеально подходит для трансплантации различных типов раковых клеток человека в эмбрионы зебры, не испытывая иммунного отторжения.
Описанный здесь метод, который использует прозрачность и быстрое развитие зебры, чтобы продемонстрировать признание и ориентацию раковых клеток человека флуоресцентными наночастицами in vivo. В этом анализе, раковые клетки шейки матки человека (клетки HeLa) генетически модифицированные, чтобы выразить красный флуоресцентный белок были введены в васкуляризованной области в перивителлинной полости 48 л.с. эмбрионов. После 20-24 ч, heLa клетки уже распространились по всей эмбрионов через систему кровообращения рыб. Эмбрионы с явными метастазами были микроинъектированы с 0,5 нл раствора наночастиц прямо за глазом, где находится богатая капиллярная кровать. Используя этот метод, ультрабрайт флуоресцентные наночастицы кремнезема могут ориентироваться на клетки HeLa так быстро, как 20-30 мин постинъекции. Благодаря своей простоте и эффективности, зебрафиш представляет собой надежную модель in vivo для тестирования различных наночастиц на их способность ориентироваться на конкретные раковые клетки.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>KSE scientific</td>
			<td>BMK-A1705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1.0 mm O.D. x 0,78 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer and monitor</td>
			<td>ThinkCentre</td>
			<td>X000335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35960-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MMPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX-10 fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 tip</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/corning-universal-fit-pipet-tips-bulk-packed-6/07200293?keyword=true" target="_blank">07-200-293</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SB93102</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>50-998-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.addgene.org/113726/" target="_blank">pLenti6.2_miRFP670</a></td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic pico pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYSPV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche-Sigma-Fisher</td>
			<td>50-100-3275</td>
			<td>Roche product made by Sigma- sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZ51 dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Western Chemicals</td>
			<td>NC0872873</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo targeting of xenografted human cancer cells with functionalized fluorescent silica nanoparticles in zebrafish

Разработка наночастиц, способных обнаруживать, нацеливать и уничтожать раковые клетки, представляет большой интерес в области наномедицины. Модели животных In vivo необходимы для приведения нанотехнологий к его биомедицинскому применению. Мышь представляет собой традиционную модель животных для доклинкического тестирования; однако, мыши относительно дороги для того чтобы держать и имеют длинные экспериментальные циклы из-за лимитированного потомства от каждой матери. Зебрафиш стала мощной модельной системой для развития и биомедицинских исследований, включая исследования рака. В частности, благодаря оптической прозрачности и быстрому развитию эмбрионы зебры хорошо подходят для мониторинга поведения раковых клеток и их взаимодействия с микроокнироникой в режиме реального времени. Этот метод был разработан для последовательного введения раковых клеток человека и функционализированных наночастиц в прозрачных эмбрионах Каспер зебры и мониторинга распознавания in vivo и ориентации раковых клеток наночастицами в режиме реального времени. Этот оптимизированный протокол показывает, что флуоресцентно помеченные наночастицы, которые функционируют с группами фолиевой кислоты, могут конкретно распознавать и таргетировать метастатические клетки рака шейки матки человека, помеченные другим флуорохромом. Процесс распознавания и таргетинга может произойти уже через 30 минут после вятия проверенных наночастиц. Весь эксперимент требует только разведения нескольких пар взрослых рыб и занимает менее 4 дней. Кроме того, эмбрионы зебры не имеют функциональной адаптивной иммунной системы, что позволяет присвещать широкий спектр раковых клеток человека. Таким образом, полезность описанного здесь протокола позволяет тестировать наночастицы на различных типах раковых клеток человека, облегчая отбор оптимальных наночастиц в каждом конкретном контексте рака для будущего тестирования у млекопитающих и клиники.

Схема протокола на рисунке 1 иллюстрирует общие процедуры этого исследования. Прозрачные Каспер мужской и женской взрослых рыб были выведены для создания эмбрионов (раздел 1). Клетки РППЗ HeLa вводились в васкуляризованную область под перивителинов...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish at JoVE.com

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Описанный здесь метод использования эмбрионов зебры для изучения способности функциональных наночастиц для целевой человеческих раковых клеток in vivo. Этот метод позволяет проводить оценку и отбор оптимальных наночастиц для будущих испытаний на крупных животных и в клинических испытаниях.

В Vivo Ориентация Ксенотрансплантированных раковых клеток человека с функциональными флуоресцентными наночастицами кремнезема в Зебрафиш

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Эта процедура позволяет исследователям оценить и выбрать оптимальные наночастицы для исследований на крупных животных и клинических испытаний. Этот простой метод помогает определить, может ли наночастица быть нацелена на раковые клетки человека in vivo, и если да, то насколько эффективна таргетинг. Демонстрация процедур будет д-р Xiodan Цинь, postdoc, и г-н Эндрю Лам, научный специалист из нашей лаборатории.Заполните два камерных брачных резервуара рыбной водой вечером и разделите верхние резервуары с помощью разделителей. Поместите самца зебры в одну сторону камеры и одну или две самки зебры в другую сторону камеры. Удалите разделители в 8:00 утра на следующее утро.Добавьте искусственные обогатительный завод и слегка наклоните верхнюю камеру, чтобы создать неглубокую площадь воды. Разрешить зебры размножаться в течение трех-четырех часов и собирать яйца из нижней камеры, наливая воду через сетку. Перенесите яйца в чашку Петри с не более чем 200 яйцами на блюдо.Удалите мертвые или неутилизованные яйца. Заполните блюдо на две трети свежей рыбной водой и поместите его в инкубатор. Через 24 часа вынюхив блюдо из инкубатора и удалите из блюда как можно больше воды.Добавьте несколько капель одного миллиграмма на миллилитр проназ раствора и аккуратно закружить блюдо. Когда хорионы проявляют признаки распада, пипетки эмбрионов вверх и вниз несколько раз, чтобы сломать хорионов и освободить эмбрионы. После того, как большинство эмбрионов из хорионов, немедленно добавить пресную рыбную воду, чтобы прекратить процесс.Промыть эмбрионы рыбной водой три раза, чтобы удалить плавающие хорионы Вернуть эмбрионы в инкубатор. Сделать 3%agarose раствор, добавив три грамма электрофорез-класса агарозы до 100 миллилитров автоматической рыбной воды. Микроволновая печь агарозы и воды, пока агароза полностью растворяется.Чтобы создать инъекционной пластины, залить горячим раствором агарозы в чашку Петри, пока она не три четверти полной и место микро-формы инъекций на агарозу. После того, как агароза затвердеет, аккуратно удалите плесень. Заполните полученную инъекционной пластину автоклавной рыбной водой и храните ее при четырех градусах Цельсия.Чтобы сделать инъекционные иглы, потяните борозиликатные стеклянные капилляры диаметром один миллиметр внешнего диаметра на 0,78 миллиметра на пипетку. Храните инъекционные иглы на путте в большой чашке Петри, которая была вытерта этанолом полотенцем. Перед сбором клеток HeLa, rewarm инъекционной пластины и рыбной воды в инкубаторе при 35,5 градусов по Цельсию.За 30 минут до часа до трансплантации, урожай клеток HeLa. Работая в капюшоне культуры тканей, удалить среду из колбы путем аспирации. Промыть клетки стерильным PBS, чтобы удалить все следы среды.Добавьте три миллилитров стерильного трипсина ЭДТА в колбу и инкубировать его при 37 градусах по Цельсию в течение трех-пяти минут. Наблюдайте за колбой под микроскопом, чтобы следить за ходом энзиматической пищеварения. Когда примерно 80% клеток приостановлены, добавьте шесть-восемь миллилитров среднего роста в колбу.Соберите клетки, аккуратно трубя и перенесите их в стерильную трубку на 15 миллилитров. Центрифуга трубки при 135 раз G в течение пяти минут. Аспирировать супернатант и повторно изутовить клетки HeLa в трех миллилитров полной среды роста.После повторения мытья шаги в два раза, повторного перерасхода клеток в один миллилитр полной среды роста. Затем подсчитайте клетки под микроскопом с помощью гемоцитометра. После центрифугирования клеток снова, удалить супернатант.Повторное течение клеток в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки при концентрации в пять раз 10 до седьмой клетки на миллилитр. Держите клетки в тепле, держа трубку в одной руке при транспортировке на рыбный объект. Используя пластиковую пипетку, поместите эмбрионы зебры на инъекционной пластине.Положите эмбрионы по бокам с передней облицовкой вперед выровнены с канавками на пластине. Включите источник воздуха и микроинжектор. После извлечения клеток HeLa из инкубатора, пипетка клетки вверх и вниз от 20 до 30 раз с помощью P200.Используя наконечник загрузки геля с разрезанным концом, немедленно загрузите три микролитров подвески клетки HeLa в одну из игл для инъекций. Вставьте иглу в держатель иглы и поместите инъекционной пластины под микроскопом. Введите клеточную смесь в эмбрион в васкуляризированной области под полостью перивителина, нажав на педаль стопы.Затем пипетка несколько капель стерильной рыбной воды на эмбрион. Чтобы продолжить процесс инъекций, используйте не доминирующую руку, чтобы переместить инъекционной пластины к следующему эмбриону, а затем использовать доминирующую руку, чтобы расширить и втянуть инжектор при одновременном нажатии педали ноги. Закончите инъекцию всех эмбрионов на тарелку и вымойте эмбрионы стерильной рыбной водой в стерильную чашку Петри.Сразу же инкубировать блюдо при 35,5 градусах по Цельсию. Через три часа осмотрим вводимые эмбрионы и удалим мертвые. На следующий день сделайте инъекционные иглы для наночастиц и храните их на складе в большой чашке Петри.Работая под флуоресцентным микроскопом, тщательно подбирайте эмбрионы с метастазами хвоста и посвячивайте их на новую инъекционной пластину со стерильной рыбной водой. Для каждой зебры с метастазами хвоста, вводить либо наночастицы раствора или воды за глазом. Также вводят раствор наночастиц за глазами зебры в контрольной группе, которая не получила пересадки HeLa и инкубировать все вводимые эмбрионы при 35,5 градусах по Цельсию.Сразу же после инъекции и снова с интервалом от 30 до 60 минут, перенести два-три эмбриона в чашку Петри и обездвижить их, добавив пять капель разбавленного раствора MS222. Как только эмбрионы перестанут плавать, удалите большую часть воды, чтобы позволить эмбрионам лежать на боку. Используя пипетку с тонкой мягкой кистью, прикрепленной к ее концу, выровнять эмбрионы, чтобы они лежали с передней облицовкой вперед и только один глаз виден.Используя 2X-увеличение, захватывайте изображения всего эмбриона на красных, синих и брайтфилдных каналах. Чтобы захватить область хвоста, изображение эмбрионов на 6.4X увеличение. Сосредоточьте эмбрион под красным каналом, чтобы избежать кровотечения наночастиц.Сразу после визуализации добавьте пресную рыбную воду в эмбрионы и верните их в инкубатор. Инъекционные и контроль эмбрионов зебры были изображены с помощью флуоресцентного микроскопа. Красные точки являются метастатическими раковыми клетками шейки матки человека, в то время как синие точки представляют собой наночастицы.В одной контрольной группе, зебрафиш, которые были введены с раковыми клетками, но не наночастицы, флуоресцентные клетки HeLa были видны в красном канале и никаких конкретных флуоресцентных сигналов были обнаружены в синем канале. В другой контрольной группе зебрафишам вводили наночастицы, но не раковые клетки. Голубые флуоресцентные наночастицы были распределены по всей системе кровообращения.Никаких конкретных красных флоресок не было видно. Когда зебрафиш с метастазами хвоста вводили наночастицы, наложенные изображения из красных и синих каналов показывают ко-локализацию клеток HeLa и наночастиц. После выполнения этого метода, мы можем проанализировать бремя опухоли и выживаемость раковых клеток, животных с и без инъекций наночастиц, чтобы скорректировать их способность убивать раковые клетки.Этот метод может облегчить выбор оптимальной наночастицы, которые могут конкретно распознавать раковые клетки in vivo, что приводит к раннему выявлению рака и метастазов рака.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Антираковая Эффективность фотодинамической терапии рака легких с таргетингом наночастицами

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Инвазивные поведение клеток рака молочной железы человека в эмбриональном данио рерио

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

В естественных условиях ЭПР Оценка рН, pO2, окислительно-восстановительного состояния и концентрации фосфатов и глутатиона в микроокружения опухоли

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A (plCSA)-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A plCSA-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Синтез и характеристика плаценты хондроитин сульфат (plCSA) - ориентация липидов - полимер наночастиц

An effective cancer therapeutic method reduces and eliminates tumors with minimal systemic toxicity. Actively targeting nanoparticles offer a promising ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

В Vivo изображений и количественного пребывания ангиогенных ответ в опухоли зебрафиш ксенотрансплантатов

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Полуавтоматический PD-L1 Характеристика и перечисление циркулирующих опухолевых клеток от немелкоклеточных больных раком легких по иммунофлуоресценции

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Оценка онкогенной трансформации в эпителиальных клетках молочной железы человека

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Химическая конъюгация очищенного антитела, направленного на DEC-205, с полноразмерным белком для нацеливания на дендритные клетки мышей in vitro и in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Оценка противоопухолевой активности полиангидридных наночастиц IL-1α in vivo

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Флуоресцентная микроскопия для интернализации АТФ, опосредованной макропиноцитозом в опухолевых клетках человека и опухоле-ксенотрансплантированных мышах

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...