Name: in vivo targeting of xenografted human cancer cells with functionalized fluorescent silica nanoparticles in zebrafish
Uploaded: 2020-05-08T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish at JoVE.com

Författarna tackar Ms Kaylee Smith, Ms Lauren Kwok, och Mr Alexander Floru för korrekturläsning av manuskriptet. H.F. erkänner bidragsstöd från NIH (CA134743 och CA215059), American Cancer Society (RSG-17-204 01-TBG) och St Baldrick's Foundation. F.J.F.L. erkänner ett stipendium från Boston University Innovation Center-BUnano tvärvetenskaplig utbildning i nanoteknik för cancer (XTNC). I.S erkänner NSF-stöd (grant CBET 1605405) och NIH R41AI142890.

Alla djurprocedurer godkändes av Institutionskommittén för djurvård och användning (IACUC) vid Boston University School of Medicine enligt protokollet #: PROTO201800543.
1. Generering av embryon från Caspers zebrafiskar
<ol><li>Välj vuxna Casper fisk som är minst 3 månaders ålder för naturlig avel att generera transparent Casper zebrafish embryon.</li>
	<li>Fyll parningstankar med två kammare med fiskvatten på kvällen, separera de övre tankarna med h...

<ol>
	<li>Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+carriers+for+drug+delivery+in+cancer.">Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer.</a> Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).</li><li>Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+nanoparticles+for+drug+delivery+in+cancer.">Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer.</a> Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).</li><li>Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance.">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).</li><li>Chinen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+Probes+for+the+Detection+of+Cancer+Biomarkers,+Cells,+and+Tissues+by+Fluorescence.">Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence.</a> Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).</li><li>Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+mesoporous+silica+nanoparticles+for+prescreening+of+cervical+cancer.">Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer.</a> Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).</li><li>Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+engineered+mouse+models:+closing+the+gap+between+preclinical+data+and+trial+outcomes.">Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes.</a> Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).</li><li>Sharkey, F. E., Fogh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+in+the+use+of+nude+mice+for+cancer+research.">Considerations in the use of nude mice for cancer research.</a> Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).</li><li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+breast+cancer:+one+size+does+not+fit+all.">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li><li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung.">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li><li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases.">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).</li><li>Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+the+study+of+human+cancer.">Zebrafish as a model for the study of human cancer.</a> Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).</li><li>Liu, S., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+cancer.">Zebrafish models for cancer.</a> Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).</li><li>Anderson, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TCA+cycle+transferase+DLST+is+important+for+MYC-mediated+leukemogenesis.">The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis.</a> Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).</li><li>Peerzade, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+silica+nanoparticles+for+in+vivo+targeting+of+xenografted+human+tumors+and+cancer+cells+in+zebrafish.">Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish.</a> Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).</li><li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+fluorescent+cellulose+acetate+nanoparticles+for+imaging+tumors+through+systemic+and+topical+applications.">Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications.</a> Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).</li><li>Peng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+on+ultrabright+fluorescent+cellulose+acetate+nanoparticles+for+imaging+tumors+through+systemic+and+topical+applications.">Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications.</a> Data in Brief. 22, 383-391 (2019).</li><li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+medium+and+passaging+cell+lines.">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).</li><li>Rao, P. N., Engelberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hela+Cells:+Effects+of+Temperature+on+the+Life+Cycle.">Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle.</a> Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behaviour+and+ecology+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).</li></ol>

Det protokoll som beskrivs här använder zebrafisken som ett in vivo-system för att testa nanopartiklarnas förmåga att känna igen och rikta metastaserande mänskliga cancerceller. Flera faktorer kan påverka det framgångsrika utförandet av experimenten. För det första måste embryon vara fullt utvecklade vid 48 hpf. Embryonas korrekta utvecklingsstadium gör det möjligt för dem att uthärda och överleva transplantationen av mänskliga cancerceller. Embryon yngre än 48 hpf har en betydligt lägre överlevnad ...

Utvecklingen av nanopartiklar som kan upptäcka, rikta och förstöra cancerceller är av stort intresse för både fysiker och biomedicinska forskare. Framväxten av nanomedicin ledde till utvecklingen av flera nanopartiklar, såsom de konjugerade med inriktning ligander och / eller kemoterapeutiska läkemedel1,2,3. Nanopartiklarnas tillsatta egenskaper möjliggör deras interaktion med det biologiska systemet, och avkänning och övervakning av biologiska händelser med hög effektivitet och noggrannhet tillsammans med terapeutiska tillämpningar. Nanopartiklar av guld och järnoxid används främst i datortomografi respektive magnetisk resonanstomografi. Medan den enzymatiska verksamheten av nanopartiklar av guld och järnoxid möjliggör detektering av cancerceller genom kolorometrisk analys, är fluorescerande nanopartiklar väl lämpade för in vivo-bildframställningsapplikationer4. Bland dem är ultrabright fluorescerande nanopartiklar särskilt fördelaktigt, på grund av deras förmåga att upptäcka cancer tidigt med färre partiklar och minskad toxicitet5.
Trots dessa fördelar kräver nanopartiklar experiment med hjälp av in vivo-djurmodeller för val av lämpliga nanomaterial och optimering av syntesprocessen. Dessutom, precis som droger, nanopartiklar lita på djurmodeller för prekliniska tester för att avgöra deras effekt och toxicitet. Den mest använda prekliniska modellen är musen, som är ett däggdjur vars underhåll kommer till en relativt hög kostnad. För cancerstudier används antingen genetiskt modifierade möss eller xenografted möss vanligtvis6,7. Längden på dessa experiment sträcker sig ofta från veckor till månader. I synnerhet för cancer metastasering studier, cancerceller direkt injiceras i cirkulationssystemet av mössen på platser som svans vener och mjälte8,9,10. Dessa modeller representerar bara slutet stadier av metastasering när tumörceller extravasera och kolonisera avlägsna organ. Dessutom, på grund av synlighet frågor, Det är särskilt utmanande att övervaka tumörcell migration och nanopartikel inriktning av tumörceller hos möss.
Den zebrafisk (Danio rerio) har blivit ett kraftfullt ryggradsdjur system för cancerforskning på grund av dess höga fruktbarhet, låg kostnad, snabb utveckling, optisk öppenhet, och genetiska bevaranden11,12. En annan fördel med zebrafisken över musmodellen är befruktningen av fiskäggen ex utero, vilket gör att embryona kan övervakas under hela sin utveckling. Embryonal utveckling är snabb i zebrafisk, och inom 24 timmar postfertilization (hpf), ryggradsdjur kropp planet har redan bildat13. Med 72 hpf kläcks ägg från chorion, övergång från embryonala till yngel scenen. Transparensen i zebrafisken, Casper stammen i synnerhet 14, ger en unik möjlighet att visualisera migration av cancerceller och deras erkännande och inriktning av nanopartiklar i ett levande djur. Slutligen, zebrafisk utveckla sina medfödda immunförsvar med 48 hpf, med adaptiva immunsystemet släpar efter och bara blir funktionella på 28 dagar postfertilization15. Denna tidslucka är idealisk för transplantation av olika typer av mänskliga cancerceller till zebrafisk embryon utan att uppleva immun avstötningar.
Beskrivs här är en metod som drar nytta av transparens och snabb utveckling av zebrafisk att visa erkännande och inriktning av mänskliga cancerceller genom fluorescerande nanopartiklar in vivo. I denna analys, mänskliga livmoderhalscancer celler (HeLa celler) genetiskt konstruerad för att uttrycka en röd fluorescerande protein injicerades i det vaskulariserade området i perivitelline hålighet 48 hpf embryon. Efter 20-24 h hade HeLa-celler redan spridit sig över embryona genom fiskcirkulationssystemet. Embryon med skenbar metastasering var microinjected med ~ 0,5 nL av en nanopartikel lösning direkt bakom ögat, där den rika kapillär säng är belägen. Med hjälp av denna teknik kan de ultrabright fluorescerande kiseldioxidnanopartiklarna rikta in sig på HeLa-celler så snabbt som 20-30 min postinjektion. På grund av sin enkelhet och effektivitet representerar zebrafisken en robust in vivo-modell för att testa en mängd olika nanopartiklar för deras förmåga att rikta specifika cancerceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>KSE scientific</td>
			<td>BMK-A1705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1.0 mm O.D. x 0,78 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer and monitor</td>
			<td>ThinkCentre</td>
			<td>X000335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>35960-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>02-671-51B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MMPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Puller</td>
			<td>Sutter instruments</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus MVX-10 fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 tip</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/corning-universal-fit-pipet-tips-bulk-packed-6/07200293?keyword=true" target="_blank">07-200-293</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>SB93102</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>50-998-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.addgene.org/113726/" target="_blank">pLenti6.2_miRFP670</a></td>
			<td>Addgene</td>
			<td>13726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic pico pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYSPV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche-Sigma-Fisher</td>
			<td>50-100-3275</td>
			<td>Roche product made by Sigma- sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZ51 dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Western Chemicals</td>
			<td>NC0872873</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25053CI</td>
			<td>sold by Fisher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Fishersci brand</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo targeting of xenografted human cancer cells with functionalized fluorescent silica nanoparticles in zebrafish

Att utveckla nanopartiklar som kan upptäcka, rikta in sig på och förstöra cancerceller är av stort intresse inom nanomedicinens område. In vivo djurmodeller krävs för att överbrygga nanotekniken till dess biomedicinska tillämpning. Musen representerar den traditionella djurmodellen för preklinisk testning; mus är dock relativt dyra att behålla och har långa experimentella cykler på grund av den begränsade avkomman från varje mor. Zebrafisken har vuxit fram som ett kraftfullt modellsystem för utvecklings- och biomedicinsk forskning, inklusive cancerforskning. Särskilt på grund av sin optiska öppenhet och snabba utveckling, zebrafisk embryon är väl lämpade för realtid in vivo övervakning av beteendet hos cancerceller och deras interaktioner med deras mikromiljö. Denna metod har utvecklats för att sekventiellt införa mänskliga cancerceller och funktionaliserade nanopartiklar i transparenta Casper zebrafish embryon och övervaka in vivo erkännande och inriktning av cancercellerna av nanopartiklar i realtid. Detta optimerade protokoll visar att fluorescerande märkta nanopartiklar, som är funktionaliserade med folatgrupper, specifikt kan känna igen och rikta metastaserande mänskliga livmoderhalscancer epitelceller märkt med en annan fluorokrom. Igenkännings- och målprocessen kan ske så tidigt som 30 min postinjection av de testade nanopartiklarna. Hela försöket kräver endast avel av några par vuxna fiskar och tar mindre än 4 dagar att slutföra. Dessutom zebrafisk embryon saknar en funktionell adaptiv immunsystemet, vilket möjliggör engraftment av ett brett spektrum av mänskliga cancerceller. Därför möjliggör nyttan av det protokoll som beskrivs här testning av nanopartiklar på olika typer av mänskliga cancerceller, vilket underlättar valet av optimala nanopartiklar i varje specifikt cancersammanhang för framtida tester hos däggdjur och kliniken.

Protokollet schematisk i figur 1 illustrerar de övergripande förfarandena för denna studie. Transparent Casper manliga och kvinnliga vuxna fisk var uppfödda för att generera embryon (avsnitt 1). RFP+ HeLa celler injicerades i det vascularized området under perivitelline håligheten av de zebrafish embryon vid 48 hpf, med uninjected embryon som kontroller (avsnitt 3). För individer som har erfarenhet av mikroinjektion är överlevnadsgraden fö...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish at JoVE.com

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Beskrivs här är en metod för att utnyttja zebrafisk embryon för att studera förmågan hos funktionaliserade nanopartiklar att rikta mänskliga cancerceller in vivo. Denna metod möjliggör utvärdering och urval av optimala nanopartiklar för framtida tester på stora djur och i kliniska prövningar.

In Vivo Targeting av Xenografted Human Cancer Cells med functionalized Fluorescent Silica Nanopartiklar i Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Detta förfarande gör det möjligt för forskare att utvärdera och välja optimala nano-partiklar för studier i stora djur och kliniska prövningar. Denna enkla metod hjälper till att avgöra om nanopartikeln kan rikta de mänskliga cancerceller in vivo och i så fall hur effektiv inriktningen är. Demonstrera förfarandena kommer att Dr.Xiodan Qin, en postdoc, och Mr.Andrew Lam, en forskningstekniker från vårt labb.Fyll två kammarmattankar med fiskvatten på kvällen och separera de övre tankarna med hjälp av avdelare. Placera en manlig zebrafisk i ena sidan av kammaren och en eller två honor zebrafisk i en annan sida av kammaren. Ta bort avdelarna klockan 8:00 följande morgon.Lägg till konstgjorda anrikningsanläggningar och luta den övre kammaren något för att skapa ett grunt vattenområde. Låt zebrafisken häcka i tre till fyra timmar och samla äggen från bottenkammaren genom att hälla vattnet genom ett nätnät. Överför äggen till en petriskål med högst 200 ägg per fat.Ta bort alla döda eller obefruktade ägg. Fyll skålen två tredjedelar full med färsk fisk vatten, och placera den i inkubatorn. Efter 24 timmar, ta bort skålen från inkubatorn och ta bort så mycket vatten som möjligt från skålen.Tillsätt några droppar av ett milligram per milliliter pronase lösning och försiktigt snurra skålen. När chorions visar tecken på sönderfall, pipetter embryona upp och ner några gånger för att bryta ner chorions och släppa embryon. När majoriteten av embryona är ur chorions, omedelbart lägga till färsk fisk vatten för att avsluta processen.Skölj embryona med fiskvatten tre gånger för att avlägsna de flytande chorionerna Återför embryona till ruvmaskinen. Gör en 3%agaroslösning genom att tillsätta tre gram elektrofores-grade agaros till 100 milliliter av autoklaverat fiskvatten. Mikrovågsugn agaros och vatten tills agaros är helt upplöst.För att skapa injektionsplattan, häll varm agaroslösning i en Petri-skål tills den är tre fjärdedelar full och placera mikroinformen på agaros. Efter agarose har stelnat, försiktigt bort formen. Fyll den resulterande injektionsplattan med autoklaverat fiskvatten och förvara den i fyra grader Celsius.För att göra injektionsnålarna, dra borosilikat glas kapillärer en millimeters ytterdiameter med 0,78 millimeter på en pipett puller. Förvara injektionsnålarna på stylt i en stor petriskål som har torkats av med en etanolhandduk. Innan du skördar HeLa-cellerna, varvar du om injektionsplattan och fiskar vatten i inkubatorn vid 35,5 grader Celsius.30 minuter till en timme före transplantation, skörda HeLa-cellerna. Arbeta i en vävnadskultur huva, ta bort mediet från kolven genom aspiration. Skölj cellerna med steril PBS för att avlägsna alla spår av mediet.Tillsätt tre milliliter steril trypsin EDTA till kolven och inkubera den i 37 grader Celsius i tre till fem minuter. Observera kolven under mikroskopet för att övervaka hur enzymatisk matsmältning fortskrider. När ungefär 80%av cellerna är upphängda, tillsätt sex till åtta milliliter tillväxtmedium till kolven.Samla in cellerna genom pipettering försiktigt och överföra dem till en 15 milliliter sterila röret. Centrifugera röret vid 135 gånger G i fem minuter. Aspirera supernatanten och resuspend helacellerna i tre milliliter av färdigt tillväxtmedel.Efter att ha upprepat tvättstegen två gånger, resuspend cellerna i en milliliter av komplett tillväxtmedium. Räkna sedan cellerna under mikroskopet med hjälp av en hemocytometer. Efter centrifugering av cellerna igen, ta bort supernatanten.Resuspend cellerna i en 1,5 milliliter microcentrifuge rör vid en koncentration av fem gånger 10 till sjunde celler per milliliter. Håll cellerna varma genom att hålla röret i ena handen när du transporterar till fiskanläggningen. Placera zebrafiskembryonen på injektionsplattan med hjälp av en plastpipett.Lägg embryon på sina sidor med den främre vänd framåt anpassas till spåren på plattan. Sätt på luftkällan och mikroinjektorn. Efter att ha hämtat HeLa-cellerna från inkubatorn, pipettera cellerna upp och ner 20 till 30 gånger med hjälp av en P200.Med hjälp av en gel lastningsspets med en avskuren ände, ladda omedelbart tre mikroliter av HeLa-cellens suspension i en av injektionsnålarna. Stick in nålen i nålhållaren och placera injektionsplattan under mikroskopet. Injicera cellblandningen i embryot vid det vascularized området under perivitellin hålrummet genom att trycka på fotpedalen.Sedan pipettera några droppar sterilt fiskvatten på embryot. För att fortsätta injektionsprocessen, använd den icke-dominerande handen för att flytta injektionsplattan till nästa embryo, och använd sedan den dominerande handen för att förlänga och dra tillbaka injektorn samtidigt som du trycker på fotpedalen. Avsluta injektion av alla embryon på tallriken och tvätta embryona med sterilt fiskvatten till en steril petriskål.Omedelbart inkubera skålen på 35,5 grader Celsius. Efter tre timmar, undersöka de injicerade embryon och ta bort de döda. Nästa dag gör injektionsnålar för nanopartiklarna och förvara dem på snackel i en stor petriskål.Arbeta under ett fluorescerande mikroskop, försiktigt plocka upp embryon med svans metastaser och placera dem på en ny injektion platta med steril fisk vatten. För varje zebrafisk med en svansmetastas, injicera antingen nano-partikellösning eller vatten bakom ögat. Injicera också nanopartikellösning bakom ögonen på zebrafisken i kontrollgruppen som inte fick HeLa-transplantationer och inkuberade alla de injicerade embryona vid 35,5 grader Celsius.Omedelbart efter injektionen och igen med 30 till 60 minuters intervall, överför två till tre embryon till en Petriskål och immobilisera dem genom att tillsätta fem droppar utspädd MS222-lösning. När embryona slutar simma, ta bort det mesta av vattnet så att embryona att ligga på sina sidor. Använd en pipett med en tunn mjuk borste fäst vid sin ände, rikta embryona så att de ligger med den främre framåt och bara ett öga synligt.Med hjälp av 2X förstoring, fånga bilder av hela embryot på röda, blå, och Brightfield kanaler. För att fånga svansen området, bild embryona på 6.4X förstoring. Fokusera embryot under den röda kanalen för att undvika blödning av nano-partiklar.Omedelbart efter avbildning, tillsätt färsk fisk vatten till embryona och returnera dem till inkubatorn. Injicerade och kontroll zebrafisk embryon avbildades med hjälp av ett fluorescerande mikroskop. De röda prickarna är metastaserande mänskliga livmoderhalscancer celler medan de blå prickar representerar nano-partiklar.I en kontrollgrupp, zebrafiskar som injicerades med cancerceller men inte nano-partiklar, fluorescerande HeLa celler var synliga i den röda kanalen och inga specifika fluorescerande signaler upptäcktes i den blå kanalen. I den andra kontrollgruppen injicerades zebrafiskar med nanopartiklar, men inte med cancerceller. Blå fluorescerande nano-partiklar fördelades i hela cirkulationssystemet.Ingen specifik röd florescens var synlig. När zebrafisk med svansmetastaser injicerades med nanopartiklar visar överlagrada bilder från de röda och blå kanalerna samlokalisering av HeLa-celler och nanopartiklar. Efter att ha utfört denna metod kan vi analysera tumörbörda och cancercellöverlevnad, djuren med och utan att injicera nanopartiklar för att justera deras förmåga att döda cancerceller.Denna teknik kan underlätta valet av den optimala nanopartikel som specifikt kan känna igen cancercellen in vivo som leder till tidig upptäckt av cancer och cancer metastasering.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Anticancer Effekten av fotodynamisk terapi med lungcancer-Targeted Nanopartiklar

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasiv Beteende av humana bröstcancerceller i embryonal zebrafisk

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A (plCSA)-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A plCSA-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

Syntes och karakterisering av placenta Chondroitin Sulfate en (plCSA) - Targeting Lipid - polymera nanopartiklar

An effective cancer therapeutic method reduces and eliminates tumors with minimal systemic toxicity. Actively targeting nanoparticles offer a promising ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

In vivo avbildning och kvantifiering av värdens angiogena respons i Zebrafish Tumörxenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering och uppräkning av cirkulerande tumörceller från icke-småcellig Lung cancer patienter genom Immunofluorescensering

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Utvärdering av Oncogenic Transformation i mänskliga mammary Epitelial celler

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Kemisk konjugation av en renad DEC-205-riktad antikropp med fulllängdsprotein för inriktning på mus dendritiska celler in vitro och in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Utvärdering av in vivo antitumöraktivitet av polyanhydrid IL-1α nanopartiklar

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Fluorescensmikroskopi för ATP-internalisering medierad av makropinocytos hos mänskliga tumörceller och tumör-xenograferade möss

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...