Name: neuronal differentiation from mouse embryonic stem cells in vitro
Uploaded: 2020-06-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro at JoVE.com

이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(31501099호)과 중국 후베이성 교육부중장기 및 영(No. 20191104년). 그리고, 우리는 마우스 배아 줄기 세포주 A2lox를 제공하는 우한 과학 기술 대학의 웬성 덩 교수에게 감사드립니다.

1. 마우스 배아 줄기 세포 배양
<ol><li>0.1% 젤라틴 코팅 세포 배양 접시 또는 접시를 준비하십시오.<ol>
<li>멸균 된 0.1 % 젤라틴 (물에서 0.1 % w / v)의 2 mL을 60mm 세포 배양 접시에 추가하십시오. 셀 배양 접시의 코팅도 보장하기 위해 부드럽게 흔들어.</li>
		<li>37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 접시를 넣고 1시간 동안 코팅할 수 있습니다.</li>
		<li>세포를 파종하기 전에 0.1% 젤라틴 용액을 제거합니다...

<ol>
	<li>Vieira, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+differentiation+into+mature+neurons:+mechanisms+of+regulation+and+biotechnological+applications.">Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).</li><li>Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+embryonic+stem+cells+on+Parkinson's+disease+therapy.">Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy.</a> Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).</li><li>Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. 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(99), e52823 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+neuronal+differentiation+of+embryonic+stem+cells+in+vitro.">An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+optimal+suspension+culture+time+for+the+osteoblastic+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+the+embryoid+body+method.">Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).</li><li>Lu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-trans+retinoic+acid+promotes+neural+lineage+entry+by+pluripotent+embryonic+stem+cells+via+multiple+pathways.">All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways.</a> BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).</li><li>Kanungo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+in+P19+stem+cell+differentiation.">Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).</li><li>Rochette-Egly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+and+mouse+embryonic+stem+cell+differentiation:+Cross+talk+between+genomic+and+non-genomic+effects+of+RA.">Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+maintains+self-renewal+of+murine+embryonic+stem+cells+via+a+feedback+mechanism.">Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism.</a> Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).</li><li>Wu, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-induced+upregulation+of+miR-219+promotes+the+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+cells.">Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells.</a> Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+regulates+germ+cell+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+through+a+Smad-dependent+pathway.">Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).</li><li>Nakayama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+neuronal+induction+of+the+P19+embryonic+carcinoma+cell+line.">A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line.</a> Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).</li><li>Bibel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+a+defined+neuronal+lineage.">Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage.</a> Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).</li><li>Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+Differentiation+of+Retinoic+Acid-Induced+Human+Pluripotent+Embryonic+Carcinoma+Stem+Cell+Neurons.">Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons.</a> PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).</li><li>Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic-acid-concentration-dependent+acquisition+of+neural+cell+identity+during+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).</li></ol>

본 연구에서는, 우리는 mESC에서 신경 분화를 위한 간단하고 효과적인 방법을 설치했습니다, 저렴한 비용과 쉽게 얻을 수 있는 물질. 이 방법에서, RA 유도6일 뒤에 배아체 형성의 2일은 효과적으로 NPC로 mESC의 분화를 촉진할 수 있다 (단계 I-프로토콜 3). 상 II 분화의 경우, N2B27 배지 II(Phase II-프로토콜 3)는 NPC로부터 뉴런으로의 분화를 가장 효과적으로 유도한다. 성공을 보장하기 위해 몇 가지 중요한...

배아 줄기 세포 (ESC)는 다능하며 신경 전구체 세포 (NPC)로 분화하고 특정 조건1하에서뉴런으로 분화 할 수 있습니다. ESC 기반 신경 발생은 신경 발생을 모방하는 최고의 플랫폼을 제공하므로 발달 생물학 연구를위한 유용한 도구로 봉사하고 잠재적으로 재생 의학2,3에도움이됩니다. 지난 수십 년 동안, 형질전환법(4)과 같은 배아 신경발생을 유도하기 위한 많은 전략이 보고되었으며, 소분자5를이용하여, 3D 매트릭스 마이크로환경6,공동배양기술7을이용하여 보고되었다. 그러나 이러한 프로토콜의 대부분은 조건이 제한적이거나 작동하기 어렵기 때문에 대부분의 실험실에서 의사용에 적합하지 않습니다.
mESC로부터 효율적인 신경 분화를 달성하기 위한 조작이 용이하고 저렴한 방법을 찾기 위해, 여기에 조합 선별 전략이 사용되었습니다. 도 1에설명된 바와 같이, 배아 신경 발생의 전체 과정은 2단계로 나뉘었다. 1단계는 MESC에서 NPC로의 분화 과정을 말하며, 위상 II는 NPC에서 뉴런으로의 후속 분화와 관련이 있습니다. 간편한 작동, 저렴한 비용, 용이한 재료 및 높은 분화 효율의 원리에 기초하여, 단계 I의 7개의 프로토콜과 단계 II의 3개의 프로토콜은 전통적인 부착단 단층 배양 시스템 또는 배아 체형성 시스템8,9에기초하여 선택되었다. 두 단계에서 프로토콜의 분화 효율은 세포 형태 관찰 및 면역 형광 분석을 사용하여 평가되었다. 각 단계에서 가장 효율적인 프로토콜을 결합하여 mESC에서 신경 분화를 위한 최적화된 방법을 수립했습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin antibody [Rat-401]</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab11306</td>
			<td>stored at -80 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;-Tubulin III antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2200</td>
			<td>stored at -80 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0428</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, and protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021 (CT99021)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1263</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>NEST</td>
			<td>801007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0516</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DME/F-12 1:1 (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.01B</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>CM0635B</td>
			<td>stored at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0103</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12660012</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5283</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>stored at 4 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140076</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonadhesive bacterial dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30256.01B</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/ Streptomycin Solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901(Mirdametinib)</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1036</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td>stored at -80 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>MUAES-01001</td>
			<td>Maintained in feeder-free culture system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem-Cellbanker (DMSO free)</td>
			<td>ZENOAQ</td>
			<td>stem cellbanker DMSO free</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% (1X) Solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985023</td>
			<td>stored at 4 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0098</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 - well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tube</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neuronal differentiation from mouse embryonic stem cells in vitro

마우스 배아 줄기 세포 (mESC)의 신경 분화는 신경 발생에 관련 되 고 잠재적으로 재생 의학에 도움이 되는 주요 메커니즘을 해명 하기 위한 잠재적인 도구. 여기서 는 편생스크리닝 전략을사용하여 체외에서 mESC로부터 뉴런 분화를 위한 효율적이고 저렴한 비용 방법을 확립했습니다. 여기에 정의된 조건하에서, 2일 배아 체형성 + 6일 망막산 유도 프로토콜은 잘 쌓인 및 중성염과 같은 A2lox 및 129개의 유도체의 형성에 의해 볼 수 있듯이 mESC에서 신경 전구체 세포(NPC)로 빠르고 효율적인 분화를 허용합니다. 배아 체의 건강한 상태와 레티노산(RA)이 적용되는 시점뿐만 아니라 RA 농도는 이 과정에서 매우 중요합니다. NPC에서 뉴런으로 의 후속 분화에서, N2B27 중간 II (신경 물질 매체에 의해 보충) 더 나은 장기 유지 보수 및 신경 세포의 성숙을 지원할 수 있습니다. 제시된 방법은 매우 효율적이고, 비용이 낮으며, 작동이 용이하며, 신경생물학 및 발달 생물학 연구를 위한 강력한 도구가 될 수 있습니다.

2일 배아체 형성 + 6일 RA 유도는 MESC를 NPC로 분화시키는 데 가장 적합합니다(1상). MESC를 NPC(Phase I)로 균등화하는 최적의 프로토콜을 결정하기 위해, 7개의 프로토콜은 A2lox 및 129mESC(표1)에서모두 테스트되었으며 각 그룹의 분화 상태는 광 현미경을 사용하여 모니터링하였다. 도 3A에도시된 바와 같이, 대부분의 A2lox 및 129 유도체는 "2일 배아 체형성 + 6일 RA 유도" 치?...

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Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

연구

신경과학

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

Purification of Prominin-1+ Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum

출생 후 마우스 소뇌에서 프로미닌-1+ 줄기 세포의 정화

Most cerebellar neurons arise from two embryonic stem niches: a rhombic lip niche, which generates all the cerebellar excitatory glutamatergic neurons, ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

생체 내 신경 회로 연결성 모방을 위한 체외 쐐기 슬라이스 준비

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

섬유아세포에서 신경 전구세포로의 직접 변환을 이용한 신경질환 시험관 모델링 및 성상세포로의 분화

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...