Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

ونحن نعترف DFG (KI-1988/5-1 إلى JK, NeuroCure دكتوراه الزمالة من قبل مجموعة NeuroCure التميز إلى MLP) للتمويل. كما أننا نعترف بمرفق التصوير الأساسي التابع لمعهد أبحاث لايبنتز لعلم الأدوية الجزيئية في برلين (FMP) لتوفيره التصوير. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر ديوغو فيليسيانو الذي أنشأ نظام Dendra2 في المختبر وقدم التعليمات.

1. جيل من C. elegans التعبير عن العصبية هنتتين- Dendra2 البروتين الانصهار
<ol><li>استنساخ الجين ترميز POI في اتجاه تعبير نعمة (أي، pPD95_75، أدجين #1494)، عن طريق انزيم تقييد التقليدية هضم10، جيبسون الجمعية11، أو أي طريقة للاختيار. إدراج المروج لدفع التعبير في الأنسجة المطلوبة أو...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).</li><li>Kreis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylation+of+the+actin-binding+protein+drebrin+controls+oxidation+stress-resistance+in+mammalian+neurons+and+C.+elegans.">ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ubiquitinated+huntingtin+species+in+intracellular+aggregates.">Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).</li><li>Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo.">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+and+analysis+of+age-related+changes+in+Caenorhabditis+elegans.">The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+the+nervous+system.">Specification of the nervous system.</a> WormBook. , 1-19 (2005).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration?.">What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).</li><li>Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+enhanced+photoconversion+yield+in+green+fluorescent+protein-like+protein+Dendra2.">Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2.</a> Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).</li><li>Tsvetkov, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteostasis+of+polyglutamine+varies+among+neurons+and+predicts+neurodegeneration.">Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration.</a> Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).</li><li>Feleciano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis.">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).</li><li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells.">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li></ol>

لفهم وظيفة البروتين من المهم أن نفهم تركيبها، والموقع، والتدهور. مع تطور الرواية ، ومستقرة ، ومشرقة FPs ، تصور ورصد الملوثات العضوية الثابتة أصبحت أسهل وأكثر كفاءة. PAFPs الانصهار أعرب عنها وراثيا مثل Dendra2 هي في وضع فريد لدراسة استقرار POI. عند التعرض للضوء الأرجواني والأزرق، فواصل Dendra2 في مكان ?...

البروتيوم للكائن الحي هو تجديد نفسها باستمرار. البروتينات هي المتدهورة باستمرار وتوليف وفقا للطلب الفسيولوجي للخلية. يتم القضاء على بعض البروتينات بسرعة، في حين أن البعض الآخر أطول عمرا. إن مراقبة ديناميكيات البروتين هي مهمة أبسط وأكثر دقة وأقل توغلاً عند استخدام البروتينات الفلورية المشفرة وراثياً. FPs شكل autocatalytically ويمكن أن تنصهر على أي بروتين من الفائدة (POI)، ولكن لا تتطلب الإنزيمات لطي أو الحاجة إلى العوامل المساعدة حفظ للأكسجين1. وقد تم مؤخرا تصميم جيل أحدث من FPs للتبديل لون عند التشعيع مع نبضة ضوء من الطول الموجي المحدد. هذه FPs القابلة للتكف عن (PAFPs) تسمح لوضع العلامات وتتبع POIs، أو العضيات أو الخلايا التي يقيمون فيها، ودراسة المعلمات الكمية و/ أو النوعية الخاصة بهم2. تتيح أجهزة FPs إمكانية تتبع حركة أي POI ، واتجاهها ، ومعدل الحركة ، ومعامل الانتشار ، والمتنقلة مقابل الكسور غير المتحركة ، والوقت الذي تتواجد فيه في مقصورة خلوية واحدة ، وكذلك معدل دورانها. بالنسبة لعضيات محددة ، يمكن تحديد الحركة والنقل ، أو الانشطار وأحداث الانصهار. بالنسبة لنوع خلية معين، يمكن تأسيس موضع الخلية ومعدل الانقسام والحجم والشكل. والأهم من ذلك أن استخدام PAFPs يسمح بالتتبع دون تصور مستمر ودون تدخل من أي مسبار مُنَسَك حديثاً. وقد استخدمت الدراسات في كل من الخلايا والكائنات الحية بأكملها بنجاح PAFPs لمعالجة المسائل البيولوجية في الجسم الحي، مثل تطور السرطان والنقائل، والتجمع أو تفكيك الهيكل الخلوي، والتفاعلات الحمض النووي الريبي/البروتين3. في هذه المخطوطة، يتم استخدام المجهر الخفيف وPAFPs للكشف عن معدلات دوران البروتينات المعرضة للتجميع huntingtin (HTT) في الجسم الحي في نموذج C. elegans من الأمراض العصبية.
البروتوكول الموصوف هنا يحدد كميّاً استقرار وتدهور البروتين الإنصهار huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 هو الجيل الثاني من أحادية الحروف PAFP4 أن تبديل لا رجعة فيه الانبعاثات / الإثارة أطياف من الأخضر إلى الأحمر استجابة للأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق المرئي، مع زيادة في شدتها تصل إلى 4،000 أضعاف5،6. Huntingtin هو البروتين المسؤول عن التسبب في مرض هنتنغتون (HD) ، وهو اضطراب وراثي وراثي قاتل. Huntingtin exon-1 يحتوي على امتداد الجلوتامين (CAG، Q). عندما يتم التعبير عن البروتين مع أكثر من 39Q، فإنه يخطئ في البروتين متحولة، سامة، و المسببة للأمراض. HTT متحولة عرضة للتجميع ويؤدي إلى موت الخلايا العصبية والانحطاط، إما كالأنواع القلوية القصيرة أو أكبر اميلويدات منظم للغاية7.
الخيطية هو نظام نموذجي لدراسة الشيخوخة والتنكس العصبي بفضل سهولة التلاعب بها ، وطبيعة الأيزوجيني ، وعمرها القصير ، وشفافيتها البصرية8. لدراسة استقرار HTT في الجسم الحي، وأعرب عن بناء الانصهار في الجهاز العصبي من C. elegans. A HTT-D2 transgene التي تحتوي إما على امتداد الفسيولوجية من 25Qs (HTTQ25-D2) أو امتداد المرضية من 97Qs (HTTQ97-D2) هو overexed عموم العصبية في جميع أنحاء حياة الخيطية9. من خلال إخضاع العيش C. elegans إلى نقطة وجيزة ومركزة من الضوء، يتم photoswitched خلية عصبية واحدة ويتم تعقب HTT-D2 تحويلها مع مرور الوقت. لتحديد كمية HTT-D2 المتدهورة، يتم مقارنة الفرق بين الإشارة الحمراء من HTT-D2 المحولة حديثا إلى الإشارة الحمراء المتبقية من HTT-D2 بعد فترة زمنية محددة. ولذلك ، يصبح من الممكن التحقيق في كيفية تدهور huntingtin عندما وجدت في شكلها الموسع والسامة مقارنة بشكلها الفسيولوجية ؛ كيف تستجيب الخلايا العصبية الأمامية أو الخلفية بشكل مختلف لوجود Q97 مقابل Q25 ، خاصة خلال فترات زمنية طويلة ؛ وكيف أن انهيار شبكة البروتيوستاسيس (PN) أثناء الشيخوخة يساهم في الاختلافات في معدلات التدهور. هذه النتائج تصف فقط مجموعة صغيرة من الملاحظات على دوران HTT-D2. ومع ذلك، يمكن معالجة العديد من المسائل البيولوجية المتعلقة بكل من مجال تجميع البروتينات وبروتيوستاسيس بهذا في تطبيق vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

يتم تصنيع البروتينات وتحللها باستمرار داخل الخلية للحفاظ على التوازن. القدرة على رصد تدهور البروتين من الفائدة هو المفتاح لفهم دورة حياتها، ولكن أيضا للكشف عن الاختلالات في شبكة بروتيوستاسيس. هذه الطريقة تبين كيفية تتبع تدهور البروتين المسبب للمرض huntingtin. يتم التعبير عن نسختين من huntingtin تنصهر إلى Dendra2 في الجهاز العصبي C. elegans: نسخة فسيولوجية أو واحدة مع امتداد موسع وممرض من الجلوتامين. Dendra2 هو بروتين فلوري قابل للفوتونات؛ بناء على الأشعة فوق البنفسجية قصيرة (UV) نبض الإشعاع، Dendra2 تبديل أطيافها الإثارة / الانبعاث من الأخضر إلى الأحمر. على غرار تجربة مطاردة النبض، يمكن رصد دوران Dendra2 الحمراء المحولة وتحديدها كميا، بغض النظر عن التداخل من الناحية الحديثة التي تم تصنيعها من نوع Green-Dendra2. باستخدام المجهر القائم على confocal ونظرا للشفافية البصرية من C. elegans، فمن الممكن لرصد وقياس تدهور هنتتين ديندرا2 في كائن حي ، والشيخوخة. يتم تدهور جزئيا هنتبينين العصبي-Dendra2 بعد فترة وجيزة من التحويل وتطهيرها أكثر مع مرور الوقت. النظم التي تتحكم في التدهور هي نقص في وجود هنتتينين متحولة والمزيد من ضعف مع الشيخوخة. الأنواع الفرعية العصبية داخل الجهاز العصبي نفسه يحمل قدرات دوران مختلفة ل huntingtin-Dendra2. عموما، رصد أي بروتين الفائدة تنصهر إلى Dendra2 يمكن أن توفر معلومات هامة ليس فقط على تدهورها واللاعبين من شبكة proteostasis المعنية، ولكن أيضا على موقعها، والاتجار بها، والنقل.

تم الحصول على اثنين من سلالات الخيطيات التي تعبر عن جزء البروتين exon-1 huntingtin في الإطار مع البروتين الضوئي Dendra2 عن طريق الحقن المجهري وتم الاحتفاظ بها كمادة خارجية. تم التعبير عن بناء الانصهار في الجهاز العصبي C. elegans كله من التنمية في جميع أنحاء الشيخوخة. هنا، HTT-D2 تحتوي ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

هنا هو بروتوكول لرصد تدهور البروتين huntingtin تنصهر على الفلوروفور Dendra2 القابلة للفوتونات.

في فيفو الكم من دوران البروتين في الشيخوخة C. Elegans باستخدام Dendra2 قابلة للفوتونات

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

يسمح هذا البروتوكول بتتبع و تحديد كمية تدهور البروتين من الاهتمام في العيش والشيخوخة C.elegans. هذا في تقنية vivo وغير باضع يتطلب فقط المجهر قليلاً التي أنشئت لتحويل موثوق Dendra2 إلى الفلوروف مشرق ومستقر. وهذه الطريقة قابلة للتكيف مع نظم الثدييات، وكذلك سمك الحمار الوحشي.للدراسة، وضع في دوران داخل شبكة proteostatis، فضلا عن النقل والاتجار. الحرص على عدم إثارة التحويل غير المرغوب فيه من Dendra2 أثناء المسح الضوئي مع الليزر الضوء الأزرق، واختبار وتحسين إعدادات الاستحواذ وإعدادات التحويل لكل نظام والبروتين الانصهار. تبدأ من خلال زراعة الديدان الخيطية المطابقة للعمر عند 20 درجة مئوية إلى السن المطلوبة للتجربة.في يوم تجربة التصوير، تذوب أغاروز الصف العام في تركيز 3٪في الماء المقطر مزدوجة. في حين أن agarose هو التبريد، وقطع غيض من طرف ماصة ملليلتر واحد لتسهيل طموح ما يقرب من 400 ميكرولترات من agarose ذاب. إضافة بعناية بضع قطرات من agarose على شريحة زجاجية نظيفة وعلى الفور وضع شريحة أخرى على رأس قطرات لإنشاء لوحة رقيقة من agarose بين القطعتين الزجاجيتين.عندما تجفيف agarose، بعناية إزالة الشريحة العلوي. عندما تم إعداد ما يكفي من الشرائح، افتح برنامج المجهر confocal وتعيين مسار الضوء للإثارة والانبعاثات. للدندرا 2 الخضراء إضافة 486 إلى 553 نانومتر، وDendra2 الأحمر إضافة 580 إلى 740 نانومتر.ضبط السلطة وكسب كل من القنوات وفقا لشدة الفلوروفور وتعيين الثقب لفتح تماما. حدد وضع قناة تسلسلي وقم بتعيين المسار للتبديل كل إطار. تعيين وضع المسح الضوئي كإطار وحجم الإطار 1024 في 1024 مع خط خطوة واحدة.تعيين المتوسط إلى اثنين والمتوسط حسب الأسلوب المتوسط وطريقة خط أحادي الاتجاه. تعيين عمق بت إلى ثمانية بتات. حدد إعداد الاكتساب متعدد الأبعاد لتحويل Dendra2.للتحويل والتبييض، استخدم 405 نانومتر ليزر الصمام الثنائي تعيين إلى 60٪ الطاقة. حدد سلسلة زمنية من دورتين بفاصل 0.0 مللي ثانية بين الدورات وبدء وإيقاف عاديين. تعيين التبييض لبدء بعد مسح واحد من اثنين، لتكرار ل30 التكرارات والتوقف عند انخفاض كثافة إلى 50٪، ثم تحديد سرعة بكسل اقتناء يسكن إلى صيام للتحويل وإلى متوسط لالتقاط صورة مبكرة.لتركيب النيماتودا على الشرائح، استخدم علامة دائمة لرسم ورقم إطار بأربعة مربعات على عكس لوحة agarose على كل شريحة. إضافة 15 ميكرولترات من levamisole إلى منتصف لوحة agarose واستخدام مجهر ستيريو واختيار الأسلاك لنقل للنيماتودا مطابقة للعمر في قطرات. استخدام اختيار رمش لنقل بلطف كل نعمة في نافذة واحدة من مربع.عندما تم إعادة وضع جميع الديدان الخيطية ، انتظر حتى تتوقف الديدان عن الحركة قبل وضع زلة غطاء فوق السائل لشل حركة الديدان الخيطية أثناء التصوير. ثم، ضع الشريحة على مرحلة المجهر confocal. لتحويل Dendra2 الخضراء، استخدم العدسة الهدف 20 X تحت الفلورسين الخضراء لتحديد موقع الخيطية الأولى والتركيز على الرأس أو الذيل.التبديل إلى وضع confocal وزيادة أو إنقاص كسب وقوة الليزر للحصول على المشبعة ، ولكن ليس فوق تعريض الصورة. رسم منطقة من الاهتمام حول الخلايا العصبية المختارة ورسم منطقة أكبر ثانية من الفائدة حول الذيل الذي يتضمن المنطقة الأولى من الفائدة. تعيين المنطقة الأولى التي يتم الحصول عليها، تبييض، وتحليلها.تعيين المنطقة الثانية من الفائدة التي سيتم الحصول عليها وتحليلها، ولكن ليس ابيض. تعيين سرعة المسح الضوئي إلى أقصى حد ممكن وبدء المسح الضوئي لتحويل الخلايا العصبية Dendra2 المحدد. مباشرة بعد التحويل، بدء المسح الحي مع ليزر خضراء 561 نانومتر لتصور Dendra2 في القناة الحمراء والعثور على التركيز وإسقاط الحد الأقصى لكل من الخلايا العصبية المحولة.تعيين سرعة سرعة المسح الضوئي إلى أقل بكسل يسكن بسرعة والحصول على صورة لقطة من كل القنوات في دقة أعلى. تعتبر هذه الصورة في وقت الصفر بعد التحويل. ثم احفظ الفحص باستخدام اسم أو رقم قابل للتحديد، متبوعاً بتسمية الوقت صفر.لتتبع تدهور Dendra2 مع مرور الوقت، افتح صورة مرات صفر من الخلايا العصبية الخيطية المعنية. باستخدام نفس الإعداد الصورة، بدء المسح الحي في القناة الحمراء وإحضار الخلايا العصبية الحمراء المحولة في التركيز. ثم، دون تغيير أية معلمات الاكتساب، الحصول على لقطة بنفس سرعة الصورة الأولى.تأكد من تحديد إعداد التحويل بعناية لتحويل Dendra2 بكفاءة وكافية والحفاظ على نفس معلمات الاستحواذ في جميع أنحاء نقاط زمنية مختلفة. لتحليل الصور Dendra2 المحولة، افتح الصور الزمنية صفر ونقطة الوقت الثاني في فيجي وفتح تحليل وتعيين القياسات. حدد وظائف المنطقة والكثافة المتكاملة وحدد الصورة التي تم الحصول عليها من خلال القناة الحمراء.باستخدام أداة تحديد المضلع، رسم منطقة من الاهتمام حول الوقت صفر تحويل الخلايا العصبية. لتحديد ملامح الخلايا العصبية بشكل صحيح، حدد صورة، ضبط، وعتبة لتسليط الضوء على عتبات كثافة. بمجرد تحديد التحديد، انقر فوق تحليل وقياس.ستظهر نافذة نتائج منبثقة، بما في ذلك المنطقة والكثافة المدمجة وقيم الكثافة المدمجة الأولية للمنطقة التي ترغب فيها. تنفيذ نفس عملية التحديد والقياس للصورة من نقطة الوقت الثاني. ثم نسخ القيم في جدول البيانات.في هذا التحليل التمثيلي قبل التحويل، لم تكن هناك إشارة حمراء مرئية عندما كانت العينة متحمسة في القناة الحمراء. وعند التشعيع، تضاءلت الإشارة الخضراء مع تحويل HTT-D2 وظهرت إشارة حمراء في وقت لاحق. تحطّت عبارة HTT-D2 بمرور الوقت، مما أدى إلى انخفاض في مستويات إشارة HTT-D2 الحمراء والزيادة المحتملة لإشارة HTT-D2 الخضراء حيث تم تصنيع المزيد من البروتين الاندماجي حديثًا.وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا العصبية في منطقة الذيل كانت مصممة لتكون أكثر نشاطا بكثير مقارنة بتلك التي من الرأس. علاوة على ذلك، كان هناك تدهور أكثر بكثير من السيطرة HTTQ25-D2 بعد 24 ساعة من التحويل، ثم بعد ساعتين في كل من الخلايا العصبية الرأس والذيل. غير أن هذا الاختلاف لم يُلاحظ في HTTQ97-D2 المسبب للأمراض، مما يشير إلى أن شبكة البروتيوستاسيس لم تتمكن من إزالة HTT-D2 التي تحتوي على امتدادات الجلوتامين الأطول في جميع أنحاء الجهاز العصبي.HTTQ97-D2 لم تتحلل بكفاءة HTTQ25-D2 في الديدان الخيطية القديمة جدا، مما يسلط الضوء على عدم قدرة شبكة البروتيوستاسيس لإزالة الأنواع المجمعة وربما السامة من هنتتين في الحيوانات القديمة. الأهم من ذلك، كانت الخلايا العصبية التيل قادرة على التعامل مع HTTQ97-D2 السامة في الديدان الخيطية الشباب، مما يشير إلى أن مختلف آليات شبكة البروتيوستاسيس المصاحبة قد تكون في العمل لإزالة HTT-D2. للحصول على كل عينة وغير تعريض وغير المشبعة صورة مباشرة بعد التحويل وإعادة استخدام نفس الإعداد لتلك العينة على مر الزمن.مع هذا البروتوكول، فمن الممكن لاختبار التغييرات في شبكة البروتينات، وأيضا، مع مساعدة من المجهر فائقة الدقة، لتتبع انتشار البروتينات المرتبطة بالمرض.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

الكمي في الجسم الحي من التفاعلات بروتين G مستقبلات اقترن به الطيفي ثنائي الفوتون الميكروسكوب

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

رصد اليوبيكويتين-proteasome نشاط في الخلايا الحية باستخدام Degron (DGN)-زعزعة استقرار الأخضر نيون البروتين البروتين مراسل (GFP) على أساس

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

تلوين الأجسام المضادة في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; عن طريق &quot;تجميد تكسير&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

تتبع وقياس العمليات التنموية في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; استخدام أدوات المصدر المفتوح

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

أساليب "دراسة التغيرات" في "تجميع البروتين الأصيل" مع التقدم في السن في ايليجانس كاينورهابديتيس

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

التحديد الكمي للبروتين خاصة بالموقع يسين Acetylation و Succinylation Stoichiometry الكتلي حيازة مستقلة عن البيانات باستخدام

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

قياسات استجابات الإجهاد الفسيولوجي في C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

قياس سمية الببتيد RAN في C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...