Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

Vi anerkender DFG (KI-1988/5-1 til JK, NeuroCure PhD-stipendium fra NeuroCure Cluster of Excellence til MLP) for finansiering. Vi anerkender også Imaging Core Facility af Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) for at levere billeddannelse oprettet. Derudover vil vi gerne takke Diogo Feleciano, der etablerede Dendra2-systemet i laboratoriet og gav instruktioner.

1. Generation af C. elegans udtrykker neuronal Huntingtin-Dendra2 fusion protein
<ol><li>Klone genkodning af POI i en nematode udtryk vektor (dvs. pPD95_75, Addgene #1494), ved traditionelle begrænsning enzym digest10, Gibson forsamling11, eller enhver metode valg. Indsæt en promotor for at drive udtryk i et ønsket væv eller på et ønsket udviklingsstadiet. Sæt Dendra2 fluorophore enten N- eller C-terminalt i rammen med POI.</li>
	<li>Der genereres tran...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).</li><li>Kreis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylation+of+the+actin-binding+protein+drebrin+controls+oxidation+stress-resistance+in+mammalian+neurons+and+C.+elegans.">ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ubiquitinated+huntingtin+species+in+intracellular+aggregates.">Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).</li><li>Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo.">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+and+analysis+of+age-related+changes+in+Caenorhabditis+elegans.">The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+the+nervous+system.">Specification of the nervous system.</a> WormBook. , 1-19 (2005).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration?.">What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).</li><li>Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+enhanced+photoconversion+yield+in+green+fluorescent+protein-like+protein+Dendra2.">Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2.</a> Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).</li><li>Tsvetkov, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteostasis+of+polyglutamine+varies+among+neurons+and+predicts+neurodegeneration.">Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration.</a> Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).</li><li>Feleciano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis.">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).</li><li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells.">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li></ol>

For at forstå et proteins funktion er det vigtigt at forstå dets syntese, placering og nedbrydning. Med udviklingen af nye, stabile og lyse FPs, visualisering og overvågning POI'er er blevet lettere og mere effektiv. Genetisk udtrykt fusion PAFPs såsom Dendra2 er unikt positioneret til at studere stabiliteten af en POI. Ved udsættelse for lilla-blåt lys, Dendra2 pauser på et præcist sted inden for en triade af bevarede aminosyrer. Fluorophore gennemgår en lille strukturel ændring, hvilket resulterer i en fuldst...

Proteomet i en levende organisme fornyer sig konstant. Proteiner nedbrydes og syntetiseres løbende i henhold til en celles fysiologiske behov. Nogle proteiner er hurtigt elimineret, mens andre er længere levetid. Overvågning protein dynamik er en enklere, mere præcis, og mindre invasiv opgave, når du bruger genetisk kodede fluorescerende proteiner (FPs). FPs form autocatalytisk og kan smeltes til ethvert protein af interesse (POI), men kræver ikke enzymer til at folde eller har brug for cofaktorer spare for ilt1. En nyere generation af FPs er for nylig blevet manipuleret til at skifte farve på bestråling med en lys puls af bestemt bølgelængde. Disse fotoaktive FP'er (PAFPs) gør det muligt at mærke og spore POI'er eller de organeller eller celler, de bor i, og at undersøge deres kvantitative og/eller kvalitative parametre2. FPs gør det muligt at spore enhver POI's bevægelse, retningsbestemthed, sats for bevægelse, diffuseringskoefficient, mobil versus immobile fraktioner, den tid, den er bosat i en cellulær rum, samt dens omsætningshastighed. For specifikke organeller kan bevægelse og transport eller fissions- og fusionshændelser bestemmes. For en bestemt celletype kan der oprettes en celles placering, delingshastighed, volumen og form. Afgørende, brugen af PAFPs tillader sporing uden kontinuerlig visualisering og uden interferens fra enhver nyligt syntetiseret sonde. Undersøgelser både i celler og i hele organismer har med succes anvendt PAFPs til at behandle biologiske spørgsmål in vivo, såsom udvikling af kræft og metastase, samling eller demontering af cytoskeleton, og RNA-DNA/protein interaktioner3. I dette manuskript anvendes let mikroskopi og PAFPs til at afdække omsætningsraten for det sammenlægningsudsatte protein huntingtin (HTT) in vivo i en C. elegans model af neurodegenerative sygdomme.
Den her beskrevne protokol kvantificerer stabiliteten og nedbrydningen af fusionsproteinet huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 er en anden generations monomerisk PAFP4, der uigenkaldeligt skifter sin emission / excitation spektre fra grøn til rød som reaktion på enten UV eller synligt blåt lys, med en stigning i dens intensitet på op til 4.000-fold5,6. Huntingtin er det protein, der er ansvarligt for at forårsage Huntingtons Sygdom (HS), en dødelig arvelig neurodegenerativ lidelse. Huntingtin exon-1 indeholder en strækning af glutaminer (CAG, Q). Når proteinet udtrykkes med over 39Q, misfolds det til et mutant, giftigt og patogent protein. Mutant HTT er tilbøjelig til sammenlægning og fører til neuronal celledød og degeneration, enten som korte oligomerarter eller som større højt strukturerede amyloider7.
Den nematode er en model system til at studere aldring og neurodegeneration takket være dens lethed af manipulation, isogene natur, kort levetid, og dens optiske gennemsigtighed8. For at studere stabiliteten af HTT in vivo, en fusion konstruktion blev udtrykt i nervesystemet af C. elegans. En HTT-D2 transgene, der indeholder enten en fysiologisk strækning på 25Qs (HTTQ25-D2) eller en patologisk strækning på 97Qs (HTTQ97-D2) er overudtrykt pan-neuronalt hele nematodens levetid9. Ved at udsætte levende C. elegans for en kort og fokuseret lyspunkt, en enkelt neuron er photoswitched og den konverterede HTT-D2 spores over tid. For at bestemme mængden af HTT-D2 forringet sammenlignes forskellen mellem det røde signal fra den nykonverterede HTT-D2 med det resterende røde signal fra HTT-D2 efter en bestemt periode. Det bliver derfor muligt at undersøge, hvordan huntingtin nedbrydes, når det findes i sin udvidede og toksiske form i forhold til dets fysiologiske form; hvordan forreste eller bageste neuroner reagerer forskelligt på tilstedeværelsen af Q97 versus Q25, især over længere perioder; og hvordan sammenbruddet af proteostase-netværket (PN) under aldring bidrager til forskellene i nedbrydningshastigheder. Disse resultater beskriver kun et lille sæt bemærkninger om omsætningen i HTT-D2. Men mange flere biologiske spørgsmål, der er relevante for både området for proteinaggregering og proteostase, kan behandles med denne in vivo-applikation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

Proteiner syntetiseres og nedbrydes konstant i en celle for at opretholde homøostase. At være i stand til at overvåge nedbrydningen af et protein af interesse er nøglen til at forstå ikke kun dets livscyklus, men også for at afdække ubalancer i proteostasenetværket. Denne metode viser, hvordan man kan spore nedbrydningen af det sygdomsskabende protein huntingtin. To versioner af huntingtin smeltet til Dendra2 er udtrykt i C. elegans nervesystem: en fysiologisk version eller en med en udvidet og patogen strækning af glutaminer. Dendra2 er et fotokonverterende fluorescerende protein; ved en kort ultraviolet (UV) bestrålingspuls, skifter Dendra2 sin excitation/emission spektre fra grøn til rød. Svarende til en puls-chase eksperiment, kan omsætningen af den konverterede rød-Dendra2 overvåges og kvantificeres, uanset indblanding fra nyligt syntetiseret grøn-Dendra2. Ved hjælp af konfoalbaseret mikroskopi og på grund af den optiske gennemsigtighed i C. eleganser det muligt at overvåge og kvantificere nedbrydningen af huntingtin-Dendra2 i en levende, aldrende organisme. Neuronal huntingtin-Dendra2 nedbrydes delvist kort efter omdannelse og ryddes yderligere over tid. De systemer, der styrer nedbrydningen, er mangelfulde i tilstedeværelsen af mutant huntingtin og forringes yderligere ved ældning. Neuronale undertyper inden for samme nervesystem har forskellige omsætningskapaciteter for huntingtin-Dendra2. Samlet set kan overvågning af ethvert protein af interesse, der er smeltet sammen med Dendra2, give vigtige oplysninger ikke blot om dets nedbrydning og aktørerne i det involverede proteostasisnetværk, men også om dets placering, menneskehandel og transport.

To nematodestammer, der udtrykker huntingtin exon-1-proteinfragmentet i rammen med det fotokonvertible protein Dendra2, blev opnået via mikroinjektion, og plasmiderne blev holdt som et ekstrakromosomt array. Fusionskonstruktionen blev udtrykt i hele C. elegans nervesystem fra udvikling gennem hele aldringen. Her indeholdt HTT-D2 enten den fysiologiske 25 polyglutaminstræk (HTTQ25-D2, figur 1A) eller en fuldt penetrant og patogen ge...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Præsenteret her er en protokol til at overvåge nedbrydningen af proteinet huntingtin smeltet til fotokonvertible fluorophore Dendra2.

I Vivo Kvantificering af protein omsætning i Aging C. Elegans bruger Photoconvertible Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Denne protokol giver mulighed for sporing og kvantificering af nedbrydningen af et protein af interesse i levende og aldrende C.elegans. Denne in vivo og noninvasive teknik kræver kun lidt mikroskopi oprettet til pålideligt at konvertere Dendra2 til en lys og stabil fluorophore. Metoden kan tilpasses pattedyrsystemer samt zebrafisk.At studere, sætte i omsætning inden for proteostatis nettet samt transport og menneskehandel. Pas på ikke at fremprovokere uønsket konvertering af Dendra2, mens du scanner med den blå lyslaser, og for at teste og optimere anskaffelsesindstillingerne og konverteringsindstillingerne for hvert system og fusionsprotein. Begynd med at dyrke aldersmatchede nematoder ved 20 grader Celsius til den ønskede alder for eksperimentet.På dagen for billedforsøget smeltes den generelle kvalitet agarose ved en koncentration på 3 % i dobbeltdestilleret vand. Mens agarose er køling, skæres spidsen af en milliliter pipette spids for at lette aspiration af ca 400 mikroliter af den smeltede agarose. Tilsæt forsigtigt et par dråber agarose på et rent glas dias og straks placere en anden slide på toppen af dråberne for at skabe en tynd pude af agarose mellem de to glasstykker.Når agarose er tørret, skal du forsigtigt fjerne den øverste slide. Når der er forberedt nok dias, skal du åbne konfokale mikroskopsoftware og indstille lysvejen til excitation og emission. For grøn Dendra2 tilføje 486 til 553 nanometer, og for rød Dendra2 tilføje 580 til 740 nanometer.Juster kraften og gevinsten af begge kanaler i henhold til intensiteten af fluorophore og sæt pinhole til fuldt ud at åbne. Vælg en sekventiel kanaltilstand, og indstil sporet til at skifte hver ramme. Indstil scanningstilstanden som ramme og rammestørrelsen som 1024 i 1024 med et linjetrin på et.Indstil gennemsnit til to og til gennemsnittet med den gennemsnitlige metode og tilstand af ensrettet linje. Indstil bitdybden til otte bit. Definer den flerdimensionale anskaffelsesindstilling for konverteringen af Dendra2.Til konvertering og blegning skal du bruge 405 nanometerdiodelaseren indstillet til 60 % energikraft. Vælg en tidsserie med to cyklusser med et interval på 0,0 millisekund mellem cyklusserne og en normal start og stop. Indstil blegning til at starte efter scanning en af to, at gentage for 30 iterationer og til at stoppe, når intensiteten falder til 50%Derefter definere hastigheden af erhvervelse pixel dvæle til hurtig for konvertering og til medium for at fange et snap billede.For at montere nematoderne på objektglassene skal du bruge en permanent markør til at tegne og nummerere et vindue med fire firkanter på det modsatte af agarosepuden på hvert objektglas. Tilsæt 15 mikroliter levamisole til midten af agarosepuden, og brug et stereomikroskop og et tråds pick til overførsel for aldersmatchede nematoder i dråben. Brug en øjenvipper pick til forsigtigt at flytte hver nematode i et vindue på pladsen.Når alle nematoder er blevet flyttet, vente, indtil ormene er holdt op med at bevæge sig, før du placerer et dæksel slip over væsken til at immobilisere nematoder under billeddannelse. Placer derefter sliden på konfokale mikroskopstadiet. For grøn Dendra2 konvertering, skal du bruge okularet af 20 X mål under grøn fluorescens at finde den første nematode og fokusere på hovedet eller halen.Skift til konfokal tilstand og øge eller mindske gevinst og laser magt for at opnå en mættet, men ikke overeksponeret billede. Tegn en region af interesse omkring den valgte neuron og tegne en anden større region af interesse omkring halen, der omfatter den første region af interesse. Indstil den første region, der skal erhverves, bleges og analyseres.Indstil den anden region af interesse, der skal erhverves og analyseres, men ikke bleget. Indstil scanningshastigheden til maksimum og start scanningen for at konvertere de valgte Dendra2 neuroner. Umiddelbart efter konvertering, begynde live scanning med den grønne 561 nanometer laser til at visualisere Dendra2 i den røde kanal og finde fokus og respektive maksimale projektion af den konverterede neuron.Indstil hurtigt scanningshastigheden til en lavere pixelbondehastighed, og få et snapshotbillede af begge kanaler med en højere opløsning. Dette billede betragtes på tid nul efter konvertering. Gem derefter scanningen med et identificerbart navn og eller tal efterfulgt af tids zero-etiketten.For at spore Dendra2 nedbrydning over tid, åbne gange nul billede af de respektive nematode neuron. Brug den samme billedindstilling, begynde at scanne live i den røde kanal og bringe den konverterede røde neuron i fokus. Derefter, uden at ændre nogen erhvervelse parametre, få et øjebliksbillede med samme hastighed som det første billede.Sørg for at definere din konverteringsindstilling omhyggeligt for at konvertere Dendra2 effektivt og tilstrækkeligt og for at opretholde de samme anskaffelsesparametre på forskellige tidspunkter. Hvis du vil analysere de konverterede Dendra2-billeder, skal du åbne tids zero- og second time point-billederne i Fiji og åbne Analyser og Indstil målinger. Vælg funktionerne Område og Integreret Tæthed, og vælg det billede, der er hentet med den røde kanal.Brug Polygon Selection Tool, tegne en region af interesse omkring det tidspunkt nul konverteret neuron. Hvis du vil identificere neuronens konturer korrekt, skal du vælge Billede, Juster og Tærskel for at fremhæve intensitetstærsklerne. Når markeringen er defineret, skal du klikke på Analysér og målér.Der vises et pop up-resultatvindue, herunder området, integreret tæthed og råintegrerede tæthedsværdier for den valgte interesseregion. Udfør den samme udvælgelses- og måleproces for billedet fra det andet tidspunkt. Kopier derefter værdierne til regnearket.I denne repræsentative analyse før konvertering var der ikke synligt rødt signal, da prøven var ophidset i den røde kanal. Ved bestråling faldt det grønne signal, da HTT-D2 blev konverteret, og der dukkede efterfølgende et rødt signal op. HTT-D2-udtrykket forringet over tid, hvilket resulterer i en reduktion i niveauet af rødt HTT-D2-signal og en mulig stigning i det grønne HTT-D2-signal, efterhånden som mere fusionsprotein for nylig blev syntetiseret.Især, neuroner i halen regionen blev bestemt til at være betydeligt mere aktive i forhold til hovedet. Yderligere, der var betydeligt mere nedbrydning af kontrol HTTQ25-D2 24 timer efter konvertering, derefter efter to timer i både hoved og hale neuroner. Denne forskel blev ikke observeret i patogene HTTQ97-D2, men tyder på, at proteostase netværket ikke var i stand til at fjerne HTT-D2 indeholder længere glutamin strækninger i hele nervesystemet.HTTQ97-D2 blev ikke nedbrudt så effektivt som HTTQ25-D2 i meget gamle nematoder, hvilket fremhævede proteostasenetværkets manglende evne til at fjerne aggregerede og muligvis giftige arter af Huntingtin hos ældre dyr. Vigtigere, hale neuroner var i stand til at klare giftige HTTQ97-D2 i unge nematoder, hvilket tyder på, at forskellige samtidige proteostase netværk mekanismer kan være på arbejde for at fjerne HTT-D2. For hver prøve erhverve og ikke-overeksponeret og ikke-mættet billede umiddelbart efter konvertering og genbruge den samme indstilling for den pågældende prøve gennem tiden.Med denne protokol er det muligt at teste ændringer i et proteostatisnetværk og også ved hjælp af superopløsningsmikroskopi at spore spredningen af sygdomsrelaterede proteiner.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Overvågning af Ubiquitin-proteasom aktivitet i levende celler ved hjælp af en Degron (DGN)-destabiliseret Green Fluorescent Protein (GFP)-baseret Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antistoffarvning i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Brug af &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Sporing og kvantificere udviklingsprocesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Brug Open source Værktøj

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Metoder til undersøgelse ændringer i iboende Protein sammenlægning med alder i Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantificering af lokationsspecifikke Protein lysin Acetylation og Succinylation støkiometrisk ved hjælp af Data-uafhængig erhvervelse massespektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Målinger af fysiologiske stressreaktioner i C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Måling ran peptid toksicitet i C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...