Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

Wij erkennen de DFG (KI-1988/5-1 aan JK, NeuroCure PhD fellowship door de NeuroCure Cluster of Excellence aan MLP) voor financiering. We erkennen ook de Imaging Core Facility van het Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) voor het leveren van de imaging opgezet. Daarnaast willen we Diogo Feleciano bedanken die het Dendra2-systeem in het lab heeft opgezet en instructies heeft gegeven.

1. Generatie van C. elegans die neuronale Huntingtine-Dendra2 fusie-eiwit uitdrukken
<ol><li>Kloon het gen dat de POI codeert in een nematode expressievector (d.w.z. pPD95_75, Addgene #1494), door traditionele restrictie enzymvertaet10, Gibson assemblage11, of een methode van keuze. Plaats een promotor om expressie te stimuleren in een gewenst weefsel of in een gewenste ontwikkelingsfase. Plaats de Dendra2 fluorofophore n- of C-terminaal in frame met de POI.</li>...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).</li><li>Kreis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylation+of+the+actin-binding+protein+drebrin+controls+oxidation+stress-resistance+in+mammalian+neurons+and+C.+elegans.">ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ubiquitinated+huntingtin+species+in+intracellular+aggregates.">Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).</li><li>Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo.">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+and+analysis+of+age-related+changes+in+Caenorhabditis+elegans.">The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+the+nervous+system.">Specification of the nervous system.</a> WormBook. , 1-19 (2005).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration?.">What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).</li><li>Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+enhanced+photoconversion+yield+in+green+fluorescent+protein-like+protein+Dendra2.">Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2.</a> Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).</li><li>Tsvetkov, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteostasis+of+polyglutamine+varies+among+neurons+and+predicts+neurodegeneration.">Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration.</a> Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).</li><li>Feleciano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis.">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).</li><li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells.">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li></ol>

Om de functie van een eiwit te begrijpen is het belangrijk om de synthese, locatie en afbraak ervan te begrijpen. Met de ontwikkeling van nieuwe, stabiele en heldere FPs is het visualiseren en monitoren van POI's eenvoudiger en efficiënter geworden. Genetisch uitgedrukte fusieps zoals Dendra2 zijn uniek gepositioneerd om de stabiliteit van een POI te bestuderen. Bij blootstelling aan paars-blauw licht breekt Dendra2 op een precieze locatie binnen een triade van geconserveerde aminozuren. De fluorofophore ondergaat een k...

Het proteoom van een levend organisme vernieuwt zichzelf voortdurend. Eiwitten worden voortdurend afgebroken en gesynthetiseerd volgens de fysiologische vraag van een cel. Sommige eiwitten worden snel geëlimineerd, terwijl andere langer worden geleefd. Het monitoren van eiwitdynamica is een eenvoudigere, nauwkeurigere en minder invasieve taak bij het gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten (FPs). FPs vormen auto-katatisch en kunnen worden gefuseerd tot elk eiwit van belang (POI), maar vereisen geen enzymen te vouwen of cofactoren nodig, behalve voor zuurstof1. Een nieuwere generatie FPs is onlangs ontworpen om kleur te schakelen op bestraling met een lichtpuls van bepaalde golflengte. Deze fotoactivatable FPs (PAF's) maken het mogelijk om POI's, organellen of cellen waarin ze zich bevinden, te labelen en bij te houden, en om hun kwantitatieve en/of kwalitatieve parameters te onderzoeken2. FPs maken het mogelijk om elke POI's beweging, directionaliteit, snelheid van beweging, coëfficiënt van diffusie, mobiele versus onbeweeglijke breuken, de tijd dat het zich in een cellulair compartiment, evenals de omloopsnelheid. Voor specifieke organellen kunnen bewegings- en transport- of splijtings- en fusiegebeurtenissen worden bepaald. Voor een bepaald celtype kunnen de positie, de verdelingssnelheid, het volume en de vorm van een cel worden vastgesteld. Cruciaal is dat het gebruik van PAFP's tracking mogelijk maakt zonder continue visualisatie en zonder interferentie van een nieuw gesynthetiseerde sonde. Studies zowel in cellen als in hele organismen hebben met succes PAFP's gebruikt om biologische vraagstukken in vivo aan te pakken, zoals de ontwikkeling van kanker en metastase, assemblage of demontage van het cytoskelet en RNA-DNA/eiwit interacties3. In dit manuscript worden lichtmicroscopie en PAFP's gebruikt om de omloopsnelheid van het aggregatiegevoelige eiwit huntingtine (HTT) in vivo bloot te leggen in een C. elegans-model van neurodegeneratieve ziekte.
Het hier beschreven protocol kwantificeert de stabiliteit en afbraak van het fusie-eiwit huntingtine-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 is een monomerieke PAFP4 van de tweede generatie die zijn emissie/excitatiespectra onomkeerbaar schakelt van groen naar rood in reactie op UV of zichtbaar blauw licht, met een toename van de intensiteit tot 4.000-voudig5,6. Huntingtine is het eiwit dat verantwoordelijk is voor het veroorzaken van de ZvH, een fatale erfelijke neurodegeneratieve aandoening. Huntingtine exon-1 bevat een stuk glutamines (CAG, Q). Wanneer het eiwit wordt uitgedrukt met meer dan 39Q, het misfolds in een mutant, giftig en pathogene eiwit. Mutant HTT is gevoelig voor aggregatie en leidt tot neuronale celdood en degeneratie, hetzij als korte oligomerische soorten of als grotere zeer gestructureerde amyloïden7.
De nematode is een modelsysteem voor het bestuderen van veroudering en neurodegeneratie dankzij het gemak van manipulatie, isogene aard, korte levensduur, en de optische transparantie8. Om de stabiliteit van HTT in vivo te bestuderen, werd een fusieconstructie uitgedrukt in het zenuwstelsel van C. elegans. Een HTT-D2 transgene met ofwel een fysiologische stretch van 25Qs (HTTQ25-D2) of een pathologisch traject van 97Qs (HTTQ97-D2) is overexpressed pan-neuronally gedurende de levensduur van de nematode9. Door live C. elegans te onderwerpen aan een kort en gefocust lichtpunt, wordt een enkel neuron gefotoswitcheerd en wordt de omgebouwde HTT-D2 in de loop van de tijd bijgehouden. Om de hoeveelheid HTT-D2 te laten afnemen, wordt het verschil tussen het rode signaal van de vers omgebouwde HTT-D2 vergeleken met het resterende rode signaal van HTT-D2 na een bepaalde periode. Daarom wordt het mogelijk om te onderzoeken hoe huntingtine wordt afgebroken wanneer het in zijn uitgebreide en toxische vorm wordt gevonden in vergelijking met zijn fysiologische vorm; hoe anterie of achterste neuronen anders reageren op de aanwezigheid van Q97 versus Q25, vooral over langere perioden; en hoe de ineenstorting van het proteostasenetwerk (PN) tijdens de vergrijzing bijdraagt aan de verschillen in degradatiepercentages. Deze resultaten beschrijven slechts een kleine reeks opmerkingen over de omzet van HTT-D2. Echter, veel meer biologische vragen die relevant zijn voor zowel het gebied van eiwit aggregatie en proteostase kan worden aangepakt met deze in vivo toepassing.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

Eiwitten worden voortdurend gesynthetiseerd en afgebroken in een cel om homeostase te behouden. In staat zijn om de afbraak van een eiwit van belang te controleren is de sleutel tot het begrijpen van niet alleen de levenscyclus, maar ook om onevenwichtigheden in het proteostasenetwerk aan het licht te brengen. Deze methode laat zien hoe de afbraak van het ziekteverwekkende eiwit huntingtine kan worden gevolgd. Twee versies van huntingtine gefuseerd tot Dendra2 worden uitgedrukt in het C. elegans zenuwstelsel: een fysiologische versie of een met een uitgebreide en pathogene strook glutamines. Dendra2 is een fotoconverteerbaar fluorescerend eiwit; op een korte ultraviolette (UV) bestraling puls, Dendra2 schakelt zijn excitatie / emissie spectra van groen naar rood. Net als bij een pulse-chase experiment, kan de omzet van de omgebouwde red-Dendra2 worden gecontroleerd en gekwantificeerd, ongeacht de interferentie van nieuw gesynthetiseerd groen-Dendra2. Met behulp van confocale microscopie en door de optische transparantie van C. elegansis het mogelijk om de afbraak van huntingtine-Dendra2 in een levend, ouder wordend organisme te monitoren en te kwantificeren. Neuronale huntingtine-Dendra2 wordt kort na de conversie gedeeltelijk afgebroken en in de loop van de tijd verder gewist. De systemen die de afbraak beheersen zijn ontoereikend in aanwezigheid van mutant huntingtine en worden verder aangetast door veroudering. Neuronale subtypes binnen hetzelfde zenuwstelsel vertonen verschillende omzetcapaciteiten voor huntingtine-Dendra2. Over het algemeen kan het monitoren van een eiwit dat met Dendra2 is gesmolten, belangrijke informatie opleveren, niet alleen over de degradatie en de spelers van het betrokken proteostasenetwerk, maar ook over de locatie, de handel en het vervoer ervan.

Twee nematodestammen die het huntingtine exon-1 eiwitfragment in frame met het fotoconvertible eiwit Dendra2 uitdrukken, werden verkregen via micro-injectie en de plasmiden werden bewaard als een extrachromosomale array. De fusieconstructie werd uitgedrukt in het hele C. elegans zenuwstelsel van ontwikkeling tijdens de veroudering. Hier bevatte HTT-D2 ofwel de fysiologische 25 polyglutamine stretch (HTTQ25-D2, Figuur 1A) of een volle...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Hier gepresenteerd is een protocol om de afbraak van het eiwit huntingtine gefuseerd aan de fotoconvertible fluorophore Dendra2 te controleren.

In Vivo Kwantificering van eiwitomzet in Aging C. Elegans met behulp van Photoconvertible Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Dit protocol maakt het bijhouden en kwantificeren van de afbraak van een eiwit van belang in levende en vergrijzende C.elegans mogelijk. Deze in vivo en niet-invasieve techniek vereist slechts weinig microscopie opgezet om op betrouwbare wijze om te zetten Dendra2 in een heldere en stabiele fluorofofoër. De methode is aanpasbaar aan zoogdiersystemen, evenals zebravissen.Om te studeren, zet in de omzet binnen het proteostatis netwerk, alsmede vervoer en handel. Zorg ervoor dat u geen ongewenste conversie van Dendra2 uitlokt tijdens het scannen met de blauwe lichtlaser, en om de acquisitie-instellingen en conversie-instellingen voor elk systeem en fusie-eiwit te testen en te optimaliseren. Begin met het kweken van leeftijdsgematchte aaltjes bij 20 graden Celsius tot de gewenste leeftijd voor het experiment.Op de dag van het beeldvormingsexperiment, smelt algemene kwaliteit agarose bij een 3%-concentratie in dubbel gedestilleerd water. Terwijl de agarose is koeling, snijd de punt van een een milliliter pipet tip om aspiratie van ongeveer 400 microliter van de gesmolten agarose te vergemakkelijken. Voeg voorzichtig een paar druppels agarose op een schone glazen glijbaan en onmiddellijk plaats een andere dia op de top van de druppels om een dun pad van agarose tussen de twee glazen stukken te creëren.Wanneer de agarose is gedroogd, verwijder dan voorzichtig de bovenste schuif. Wanneer er voldoende glijbanen zijn voorbereid, opent u de confocale microscoopsoftware en stelt u het lichtpad in voor opwinding en emissie. Voor groene Dendra2 voeg 486 tot 553 nanometer, en voor rode Dendra2 voeg 580 tot 740 nanometer.Pas de kracht en de winst van beide kanalen aan de intensiteit van de fluorofoof aan en stel het gaatje volledig open. Selecteer een sequentiële kanaalmodus en stel de track in om elk frame te schakelen. Stel de scanmodus in als frame en de framegrootte op 1024 bij 1024 met een lijnstap van één.Stel het middeling in op twee en gemiddeld met de gemiddelde methode en de wijze van unidirectionele lijn. Stel de bitdiepte in op acht bits. Definieer de instelling voor multidimensionale acquisitie voor de conversie van Dendra2.Voor conversie en bleken, gebruik maken van de 405 nanometer diode laser ingesteld op 60% energievermogen. Selecteer een tijdreeks van twee cycli met een interval van 0,0 milliseconde tussen de cycli en een normale start- en stop. Stel het bleken in om te beginnen na het scannen van een van de twee, om te herhalen voor 30 iteraties en om te stoppen wanneer de intensiteit daalt tot 50%Vervolgens, definieer de snelheid van de acquisitie pixel wonen snel voor conversie en medium voor het vastleggen van een snap image.Om de aaltjes op de dia's te monteren, gebruikt u een permanente markering om een venster met vier vierkanten op de tegenoverliggende agarosepad op elke dia te tekenen en nummer. Voeg 15 microliters levamisole toe aan het midden van het agarosepad en gebruik een stereomicroscoop en een draadpluk om voor ouderdialetjes in de druppel te brengen. Gebruik een wimper pick om voorzichtig te verplaatsen elke nematode in een venster van het plein.Wanneer alle aaltjes zijn verplaatst, wacht tot de wormen zijn gestopt met bewegen voordat u een afdekkingslip over de vloeistof plaatst om de aaltjes tijdens de beeldvorming te immobiliseren. Plaats vervolgens de glijbaan op het confocale microscooppodium. Voor groene Dendra2 conversie, gebruik maken van het oculair van de 20 X doelstelling onder groene fluorescentie om de eerste aaltjes te lokaliseren en zich te concentreren op de kop of staart.Schakel over naar confocale modus en verhoog of verlaag de versterkings- en laserkracht om een verzadigd, maar niet overbelicht beeld te verkrijgen. Teken een regio van belang rond het geselecteerde neuron en trek een tweede groter gebied van belang rond de staart die de eerste regio van belang omvat. Stel de eerste regio in die wordt verworven, gebleekt en geanalyseerd.Stel de tweede interessegebied in dat moet worden verworven en geanalyseerd, maar niet gebleekt. Stel de scansnelheid in op maximaal en start de scan om de geselecteerde Dendra2-neuronen om te zetten. Onmiddellijk na de conversie, beginnen live scannen met de groene 561 nanometer laser om Dendra2 visualiseren in het rode kanaal en vind de focus en de respectieve maximale projectie van de geconverteerde neuron.Stel de scansnelheid snel in op een lagere pixelverbedsnelheid en verkrijg een momentopname van beide kanalen met een hogere resolutie. Deze afbeelding wordt beschouwd als op het moment nul na conversie. Sla vervolgens de scan op met een identificeerbare naam en of nummer, gevolgd door het label tijd nul.Om Dendra2 degradatie na verloop van tijd te volgen, opent u het keren nulbeeld van het respectievelijke nematodeneuron. Met behulp van dezelfde afbeelding instelling, beginnen met het scannen live in het rode kanaal en breng de omgezet rode neuron in focus. Vervolgens, zonder het wijzigen van de acquisitie parameters, het verkrijgen van een momentopname op dezelfde snelheid als de eerste afbeelding.Zorg ervoor dat u uw conversie-instelling zorgvuldig definieert om Dendra2 efficiënt en voldoende om te zetten en om dezelfde acquisitieparameters te behouden in verschillende tijdstippen. Als u de geconverteerde Dendra2-afbeeldingen wilt analyseren, opent u de tijd nul- en tweede tijdpuntafbeeldingen in Fiji en opent u Analyseren en Metingen instellen. Selecteer de functies Gebied en Geïntegreerde dichtheid en selecteer de afbeelding die is verkregen met het rode kanaal.Met behulp van de Polygon Selection Tool, teken een gebied van belang rond de tijd nul omgezet neuron. Als u de contouren van het neuron goed wilt identificeren, selecteert u Afbeelding, Aanpassen en Drempel om de intensiteitsdrempels te markeren. Zodra de selectie is gedefinieerd, klikt u op Analyseren en meten.Er verschijnt een pop-upresultaatvenster, inclusief het gebied, de geïntegreerde dichtheid en de geïntegreerde dichtheidswaarden voor het geselecteerde interessegebied. Voer hetzelfde selectie- en metingsproces voor de afbeelding uit vanaf het tweede tijdspunt. Kopieer vervolgens de waarden naar de spreadsheet.In deze representatieve analyse vóór de conversie was er geen rood signaal zichtbaar toen het monster werd opgewekt in het rode kanaal. Bij bestraling nam het groene signaal af naarmate HTT-D2 werd omgezet en later een rood signaal verscheen. HTT-D2 expressie afgebroken na verloop van tijd, wat resulteert in een vermindering van de niveaus van rood HTT-D2 signaal en een mogelijke toename van de groene HTT-D2 signaal als meer fusie-eiwit werd onlangs gesynthetiseerd.Met name de neuronen van het staartgebied bleken aanzienlijk actiever te zijn in vergelijking met die van het hoofd. Verder was er aanzienlijk meer afbraak van controle HTTQ25-D2 24 uur na conversie, dan na twee uur in zowel de kop en staart neuronen. Dit verschil werd echter niet waargenomen bij pathogene HTTQ97-D2, wat suggereerde dat het proteostasenetwerk niet in staat was HTT-D2 te verwijderen met langere glutamine zich door het hele zenuwstelsel uitstrekt.HTTQ97-D2 werd niet zo efficiënt afgebroken als HTTQ25-D2 in zeer oude aaltjes, waarbij het onvermogen van het proteostasenetwerk werd benadrukt om geaggregeerde en mogelijk giftige soorten Huntingtine bij oudere dieren te verwijderen. Belangrijk is dat staartneuronen in staat waren om te gaan met giftige HTTQ97-D2 bij jonge aaltjes, wat suggereert dat verschillende gelijktijdige proteostase netwerkmechanismen aan het werk zouden kunnen zijn om HTT-D2 te verwijderen. Voor elk monster verwerven en niet-overbelichte en niet-verzadigde afbeelding onmiddellijk na de conversie en hergebruik dezelfde instelling voor dat monster gedurende de tijd.Met dit protocol is het mogelijk om veranderingen in een proteostatisnetwerk te testen en ook, met behulp van microscopie met superresolutie, de verspreiding van ziektegerelateerde eiwitten te volgen.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generatie van Stable transgene C. elegans Met behulp van micro-injectie

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Monitoring van ubiquitine-proteasoom activiteit in levende cellen door een Degron (dgn)-gedestabiliseerd Green Fluorescent Protein (GFP)-gebaseerde Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antilichaamkleuring in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Een &#39;Freeze-Cracking &quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Gebruik<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Het gebruik van open-source tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kwantificering van Site-specific eiwit Lysine Acetylation en Succinylation stoichiometrie met behulp van spectrometrie van de massa van het gegevens-onafhankelijke overname

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Metingen van fysiologische stressreacties in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Meten RAN Peptide Toxiciteit in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...