Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

Nous reconnaissons le DFG (KI-1988/5-1 à JK, NeuroCure PhD fellowship par le NeuroCure Cluster of Excellence à MLP) pour le financement. Nous reconnaissons également le centre d’imagerie du Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) pour fournir l’imagerie mise en place. En outre, nous tenons à remercier Diogo Feleciano qui a établi le système Dendra2 dans le laboratoire et fourni des instructions.

1. Génération de C. elegans exprimant la protéine de fusion neuronale Huntingtin-Dendra2
<ol><li>Clonez le gène codant le POI dans un vecteur d’expression nématode (c.-à-d. pPD95_75, Addgene #1494), par l’enzyme de restriction traditionnelle digest10, Gibson assembly11, ou n’importe quelle méthode de choix. Insérez un promoteur pour conduire l’expression dans un tissu désiré ou à un stade de développement souhaité. Insérez le fluorophore Den...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).</li><li>Kreis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylation+of+the+actin-binding+protein+drebrin+controls+oxidation+stress-resistance+in+mammalian+neurons+and+C.+elegans.">ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ubiquitinated+huntingtin+species+in+intracellular+aggregates.">Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).</li><li>Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo.">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. 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Pour comprendre la fonction d’une protéine, il est important de comprendre sa synthèse, son emplacement et sa dégradation. Avec le développement de FP nouveaux, stables et brillants, la visualisation et la surveillance des POI sont devenues plus faciles et plus efficaces. Les PAFP de fusion génétiquement exprimés comme Dendra2 sont particulièrement bien placés pour étudier la stabilité d’un POI. Lors de l’exposition à la lumière bleu pourpre, Dendra2 se brise à un endroit précis dans une triade d’a...

Le protéome d’un organisme vivant se renouvelle constamment. Les protéines sont continuellement dégradées et synthétisées en fonction de la demande physiologique d’une cellule. Certaines protéines sont rapidement éliminées, tandis que d’autres sont plus longues. La surveillance de la dynamique des protéines est une tâche plus simple, plus précise et moins invasive lors de l’utilisation de protéines fluorescentes génétiquement codées (FP). Les RP se forment automatiquement et peuvent être fusionnés à n’importe quelle protéine d’intérêt (POI), mais n’ont pas besoin d’enzymes pour plier ou ont besoin de cofacteurs sauf pour l’oxygène1. Une nouvelle génération de FP a récemment été conçue pour changer de couleur sur l’irradiation avec une impulsion lumineuse de longueur d’onde déterminée. Ces FPs photoactivables (PAFP) permettent l’étiquetage et le suivi des POI, ou des organites ou des cellules dans lesquelles ils résident, et d’examiner leurs paramètres quantitatifs et/ou qualitatifs2. Les FP permettent de suivre le mouvement, la directionnalité, le taux de locomotion, le coefficient de diffusion, les fractions mobiles par rapport aux fractions immobiles, le temps qu’il réside dans un compartiment cellulaire, ainsi que son taux de rotation. Pour des organites spécifiques, la locomotion et le transport, ou les événements de fission et de fusion peuvent être déterminés. Pour un type de cellule particulier, la position, le taux de division, le volume et la forme d’une cellule peuvent être établis. Surtout, l’utilisation de PAFPs permet le suivi sans visualisation continue et sans interférence à partir d’une sonde nouvellement synthétisée. Des études menées dans des cellules et dans des organismes entiers ont utilisé avec succès des PAFP pour aborder des questions biologiques in vivo, telles que le développement du cancer et de la métastase, l’assemblage ou le démontage du cytosquelette, et les interactions ARN-ADN/protéine3. Dans ce manuscrit, la microscopie légère et les PAFP sont utilisés pour découvrir les taux de rotation de la huntingtine protéique (HTT) à l’agrégation in vivo dans un modèle de C. elegans de la maladie neurodégénérative.
Le protocole décrit ici quantifie la stabilité et la dégradation de la protéine de fusion huntingtine-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 est un PAFP monomériquede deuxième génération qui commute irréversiblement ses spectres d’émission/excitation du vert au rouge en réponse à la lumière bleue UV ou visible, avec une augmentation de son intensité allant jusqu’à 4 000 fois5,6. Huntingtine est la protéine responsable de la cause de la maladie de Huntington (MH), un trouble neurodégénératif héréditaire mortel. Huntingtin exon-1 contient un tronçon de glutamines (CAG, Q). Lorsque la protéine est exprimée avec plus de 39Q, elle se replie mal en une protéine mutante, toxique et pathogène. Mutant HTT est sujette à l’agrégation et conduit à la mort et la dégénérescence des cellules neuronales, soit en tant qu’espèces oligomériques courtes ou comme plus grandes amyloïdes très structurées7.
Le nématode est un système modèle pour étudier le vieillissement et la neurodégénérescence grâce à sa facilité de manipulation, la nature isogénique, la courte durée de vie, et sa transparence optique8. Pour étudier la stabilité de HTT in vivo, une construction de fusion a été exprimée dans le système nerveux de C. elegans. Un transgène HTT-D2 contenant soit un tronçon physiologique de 25Qs (HTTQ25-D2) ou un tronçon pathologique de 97Qs (HTTQ97-D2) est surexprimé pan-neuronal tout au long de la durée de vie du nématode9. En soumettant C. elegans en direct à un point de lumière bref et concentré, un seul neurone est photoswitched et le HTT-D2 converti est suivi au fil du temps. Pour établir la quantité de HTT-D2 dégradée, la différence entre le signal rouge du HTT-D2 fraîchement converti est comparée au signal rouge restant de HTT-D2 après une période déterminée. Par conséquent, il devient possible d’étudier comment la huntingtine est dégradée lorsqu’elle est trouvée sous sa forme étendue et toxique par rapport à sa forme physiologique; comment les neurones antérieurs ou postérieurs réagissent différemment à la présence de Q97 par rapport au Q25, en particulier sur des périodes prolongées; et comment l’effondrement du réseau de protéostase (PN) pendant le vieillissement contribuent aux différences dans les taux de dégradation. Ces résultats ne décrivent qu’un petit ensemble d’observations sur le chiffre d’affaires de HTT-D2. Cependant, beaucoup plus de questions biologiques pertinentes à la fois dans le domaine de l’agrégation des protéines et de la protéostasie peuvent être abordées avec cette application in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

Les protéines sont synthétisées et dégradées constamment dans une cellule pour maintenir l’homéostasie. Être capable de surveiller la dégradation d’une protéine d’intérêt est essentiel pour comprendre non seulement son cycle de vie, mais aussi pour découvrir les déséquilibres dans le réseau de protéostase. Cette méthode montre comment suivre la dégradation de la huntingtine protéique causant la maladie. Deux versions de huntingtine fusionnées à Dendra2 sont exprimées dans le système nerveux de C. elegans : une version physiologique ou une avec une étendue étendue et pathogène de glutamines. Dendra2 est une protéine fluorescente photoconvertible; sur une courte impulsion d’irradiation ultraviolette (UV), Dendra2 passe de vert à rouge ses spectres d’excitation/émission. Semblable à une expérience de chasse à l’impulsion, le chiffre d’affaires du red-Dendra2 converti peut être surveillé et quantifié, indépendamment de l’interférence de la nouvelle synthèse verte-Dendra2. À l’aide de la microscopie confocale et de la transparence optique de C. elegans,il est possible de surveiller et de quantifier la dégradation de huntingtin-Dendra2 dans un organisme vivant et vieillissant. La huntingtine neuronale-Dendra2 est partiellement dégradée peu après la conversion et effacée plus loin au fil du temps. Les systèmes contrôlant la dégradation sont déficients en présence de huntingtine mutante et sont encore altérés par le vieillissement. Les sous-types neuronaux du même système nerveux présentent des capacités de rotation différentes pour huntingtin-Dendra2. Dans l’ensemble, la surveillance de toute protéine d’intérêt fusionnée à Dendra2 peut fournir des informations importantes non seulement sur sa dégradation et les acteurs du réseau de protéostase impliqués, mais aussi sur son emplacement, le trafic et le transport.

Deux souches de nématode exprimant le fragment de protéine de huntingtine exon-1 dans le cadre avec la protéine photoconvertitible Dendra2 ont été obtenues par microinjection et les plasmides ont été conservés comme un tableau extrachromosomique. La construction de fusion a été exprimée dans l’ensemble du système nerveux de C. elegans du développement tout au long du vieillissement. Ici, HTT-D2 contenait soit l’étirement physiologique de 25 polyglutamine (HTTQ25...

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In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Présenté ici est un protocole pour surveiller la dégradation de la protéine huntingtine fusionnée au fluorophore photoconvertible Dendra2.

In Vivo Quantification du chiffre d’affaires des protéines dans le vieillissement C. Elegans à l’aide de Photoconvertible Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Ce protocole permet le suivi et la quantification de la dégradation d’une protéine d’intérêt pour les C.elegans vivants et vieillissants. Cette technique in vivo et non invasive ne nécessite que peu de microscopie mise en place pour convertir de manière fiable Dendra2 en fluorophore lumineux et stable. La méthode est adaptable aux systèmes mammifères, ainsi qu’au poisson zèbre.Pour étudier, mettre en chiffre d’affaires dans le réseau protéostasie ainsi que le transport et le trafic. Prenez soin de ne pas provoquer la conversion indésirable de Dendra2 lors de la numérisation avec le laser à lumière bleue, et de tester et d’optimiser les paramètres d’acquisition et de conversion pour chaque système et la protéine de fusion. Commencez par cultiver des nématodes appariés selon l’âge à 20 degrés Celsius jusqu’à l’âge désiré pour l’expérience.Le jour de l’expérience d’imagerie, faire fondre l’agarose de qualité générale à une concentration de 3 % dans l’eau distillée double. Pendant que l’agarose refroidit, coupez la pointe d’une pointe de pipette d’un millilitre pour faciliter l’aspiration d’environ 400 microlitres de l’agarose fondue. Ajouter délicatement quelques gouttes d’agarose sur une lame de verre propre et placer immédiatement une autre glissière sur le dessus des gouttes pour créer une mince garniture d’agarose entre les deux morceaux de verre.Lorsque l’agarose a séché, retirer délicatement la lame supérieure. Lorsque suffisamment de diapositives ont été préparées, ouvrez le logiciel de microscope confocal et définissez la voie de lumière pour l’excitation et l’émission. Pour le vert Dendra2 ajouter 486 à 553 nanomètres, et pour rouge Dendra2 ajouter 580 à 740 nanomètres.Ajustez la puissance et le gain des deux canaux en fonction de l’intensité du fluorophore et réglez le sténopé pour l’ouvrir complètement. Sélectionnez un mode canal séquentiel et réglez la piste pour changer chaque image. Définissez le mode d’analyse comme cadre et la taille du cadre comme 1024 d’ici 1024 avec une étape de ligne d’un.Réglez la moyenne à deux et à la moyenne par la méthode moyenne et le mode de ligne unidirectionnelle. Réglez la profondeur du bit en huit bits. Définissez le paramètre d’acquisition multidimensionnel pour la conversion de Dendra2.Pour la conversion et le blanchiment, utilisez le laser à diodes de 405 nanomètres réglé à 60% d’énergie. Sélectionnez une série de temps de deux cycles avec un intervalle de 0,0 milliseconde entre les cycles et un début et un arrêt normaux. Réglez le blanchiment pour commencer après l’analyse de l’un des deux, de répéter pendant 30 itérations et de s’arrêter lorsque l’intensité tombe à 50%Puis, définir la vitesse du pixel d’acquisition habiter à jeûner pour la conversion et à moyen pour capturer une image snap.Pour monter les nématodes sur les diapositives, utilisez un marqueur permanent pour dessiner et numéroter une fenêtre avec quatre carrés à l’opposé de la garniture agarose sur chaque diapositive. Ajouter 15 microlitres de levamisole au milieu de la garniture d’agarose et utiliser un microscope stéréo et un pic de fil à transférer pour les nématodes appariés par âge dans la gouttelette. Utilisez un pic de cils pour déplacer doucement chaque nématode dans une fenêtre du carré.Lorsque tous les nématodes ont été repositionnés, attendez que les vers aient cessé de bouger avant de placer un bordereau de couverture sur le liquide pour immobiliser les nématodes pendant l’imagerie. Ensuite, placez la lame sur l’étape du microscope confocal. Pour la conversion Dendra2 verte, utilisez l’oculaire de l’objectif 20 X sous fluorescence verte pour localiser le premier nématode et se concentrer sur la tête ou la queue.Passez au mode confocal et augmentez ou diminuez le gain et la puissance laser pour obtenir une image saturée, mais pas surexposée. Dessinez une région d’intérêt autour du neurone sélectionné et dessinez une deuxième plus grande région d’intérêt autour de la queue qui inclut la première région d’intérêt. Définissez la première région à être acquise, blanchie et analysée.Définissez la deuxième région d’intérêt à acquérir et à analyser, mais pas blanchie. Réglez la vitesse de numérisation au maximum et commencez l’analyse pour convertir les neurones Dendra2 sélectionnés. Immédiatement après la conversion, commencez la numérisation en direct avec le laser vert de 561 nanomètres pour visualiser Dendra2 dans le canal rouge et trouver la mise au point et la projection maximale respective du neurone converti.Réglez rapidement le taux d’analyse à une vitesse de vie de pixel inférieure et obtenez une image instantanée des deux canaux à une résolution plus élevée. Cette image est considérée à temps zéro après conversion. Ensuite, enregistrez l’analyse avec un nom et un numéro identifiables, suivi de l’étiquette de temps zéro.Pour suivre la dégradation de Dendra2 au fil du temps, ouvrez les temps zéro image du neurone nématode respectif. En utilisant le même paramètre d’image, commencez à numériser en direct dans le canal rouge et mettre le neurone rouge converti au point. Ensuite, sans modifier les paramètres d’acquisition, obtenez un instantané à la même vitesse que la première image.Assurez-vous de définir soigneusement votre paramètre de conversion pour convertir Dendra2 efficacement et suffisamment et pour maintenir les mêmes paramètres d’acquisition à travers différents points de temps. Pour analyser les images Dendra2 converties, ouvrez les images de point de temps zéro et de deuxième temps aux Fidji et ouvrez analyser et définir des mesures. Sélectionnez les fonctions zone et densité intégrée et sélectionnez l’image obtenue avec le canal rouge.À l’aide de l’outil de sélection polygone, dessiner une région d’intérêt autour du moment zéro neurone converti. Pour identifier correctement les contours du neurone, sélectionnez Image, Ajuster et Seuil pour mettre en évidence les seuils d’intensité. Une fois la sélection définie, cliquez sur Analyser et mesurer.Une fenêtre de résultats pop up apparaîtra, y compris la zone, la densité intégrée et les valeurs de densité intégrée brute pour la région d’intérêt sélectionnée. Effectuez le même processus de sélection et de mesure de l’image à partir du deuxième point de temps. Ensuite, copiez les valeurs dans la feuille de calcul.Dans cette analyse représentative avant la conversion, aucun signal rouge n’était visible lorsque l’échantillon était excité dans le canal rouge. Lors de l’irradiation, le signal vert a diminué à mesure que le HTT-D2 était converti et un signal rouge est apparu par la suite. L’expression HTT-D2 s’est dégradée au fil du temps, ce qui a entraîné une réduction des niveaux de signal HTT-D2 rouge et une augmentation possible du signal vert HTT-D2 à mesure que plus de protéines de fusion étaient nouvellement synthétisées.Notamment, les neurones de la région de la queue ont été déterminés pour être significativement plus actifs par rapport à ceux de la tête. En outre, il y avait significativement plus de dégradation du contrôle HTTQ25-D2 24 heures après la conversion, puis après deux heures dans la tête et les neurones de la queue. Cette différence n’a pas été observée dans HTTQ97-D2 pathogène, cependant, suggérant que le réseau de protéostasie n’ait pas pu enlever HTT-D2 contenant de plus longs étirements de glutamine dans tout le système nerveux.HTTQ97-D2 n’a pas été dégradé aussi efficacement que HTTQ25-D2 chez de très vieux nématodes, ce qui souligne l’incapacité du réseau de protéostasie à éliminer les espèces agrégées et peut-être toxiques de Huntingtine chez les animaux plus âgés. Fait important, les neurones de la queue ont été en mesure de faire face aux toxiques HTTQ97-D2 chez les jeunes nématodes, ce qui suggère que divers mécanismes concomitants du réseau protéostasie pourraient être à l’œuvre pour éliminer HTT-D2. Pour chaque échantillon acquérir et non surexposé et non saturé image immédiatement après la conversion et réutiliser le même paramètre pour cet échantillon au fil du temps.Avec ce protocole, il est possible de tester les changements dans un réseau de protéostases, et aussi, à l’aide d’une microscopie à super résolution, de suivre la propagation des protéines associées à la maladie.

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