Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

Wir würdigen die DFG (KI-1988/5-1 to JK, NeuroCure PhD fellowship by the NeuroCure Cluster of Excellence to MLP) für die Förderung. Wir würdigen auch die Imaging Core Facility des Leibniz-Forschungsinstituts für Molekulare Pharmakologie Berlin (FMP) für die Bereitstellung der Bildgebung. Darüber hinaus möchten wir uns bei Diogo Feleciano bedanken, der das Dendra2-System im Labor aufgebaut und Anweisungen gegeben hat.

1. Erzeugung von C. elegans, die neuronales Huntingtin-Dendra2-Fusionsprotein exdrücken
<ol><li>Klonen Sie das Gen, das für die POI kodiert, in einem Nematodenexpressionsvektor (d. h. pPD95_75, Addgene #1494), durch traditionelles Restriktionsenzym digest10, Gibson Assembly11oder jede Methode ihrer Wahl. Fügen Sie einen Promotor ein, um den Ausdruck in einem gewünschten Gewebe oder in einem gewünschten Entwicklungsstadium zu fördern. Setzen Sie das Dendra2-...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Mariol, M. 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I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo.">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis.">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).</li><li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells.">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li></ol>

Um die Funktion eines Proteins zu verstehen, ist es wichtig, seine Synthese, Seinen Standort und seine Degradation zu verstehen. Mit der Entwicklung neuartiger, stabiler und heller FPs ist die Visualisierung und Überwachung von POIs einfacher und effizienter geworden. Genetisch exprimierte Fusions-PAFPs wie Dendra2 sind einzigartig positioniert, um die Stabilität eines POI zu untersuchen. Bei der Exposition gegenüber lila-blauem Licht bricht Dendra2 an einer genauen Stelle innerhalb eines Dreiklangs konservierter Amin...

Das Proteom eines lebenden Organismus erneuert sich ständig. Proteine werden kontinuierlich abgebaut und entsprechend dem physiologischen Bedarf einer Zelle synthetisiert. Einige Proteine werden schnell eliminiert, während andere länger gelebt werden. Die Überwachung der Proteindynamik ist eine einfachere, genauere und weniger invasive Aufgabe bei der Verwendung genetisch kodierter fluoreszierender Proteine (FPs). FPs bilden sich autokatalytisch und können mit jedem Protein von Interesse (POI) verschmolzen werden, erfordern aber keine Enzyme, um Kofaktoren zu falten oder zu benötigen, außer Sauerstoff1. Eine neuere Generation von FPs wurde vor kurzem entwickelt, um die Farbe bei Bestrahlung mit einem Lichtimpuls von bestimmter Wellenlänge zu schalten. Diese photoaktivierbaren FPs (PAFPs) ermöglichen die Kennzeichnung und Nachverfolgung von POIs oder der Organellen oder Zellen, in denen sie sich befinden, und ihre quantitativen und/oder qualitativen Parameter zu untersuchen2. FPs ermöglichen es, die Bewegung, Die Richtung, die Bewegungsrate, den Diffusionskoeffizienten, die beweglichen oder unbeweglichen Fraktionen, die Zeit, zu der sie sich in einem Mobilfunkfach befindet, sowie die Fluktuationsrate zu verfolgen. Für bestimmte Organellen können Fortbewegung und Transport oder Spalt- und Fusionsereignisse bestimmt werden. Für einen bestimmten Zelltyp können die Position, die Division, das Volumen und die Form einer Zelle festgelegt werden. Entscheidend ist, dass die Verwendung von PAFPs tracking ohne kontinuierliche Visualisierung und ohne Interferenzen von neu synthetisierten Sonden ermöglicht. Studien sowohl an Zellen als auch an ganzen Organismen haben ERFOLGREICH PAFPs eingesetzt, um biologische Fragen in vivo zu behandeln, wie die Entwicklung von Krebs und Metastasen, die Montage oder Demontage des Zytoskeletts und DIE INTERAKTIONen zwischen RNA-DNA/Protein3. In diesem Manuskript werden Lichtmikroskopie und PAFPs verwendet, um die Fluktuationsraten des aggregationsanfälligen Proteins Huntingtin (HTT) in vivo in einem C. elegans Modell neurodegenerativer Erkrankungen aufzudecken.
Das hier beschriebene Protokoll quantifiziert die Stabilität und den Abbau des Fusionsproteins huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 ist eine monomere PAFP4 der zweiten Generation, die ihre Emissions-/Erregungsspektren als Reaktion auf UV oder sichtbares blaues Licht irreversibel von grün auf rot umstellt, mit einer Erhöhung ihrer Intensität um bis zu 4.000-fache5,6. Huntingtin ist das Protein, das für die Huntington-Krankheit (HUNTINGTON), eine tödliche erbliche neurodegenerative Störung, verantwortlich ist. Huntingtin exon-1 enthält eine Strecke von Glutaminen (CAG, Q). Wenn das Protein mit über 39Q exprimiert wird, wird es zu einem mutierten, toxischen und pathogenen Protein verkommen. Mutante HTT ist anfällig für Aggregation und führt zu neuronalen Zelltod und Degeneration, entweder als kurze oligomere Arten oder als größere hoch strukturierte Amyloide7.
Das Nematode ist ein Modellsystem zur Untersuchung von Alterung und Neurodegeneration dank seiner einfachen Manipulation, isogenen Natur, kurzen Lebensdauer und seiner optischen Transparenz8. Um die Stabilität von HTT in vivo zu untersuchen, wurde ein Fusionskonstrukt im Nervensystem von C. elegansausgedrückt. Ein HTT-D2-Transgen, das entweder eine physiologische Dehnung von 25Qs (HTTQ25-D2) oder eine pathologische Strecke von 97Qs (HTTQ97-D2) enthält, wird während der gesamten Lebensdauer der Nematode panneuronal überexprimiert9. Durch die Unterwerfung von lebenden C. elegans einem kurzen und fokussierten Lichtpunkt wird ein einzelnes Neuron photoswitched und der konvertierte HTT-D2 im Laufe der Zeit verfolgt. Um die Menge an HTT-D2 abgebaut zu ermitteln, wird die Differenz zwischen dem roten Signal des frisch umwandelten HTT-D2 mit dem verbleibenden roten Signal von HTT-D2 nach einem bestimmten Zeitraum verglichen. Daher wird es möglich zu untersuchen, wie Huntingtin abgebaut wird, wenn es in seiner erweiterten und toxischen Form im Vergleich zu seiner physiologischen Form gefunden wird; wie vordere oder hintere Neuronen unterschiedlich auf das Vorhandensein von Q97 im Vergleich zu Q25 reagieren, insbesondere über längere Zeiträume; und wie der Zusammenbruch des Proteostase-Netzwerks (PN) während des Alterns zu den Unterschieden bei den Abbauraten beiträgt. Diese Ergebnisse beschreiben nur eine kleine Reihe von Beobachtungen zum Umsatz von HTT-D2. Mit dieser In-vivo-Anwendung können jedoch viele weitere biologische Fragen behandelt werden, die sowohl für den Bereich der Proteinaggregation als auch für die Proteostase relevant sind.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

Proteine werden in einer Zelle ständig synthetisiert und abgebaut, um die Homöostase aufrechtzuerhalten. Die Möglichkeit, den Abbau eines Proteins von Interesse zu überwachen, ist der Schlüssel, um nicht nur seinen Lebenszyklus zu verstehen, sondern auch Ungleichgewichte im Proteostase-Netzwerk aufzudecken. Diese Methode zeigt, wie man den Abbau des krankheitserregenden Proteins Huntingtin nachverfolgt. Zwei Versionen von Huntingtin, die zu Dendra2 verschmolzen sind, werden im Nervensystem C. elegans ausgedrückt: eine physiologische Version oder eine mit einer erweiterten und pathogenen Strecke von Glutaminen. Dendra2 ist ein photokonvertierbares fluoreszierendes Protein; Bei einem kurzen ultravioletten (UV) Bestrahlungsimpuls schaltet Dendra2 seine Anregungs-/Emissionsspektren von grün auf rot. Ähnlich wie bei einem Puls-Chase-Experiment kann der Umsatz des umgebauten Rot-Dendra2 unabhängig von der Interferenz durch neu synthetisiertes Grün-Dendra2 überwacht und quantifiziert werden. Mit konfokaler Mikroskopie und aufgrund der optischen Transparenz von C. elegansist es möglich, den Abbau von Huntingtin-Dendra2 in einem lebenden, alternden Organismus zu überwachen und zu quantifizieren. Neuronale Huntingtin-Dendra2 wird kurz nach der Umwandlung teilweise abgebaut und im Laufe der Zeit weiter gerodet. Die Systeme, die den Abbau kontrollieren, sind in Gegenwart von mutiertem Huntingtin mangelhaft und durch das Altern weiter beeinträchtigt. Neuronale Subtypen innerhalb desselben Nervensystems weisen unterschiedliche Umsatzkapazitäten für Huntingtin-Dendra2 auf. Insgesamt kann die Überwachung jedes Proteins von Interesse, das zu Dendra2 verschmolzen ist, wichtige Informationen nicht nur über seine Verschlechterung und die Akteure des beteiligten Proteostase-Netzwerks liefern, sondern auch über seinen Standort, seinen Menschenhandel und seinen Transport.

Zwei Nematodenstämme, die das Huntingtin-Exon-1-Proteinfragment im Rahmen mit dem photoconvertibleprotein Dendra2 exzessierten, wurden durch Mikroinjektion erhalten und die Plasmide wurden als extrachromosomales Array gehalten. Das Fusionskonstrukt wurde im gesamten C. elegans Nervensystem von der Entwicklung während des alternden Alterung ausgedrückt. Hier enthielt HTT-D2 entweder die physiologische 25 Polyglutamin-Dehnung (HTTQ25-D2, Abbildung 1...

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In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Hier wird ein Protokoll zur Überwachung des Abbaus des mit dem photokonvertierbaren Fluorophor Dendra2 verschmolzenen Proteins Huntingtin vorgestellt.

In Vivo Quantifizierung des Proteinumsatzes im Alter C. Elegans mit Photoconvertible Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Verfolgung und Quantifizierung des Abbaus eines Proteins von Interesse an lebenden und alternden C.elegans. Diese in vivo und nichtinvasive Technik erfordert nur wenig Mikroskopie eingerichtet, um Dendra2 zuverlässig in ein helles und stabiles Fluorophor umzuwandeln. Die Methode ist an Säugetiersysteme sowie Zebrafische anpassungsfähig.Zu studieren, in Umsatz innerhalb des Proteostatis-Netzwerks sowie Transport und Menschenhandel setzen. Achten Sie darauf, keine unerwünschte Konvertierung von Dendra2 beim Scannen mit dem Blaulichtlaser zu provozieren und die Erfassungseinstellungen und Konvertierungseinstellungen für jedes System und Fusion-Protein zu testen und zu optimieren. Beginnen Sie mit dem Anbau altersgerechter Nematoden bei 20 Grad Celsius auf das gewünschte Alter für das Experiment.Am Tag des bildgebenden Experiments entstand in einer Konzentration von 3% in doppelt destilliertem Wasser eine Schmelze-Allgemeinatrat-Agarose. Während die Agarose abkühlt, schneiden Sie die Spitze einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze, um die Aspiration von ca. 400 Mikrolitern der geschmolzenen Agarose zu erleichtern. Fügen Sie vorsichtig ein paar Tropfen Agarose auf eine saubere Glasrutsche und legen Sie sofort eine weitere Rutsche auf die Tropfen, um ein dünnes Pad Von-Agarose zwischen den beiden Glasstücken zu schaffen.Wenn die Agarose getrocknet ist, entfernen Sie vorsichtig die obere Rutsche. Wenn genügend Dias vorbereitet wurden, öffnen Sie die konfokale Mikroskop-Software und stellen Sie den Lichtpfad für Anregung und Emission ein. Für grüne Dendra2 486 bis 553 Nanometer hinzufügen, und für rote Dendra2 fügen Sie 580 bis 740 Nanometer hinzu.Stellen Sie die Leistung und Verstärkung beider Kanäle entsprechend der Intensität des Fluorophors ein und stellen Sie das Loch auf vollständig geöffnet ein. Wählen Sie einen sequenziellen Kanalmodus aus, und legen Sie die Spur so fest, dass sie jeden Frame wechselt. Legen Sie den Scanmodus als Rahmen und die Rahmengröße auf 1024 bis 1024 mit einem Linienschritt von 1 fest.Legen Sie die Mittelung auf zwei und die mittlere Methode und den Modus der unidirektionalen Linie auf den Mittelwert fest. Stellen Sie die Bittiefe auf acht Bit fest. Definieren Sie die multidimensionale Erfassungseinstellung für die Konvertierung von Dendra2.Verwenden Sie für die Umwandlung und Dasbleichung den 405 Nanometer Diodenlaser, der auf 60 % Energieleistung eingestellt ist. Wählen Sie eine Zeitreihe von zwei Zyklen mit einem Intervall von 0,0 Millisekunden zwischen den Zyklen und einem normalen Start und Stopp aus. Legen Sie die Bleichen nach dem Scannen einer von zwei zu starten, für 30 Iterationen zu wiederholen und zu stoppen, wenn die Intensität auf 50% sinkt Dann definieren Sie die Geschwindigkeit der Erfassung Pixel wohnen schnell für die Konvertierung und auf Medium für die Aufnahme eines Snap-Bild.Um die Nematoden auf den Dias zu montieren, verwenden Sie einen permanenten Marker, um ein Fenster mit vier Quadraten auf der gegenüberliegenden Seite des Agarose-Pads auf jeder Folie zu zeichnen und zu nummerieren. Fügen Sie 15 Mikroliter Levamisol in die Mitte des Agarose-Pads und verwenden Sie ein Stereomikroskop und einen Drahtpick, um für altersgerechte Nematoden in das Tröpfchen zu übertragen. Verwenden Sie eine Wimpernauswahl, um jede Nematode sanft in ein Fenster des Quadrats zu bewegen.Wenn alle Nematoden neu positioniert wurden, warten Sie, bis sich die Würmer nicht mehr bewegen, bevor Sie einen Deckelschlupf über die Flüssigkeit legen, um die Nematoden während der Bildgebung zu immobilisieren. Legen Sie dann die Folie auf die konfokale Mikroskopstufe. Für grüne Dendra2-Umwandlung verwenden Sie das Okular des 20 X Objektivs unter grüner Fluoreszenz, um die erste Nematode zu lokalisieren und sich auf den Kopf oder Schwanz zu konzentrieren.Wechseln Sie in den konfokalen Modus und erhöhen oder verringern Sie die Verstärkung und Laserleistung, um ein gesättigtes, aber nicht überbelichtetes Bild zu erhalten. Zeichnen Sie eine Region von Interesse um das ausgewählte Neuron und ziehen Sie eine zweite größere Region von Interesse um den Schwanz, die die erste Region von Interesse enthält. Legen Sie die erste region fest, die erworben, gebleicht und analysiert werden soll.Legen Sie den zweiten Bereich fest, der erworben und analysiert, aber nicht gebleicht werden soll. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf maximum ein und starten Sie den Scan, um die ausgewählten Dendra2-Neuronen zu konvertieren. Unmittelbar nach der Konvertierung beginnen Sie mit dem Grünen 561 Nanometer Laser mit dem Live-Scannen, um Dendra2 im roten Kanal zu visualisieren und den Fokus und die jeweilige maximale Projektion des umgewandelten Neurons zu finden.Stellen Sie die Scanrate schnell auf eine niedrigere Pixelverweilgeschwindigkeit ein und erfassen Sie ein Snapshot-Bild beider Kanäle mit einer höheren Auflösung. Dieses Bild wird nach der Konvertierung zum Zeitpunkt Null betrachtet. Speichern Sie dann den Scan mit einem identifizierbaren Namen und einer Nummer, gefolgt von der Bezeichnung "Zeit null".Um den Dendra2-Abbau im Laufe der Zeit zu verfolgen, öffnen Sie das Mal Nullbild des jeweiligen Nematoden-Neurons. Mit der gleichen Bildeinstellung beginnen Sie live im roten Kanal zu scannen und das konvertierte rote Neuron in den Fokus zu rücken. Dann, ohne Erfassungsparameter zu ändern, erhalten Sie einen Snapshot mit der gleichen Geschwindigkeit wie das erste Bild.Achten Sie darauf, Ihre Konvertierungseinstellung sorgfältig zu definieren, um Dendra2 effizient und ausreichend zu konvertieren und die gleichen Erfassungsparameter über verschiedene Zeitpunkte hinweg beizubehalten. Um die konvertierten Dendra2-Bilder zu analysieren, öffnen Sie die Zeit-Null- und zweiten Zeitpunktbilder in Fidschi und öffnen Sie "Messungen analysieren und festlegen". Wählen Sie die Funktionen Fläche und integrierte Dichte aus, und wählen Sie das Bild aus, das mit dem roten Kanal erhalten wurde.Zeichnen Sie mit dem Polygonauswahlwerkzeug einen Interessenbereich um die Zeit Null konvertiertes Neuron. Um die Konturen des Neurons richtig zu identifizieren, wählen Sie Bild, Anpassen und Schwellenwert aus, um die Intensitätsschwellen hervorzuheben. Nachdem die Auswahl definiert wurde, klicken Sie auf Analysieren und Messen.Es wird ein Popup-Ergebnisfenster angezeigt, das die Flächen-, integrierten Dichte- und integrierten Rohdichtewerte für den ausgewählten Interessenbereich einschließen wird. Führen Sie den gleichen Auswahl- und Messprozess für das Bild ab dem zweiten Zeitpunkt durch. Kopieren Sie dann die Werte in die Kalkulationstabelle.In dieser repräsentativen Analyse vor der Konvertierung war kein rotes Signal sichtbar, wenn die Probe im roten Kanal angeregt wurde. Bei bestrahlung verringerte sich das grüne Signal, als HTT-D2 umgewandelt wurde und anschließend ein rotes Signal erschien. HTT-D2-Expression im Laufe der Zeit abgebaut, was zu einer Verringerung der Niveaus des roten HTT-D2-Signals und eine mögliche Erhöhung des grünen HTT-D2-Signals, da mehr Fusion Protein neu synthetisiert wurde.Insbesondere wurden die Neuronen der Schwanzregion als signifikant aktiver im Vergleich zu denen des Kopfes bestimmt. Darüber hinaus gab es deutlich mehr Abbau der Kontrolle HTTQ25-D2 24 Stunden nach der Umwandlung, dann nach zwei Stunden in den Kopf und Schwanz Neuronen. Dieser Unterschied wurde bei pathogenen HTTQ97-D2 nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass das Proteostase-Netzwerk nicht in der Lage war, HTT-D2 zu entfernen, das längere Glutamin-Strecken im gesamten Nervensystem enthält.HTTQ97-D2 wurde nicht so effizient abgebaut wie HTTQ25-D2 in sehr alten Nematoden, was die Unfähigkeit des Proteostase-Netzwerks unterstreicht, aggregierte und möglicherweise toxische Arten von Huntingtin bei älteren Tieren zu entfernen. Wichtig ist, Schwanz neuronen waren in der Lage, mit toxischen HTTQ97-D2 in jungen Nematoden zu bewältigen, was darauf hindeutet, dass verschiedene begleite Proteostase Netzwerkmechanismen am Werk sein könnte, um HTT-D2 zu entfernen. Für jede Probe erfassen und nicht überbelichtet und ungesättigte Bild unmittelbar nach der Konvertierung und wiederverwenden sie die gleiche Einstellung für diese Probe im Laufe der Zeit.Mit diesem Protokoll ist es möglich, Veränderungen in einem Proteostatis-Netzwerk zu testen und mit Hilfe der superhochauflösenden Mikroskopie die Ausbreitung von krankheitsassoziierten Proteinen zu verfolgen.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Forschung

Biologie

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

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In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

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Überwachung des Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen unter Verwendung eines Degron (DGN)-destabilisiert Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Reporter Protein

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Antikörperfärbung in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Mit der &quot;Freeze--Cracking&quot;

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Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

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Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

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Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

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Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

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Messung der RAN-Peptidtoxizität in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...