Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

אנו מכירים את DFG (KI-1988/5-1 לייק, מלגת נוירוקיור PhD על ידי מקבץ המצוינות של נוירוקיור כדי MLP) למימון. אנו מכירים גם את מתקן ליבת ההדמיה של המכון לחקר לייבניץ לפרמקולוגיה מולקולרית ברלין (FMP) לאספקת ההדמיה להגדיר. בנוסף, אנו רוצים להודות לדיוגו פללאנו שהקים את מערכת Dendra2 במעבדה וסיפק הוראות.

1. דור של C. אלגיה המבטא חלבון היתוך הDendra2
<ol><li>שיבוט הקידוד הגנטי פוי ב ביטוי נמטודות וקטור (כלומר, pPD95_75, addgene #1494), על ידי הגבלה אנזים ההגבלה המסורתית10, גיבסון האסיפה11, או כל שיטה של בחירה. הכנס מקדם לביטוי כונן ברקמה רצויה או בשלב התפתחותי רצוי. הכנס את Dendra2 fluoropho...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).</li><li>Kreis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylation+of+the+actin-binding+protein+drebrin+controls+oxidation+stress-resistance+in+mammalian+neurons+and+C.+elegans.">ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ubiquitinated+huntingtin+species+in+intracellular+aggregates.">Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).</li><li>Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo.">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+and+analysis+of+age-related+changes+in+Caenorhabditis+elegans.">The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+the+nervous+system.">Specification of the nervous system.</a> WormBook. , 1-19 (2005).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration?.">What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).</li><li>Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+enhanced+photoconversion+yield+in+green+fluorescent+protein-like+protein+Dendra2.">Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2.</a> Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).</li><li>Tsvetkov, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteostasis+of+polyglutamine+varies+among+neurons+and+predicts+neurodegeneration.">Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration.</a> Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).</li><li>Feleciano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis.">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).</li><li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells.">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li></ol>

כדי להבין את תפקודי החלבון חשוב להבין את הסינתזה, המיקום וההשפלה שלו. עם פיתוח של רומן, יציב, FPs בהיר, המחשה וניטור POIs הפך קל יותר ויעיל יותר. מבחינה גנטית הביע פפס היתוך כגון Dendra2 ממוקמים באופן ייחודי כדי ללמוד את יציבותו של פוי. עם החשיפה לאור סגול-כחול, Dendra2 מתפרק במיקום מדויק בתוך משולש של ח...

הפרוטאום של אורגניזם חי מתחדש באופן תמידי. חלבונים מושפל ברציפות ומסונתז בהתאם לדרישת הפיסיולוגית של תא. חלבונים מסוימים מסולקים במהירות, בעוד אחרים חיים יותר. ניטור הדינמיקה חלבון הוא משימה פשוטה יותר, מדויקת יותר, פחות פולשנית בעת שימוש בחלבונים פלואורסצנטי מקודד גנטית (FPs). FPs טופס אוטוזרז והוא יכול להיות מותך כל חלבון של עניין (פוי), אבל לא דורשים אנזימים לקפל או צריך קופנים לשמור עבור חמצן1. דור חדש של FPs ההונדס לאחרונה כדי לעבור צבע על הקרנה עם דופק קל של אורך גל נקבע. התמונות האלה FPs (פפס) לאפשר תיוג ומעקב של POIs, או ארגונית או התאים שהם מתגוררים, וכיצד לבחון את הפרמטרים כמותיים ו/או איכותניים שלהם2. FPs לאפשר מעקב אחר כל התנועה של פוי, כיוון, שיעור של תנועה, מקדם דיפוזיה, נייד לעומת שברים משותק, הזמן שהוא שוכן בתא הסלולר אחד, כמו גם קצב המחזור שלה. ניתן לקבוע את התנועה לארגון מסוים, לתחבורה, לאירועים ביקוע ולהיתוך. עבור סוג תא מסוים, ניתן ליצור מיקום תא, קצב החילוק, אמצעי האחסון והצורה. באופן מכריע, השימוש ב-פפס מאפשר מעקב ללא הדמיה רציפה וללא הפרעות מכל מכשיר שהוא לאחרונה. מחקרים הן בתאים והן באורגניזמים שלמים המועסקים בהצלחה פפס לטיפול שאלות ביולוגיות בvivo, כגון התפתחות של סרטן גרורות, הרכבה או פירוק של שלד התא, ו-RNA-DNA/חלבון אינטראקציות3. בכתב יד זה, מיקרוסקופ אור ו פפס משמשים כדי לחשוף את שיעורי המחזור של huntingtin חלבון הנוטה לצבור (HTT) בvivo במודל של C. אלגיה של מחלת ניווניות.
הפרוטוקול המתואר כאן ככמת את היציבות וההשפלה של חלבון ההיתוך huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 הוא הדור השני monomeric פמפ4 כי בוררים הפיך הפליטה שלה/עירור ספקטרום מירוק לאדום בתגובה או UV או אור כחול גלוי, עם גידול בעוצמתו של עד 4,000-קיפול5,6. Huntingtin הוא החלבון האחראי לגרימת מחלת הנטינגטון (HD), הפרעת ניווניות תורשתי קטלנית. הhuntingtin exon-1 מכיל קטע של glutamines (הקאג, Q). כאשר החלבון מתבטא עם מעל 39, הוא מתקפל לתוך חלבון מוטציה, רעיל ופתוגניים. מוטציה HTT הוא נוטה לצבור ומוביל מוות עצבי תאים וניוון, או מינים oligomeric קצרים או גדול מאוד בנוי amyloids7.
נמטודות היא מערכת מודל ללמוד הזדקנות ניוון נוירואני בזכות הקלות של מניפולציה, הטבע האיזוגני, תוחלת חיים קצרה, ושקיפות אופטית שלה8. כדי ללמוד את יציבותו של HTT בvivo, מבנה היתוך התבטא במערכת העצבים של הג. העברה של HTT-D2 המכיל מתיחה פיזיולוגית של 25Qs (HTTQ25-D2) או מתיחה פתולוגית של 97Qs (HTTQ97-D2) הוא הביע מוגזם פאן-neuronally בכל תקופת החיים של nematode9. על ידי העברת החיים C. אלגיה לנקודה קצרה וממוקדת של אור, תא העצב בודד הוא מיתוג והמרה htt-D2 מתבצע במשך הזמן. כדי לקבוע את כמות HTT-D2 המושפל, ההפרש בין האות האדום של HTT-D2 הטרי המומר מושווה לאות האדום הנותרים של HTT-D2 לאחר פרק זמן קבוע. לפיכך, ניתן לחקור את האופן שבו הונטינטין מושפל כאשר הוא נמצא בצורתו המורחבת והרעילה בהשוואה לצורתו הפיזיולוגית; כיצד הנוירונים הקדמי או האחורי להגיב באופן שונה לנוכחות של Q97 לעומת Q25, במיוחד על תקופות זמן ממושך; וכיצד התמוטטות הרשת פרוטאוסטזיס (PN) במהלך הזדקנות תורמים להבדלים בשיעורי השפלה. תוצאות אלה מתארות רק קבוצה קטנה של תצפיות על תחלופת HTT-D2. עם זאת, שאלות רבות יותר ביולוגיות הרלוונטיות הן לתחום של צבירת חלבון ו פרוטאוסטזיס יכול להיות ממוען עם זה ביישום vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

חלבונים מסונתז ומושפל באופן קבוע בתוך התא כדי לשמור על הומאוסטזיס. היכולת לפקח על השפלה של חלבון של עניין היא המפתח להבנת לא רק מחזור החיים שלה, אלא גם לחשוף חוסר איזון ברשת פרוטאוסטזיס. שיטה זו מראה כיצד לעקוב אחר ההשפלה של מחלת החלבון הגורם למחלות. שתי גרסאות של huntingtin התמזגו ל Dendra2 מבוטא במערכת העצבים של C. אלגיה : גרסה פיזיולוגית או אחת עם מתיחה מורחבת ופתוגניים של glutamines. Dendra2 הוא חלבון פלורסנט פוטולהמרה; על פולס אולטרה סגול (UV) הקרנה, Dendra2 מעביר את הריגוש שלה/פליטה ספקטרום מירוק לאדום. בדומה לניסוי מרדף דופק, המחזור של red-Dendra2 המרה יכול להיות מנוטר וכימות, ללא קשר להפרעה מחדש מסונתז ירוק-Dendra2. בעזרת מיקרוסקופ מבוסס-מיקוד ובגלל השקיפות האופטית של ה -"אלאלגיה", ניתן לנטר ולכמת את ההשפלה של הDendra2 באורגניזם חי ומזדקן. הDendra2 הנוירוונאליות מושפלת באופן חלקי מיד לאחר ההמרה ומנוקה לאורך זמן. מערכת השליטה בירידה בנוכחות מוטציות huntingtin והיא לקויה עוד יותר עם הזדקנות. תת העצבי בתוך מערכת העצבים אותה מוצג קיבולות מחזור שונות עבור huntingtin-Dendra2. בסך הכל, ניטור כל חלבון של עניין התמזגו Dendra2 יכול לספק מידע חשוב לא רק על השפלה שלה ואת השחקנים של הרשת פרוטאוסטזיס מעורב, אלא גם על מיקומו, סחר, ותחבורה.

שני זנים נמטודות המבטא huntingtin exon-1 מרסיס חלבון במסגרת עם Dendra2 חלבון ההמרה התקבלו באמצעות מיקרוהזרקות והפלמידים נשמרו כמערך מיותר כרומוזומלית. בניית ההיתוך באה לידי ביטוי במערכת העצבים השלמה מהתפתחות הזדקנות ברחבי העולם. כאן, HTT-D2 הכיל את המתיחה הפיזיולוגית 25 polyglutamine (H...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

מוצג כאן הוא פרוטוקול כדי לפקח על השפלה של החלבון huntingtin התמזגו הפוטוורידים פלואורואופפור Dendra2.

ב Vivo פיקציה של מחזור החלבון בהזדקנות C. אלגיה באמצעות Photoconvertible המרה Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

פרוטוקול זה מאפשר מעקב וכמות של השפלה של חלבון של עניין חי ומזדקן C.elegans. טכניקה זו של vivo ו- noninvasive דורשת רק מיקרוסקופיה קטנה להגדיר כדי להמיר באופן אמין Dendra2 לתוך פלואורופור בהיר ויציב. השיטה מותאמת למערכות יונקים, כמו גם דגי זברה.כדי ללמוד, לשים במחזור בתוך רשת פרוטאוסטטיס, כמו גם תחבורה וסחר. יש לדאוג לא לעורר המרה לא רצויה של Dendra2 בעת סריקה עם לייזר אור כחול, כדי לבדוק ולמטב את הגדרות הרכישה ואת הגדרות ההמרה עבור כל מערכת וחלבון היתוך. התחילו בגידול נמטודות תואמות גיל ב-20 מעלות צלזיוס לגיל הרצוי לניסוי.ביום ניסוי ההדמיה, ההמסה הכללית עלתה בריכוז של 3% במים מזוקקים כפולים. בעוד אגרוז הוא קירור, לחתוך את הקצה של קצה פיפטה מיליליטר אחד כדי להקל על השאיפה של כ 400 microliters של אגרוז נמס. בזהירות להוסיף כמה טיפות של agarose על מגלשת זכוכית נקייה מיד למקם שקופית נוספת על גבי הטיפות כדי ליצור כרית דקה של agarose בין שתי חתיכות זכוכית.כאשר ההתעוררות התייבשה, הסר בזהירות את השקופית העליונה. כאשר הוכנו מספיק שקופיות, פתח את תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקל והגדר את נתיב האור לגירוש ו הפליטה. עבור Dendra2 ירוק להוסיף 486 כדי 553 ננומטר, עבור אדום Dendra2 להוסיף 580 כדי 740 ננומטר.התאימו את העוצמה וההתפתחות של שני הערוצים בהתאם לעוצמת הפלואורופור והגדירו את חור הסיכה לפתיחה מלאה. בחרו מצב ערוץ רציף והגדירו את הרצועה כך שתחליף כל פריים. הגדר את מצב הסריקה כמסגרת ואת גודל המסגרת כ- 1024 על 1024 עם שלב שורה של אחד.הגדר את הממוצע לשניים ולממוצע לפי השיטה והאופן הממוצעים של קו חד-כיווני. הגדר את עומק הסיביות לשמונה סיביות. הגדר את הגדרת הרכישה הרב-מידנית עבור ההמרה של Dendra2.להמרה והלבנה, השתמש בלייזר דיודה 405 ננומטר מוגדר 60% כוח אנרגיה. בחר סדרת זמן של שני מחזורים עם מרווח זמן של 0.0 אלפיות שניה בין המחזורים והתחלה ועיבור רגילים. הגדר את ההלבנה להתחיל לאחר סריקה אחת משתיים, לחזור על 30 איטראציות ולהפסיק כאשר העוצמה יורדת ל 50%לאחר מכן, להגדיר את המהירות של פיקסל הרכישה להתעכב מהר להמרה ובינונית ללכידת תמונת הצמדה.כדי לטעון את nematodes על השקופיות, להשתמש בסמן קבוע לצייר ולמספר חלון עם ארבעה ריבועים על ההפך של כרית agarose על כל שקופית. הוסף 15 microliters של levamisole לאמצע כרית אגרוז ולהשתמש מיקרוסקופ סטריאו בחירה חוטית להעביר עבור nematodes תואם גיל לתוך טיפה. השתמש בפיק ריסים כדי להזיז בעדינות כל נמטודה לחלון אחד של הריבוע.כאשר כל הנמטודות מוצבות מחדש, המתן עד שהתולעים יפסיקו לנוע לפני הנחת החלקת כיסוי על הנוזל כדי לשתק את הנמטודות במהלך ההדמיה. לאחר מכן, מקם את השקופית על שלב המיקרוסקופ הקונפוקל. להמרה ירוקה Dendra2, להשתמש בעין של המטרה 20 X תחת פלואורסצנטיות ירוקה כדי לאתר את nematode הראשון ולהתמקד בראש או בזנב.עבור למצב confocal ולהגדיל או להקטין את הרווח ואת כוח הלייזר כדי להשיג תמונה רוויה, אך לא יתר על המידה. צייר אזור עניין סביב הנוירון שנבחר וצייר אזור עניין גדול יותר סביב הזנב הכולל את האזור הראשון של עניין. הגדר את האזור הראשון שיש לרכוש, להלבין ולנתח.הגדר את האזור השני של עניין להיות נרכש וניתוח, אבל לא מולבן. הגדר את מהירות הסריקה למקסימום והתחל את הסריקה כדי להמיר את תאי העצב הנבחרים של Dendra2. מיד לאחר ההמרה, להתחיל סריקה חיה עם לייזר 561 ננומטר ירוק כדי לדמיין Dendra2 בערוץ האדום ולמצוא את המיקוד ואת ההקרנה המרבית בהתאמה של הנוירון המרה.הגדר במהירות את קצב הסריקה למהירות נמוכה יותר של עכבות פיקסלים ורכוש תמונת מצב של שני הערוצים ברזולוציה גבוהה יותר. תמונה זו נחשבת בזמן אפס לאחר ההמרה. לאחר מכן, שמור את הסריקה בשם או במספר הניתנים לזיהוי, ולאחר מכן את תווית הזמן אפס.כדי לעקוב אחר השפלה Dendra2 לאורך זמן, לפתוח את התמונה אפס פעמים של נוירון nematode בהתאמה. באמצעות אותה הגדרת תמונה, התחילו לסרוק בשידור חי בערוץ האדום והכניסו את הנוירון האדום שהומר לפוקוס. לאחר מכן, מבלי לשנות פרמטרי רכישה כלשהם, השג תמונה באותה מהירות כמו התמונה הראשונה.הקפד להגדיר את הגדרת ההמרה שלך בקפידה כדי להמיר Dendra2 ביעילות ובאופן מספיק כדי לשמור על אותם פרמטרי רכישה לאורך נקודות זמן שונות. כדי לנתח את תמונות Dendra2 שהומרו, פתחו את תמונות נקודת הזמן אפס והזמן השני בפיג'י ופתחו את 'נתח' ו'קבע מידות'. בחרו בפונקציות 'אזור' ו'דחיסות משולבת' ובחרו בתמונה שהושגה בערוץ האדום.בעזרת הכלי בחירת מצולע, צייר אזור מעניין בערך בזמן שבו אפס נוירון שהומר. לזיהוי נכון של קווי המתאר של הנוירון, בחרו 'תמונה', 'התאם' ו'סף' כדי לסמן את ספי העוצמה. לאחר הגדרת הבחירה, לחץ על נתח ולמדוד.יופיע חלון תוצאות מוקפץ, כולל האזור, הצפיפות המשולבת וערכי הצפיפות המשולבת הגולמית עבור אזור העניין שנבחר. בצעו את אותו תהליך בחירה ומדידה לתמונה מנקודת הזמן השנייה. לאחר מכן, העתק את הערכים לגיליון האלקטרוני.בניתוח מייצג זה לפני ההמרה, לא היה אות אדום גלוי כאשר המדגם התרגש בערוץ האדום. עם הקרנה, האות הירוק פחת כמו HTT-D2 הומר אות אדום לאחר מכן הופיע. ביטוי HTT-D2 התדרדר עם הזמן, וכתוצאה מכך ירידה ברמות של אות HTT-D2 אדום עלייה אפשרית של אות HTT-D2 ירוק כמו חלבון היתוך יותר היה מסונתז לאחרונה.יש לציין, הנוירונים של אזור הזנב נקבעו להיות פעילים יותר באופן משמעותי בהשוואה לאלה של הראש. יתר על כן, הייתה השפלה משמעותית יותר של שליטה HTTQ25-D2 24 שעות לאחר ההמרה, ולאחר שעתיים הן נוירונים הראש והזנב. הבדל זה לא נצפתה HTTQ97-D2 פתוגניים, עם זאת, מה שמרמז כי רשת פרוטאוסטאזיס לא היתה מסוגלת להסיר HTT-D2 המכיל מתיחות גלוטמין ארוכות יותר בכל מערכת העצבים.HTTQ97-D2 לא היה מושפל ביעילות כמו HTTQ25-D2 ב nematodes הישן מאוד, הדגשת חוסר היכולת של רשת פרוטאוסטיס להסיר מינים מצטברים ואולי רעילים של הנטינגטון בבעלי חיים מבוגרים. חשוב לציין, נוירונים זנב הצליחו להתמודד עם HTTQ97-D2 רעילים ב nematodes צעירים, מה שמרמז כי מנגנוני רשת פרוטאוסטזיס במקביל שונים עשויים להיות בעבודה כדי להסיר HTT-D2. עבור כל רכישה לדוגמה ותמונה שאינה מוסברת יתר על כן ותמונה לא רוויה מיד לאחר ההמרה ותיוו לעשות שימוש חוזר באותה הגדרה עבור מדגם זה לאורך זמן.עם פרוטוקול זה, ניתן לבדוק שינויים ברשת פרוטאוסטטיס, וגם, בעזרת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, כדי לעקוב אחר התפשטות של חלבונים הקשורים למחלות.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

ניטור של פעילות יוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים באמצעות ערער-חלבון Degron (DGN) ירוק פלורסנט חלבון (GFP)-מבוסס כתב

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

נוגדן מכתים ב<em&gt; ג Elegans</em&gt; שימוש &quot;Freeze-פיצוח&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

מעקב וכימות תהליכים התפתחותיים ב<em&gt; C. elegans</em&gt; שימוש בכלי קוד פתוח

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

מדידות התגובות הפיזיולוגיות של הלחץ בג. אלגיה

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

מדידת רעילות ב -C. אלגיה

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...