Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
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हम वित्तपोषण के लिए एमएलपी को उत्कृष्टता के न्यूरोक्योर क्लस्टर द्वारा जेके, न्यूरोक्योर पीएचडी फैलोशिप को डीएफजी (KI-1988/5-1) स्वीकार करते हैं। हम इमेजिंग सेट अप प्रदान करने के लिए लीबनिज रिसर्च इंस्टीट्यूट फॉर मॉलिक्यूलर फार्माकोलॉजी बर्लिन (एफएमपी) की इमेजिंग कोर सुविधा को भी स्वीकार करते हैं। इसके अलावा, हम डायोगो फेलेसियानो का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं जिन्होंने लैब में Dendra2 सिस्टम की स्थापना की और निर्देश दिए ।

1. न्यूरोनल हंटिंगटिन-Dendra2 फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त सी एलिगेंस की पीढ़ी
<ol><li>पारंपरिक प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट 10, गिब्सनअसेंबली11,या पसंद की किसी भी विधि द्वारा एक सूत्रकृमि अभिव्यक्त?...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).</li><li>Kreis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylation+of+the+actin-binding+protein+drebrin+controls+oxidation+stress-resistance+in+mammalian+neurons+and+C.+elegans.">ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ubiquitinated+huntingtin+species+in+intracellular+aggregates.">Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).</li><li>Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo.">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+and+analysis+of+age-related+changes+in+Caenorhabditis+elegans.">The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+the+nervous+system.">Specification of the nervous system.</a> WormBook. , 1-19 (2005).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration?.">What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).</li><li>Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+enhanced+photoconversion+yield+in+green+fluorescent+protein-like+protein+Dendra2.">Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2.</a> Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).</li><li>Tsvetkov, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteostasis+of+polyglutamine+varies+among+neurons+and+predicts+neurodegeneration.">Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration.</a> Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).</li><li>Feleciano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis.">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).</li><li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells.">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li></ol>

प्रोटीन के कार्य को समझने के लिए इसके संश्लेषण, स्थान और गिरावट को समझना महत्वपूर्ण है। उपन्यास, स्थिर और उज्ज्वल एफपीएस के विकास के साथ, पीओआई की कल्पना और निगरानी करना आसान और अधिक कुशल हो गया है। आनु?...

जीव-जीव का प्रोटेम लगातार खुद का नवीनीकरण कर रहा है। प्रोटीन को कोशिका की शारीरिक मांग के अनुसार लगातार अपमानित और संश्लेषित किया जाता है। कुछ प्रोटीन जल्दी खत्म हो जाते हैं, जबकि अन्य लंबे समय तक रहते हैं। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपीएस) का उपयोग करते समय प्रोटीन गतिशीलता की निगरानी करना एक सरल, अधिक सटीक और कम आक्रामक कार्य है। एफपीएस ऑटोटैक्टिटिक रूप से बनाते हैं और किसी भी प्रोटीन ऑफ इंटरेस्ट (पीओआई) में शामिल हो सकते हैं, लेकिन एंजाइमों को गुना करने की आवश्यकता नहीं है या ऑक्सीजन1के लिए कोफैक्टर बचाने की आवश्यकता नहीं है। एफपीएस की एक नई पीढ़ी को हाल ही में निर्धारित तरंगदैर्ध्य की हल्की नब्ज के साथ विकिरण पर रंग स्विच करने के लिए इंजीनियर किया गया है। ये फोटोएक्टिवेट एफपीएस (PAFPs) पीओआई, या ऑर्गेनेल्स या कोशिकाओं की लेबलिंग और ट्रैकिंग के लिए अनुमति देते हैं, और उनके मात्रात्मक और/या गुणात्मक मापदंडों की जांच करने के लिए2। एफपीएस किसी भी पीओआई के आंदोलन, दिशात्मकता, लोकोमोशन की दर, प्रसार के गुणांक, मोबाइल बनाम स्थिर अंशों को ट्रैक करना संभव बनाते हैं, यह समय एक सेलुलर डिब्बे में रहता है, साथ ही साथ इसकी कारोबार दर भी। विशिष्ट ऑर्गेनेल्स के लिए, लोकोमोशन और परिवहन, या विखंडन और संलयन घटनाओं का निर्धारण किया जा सकता है। एक विशेष सेल प्रकार के लिए, एक सेल की स्थिति, विभाजन की दर, मात्रा, और आकार स्थापित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, PAFPs का उपयोग निरंतर दृश्य के बिना और किसी भी नए सिंथेटीकृत जांच से हस्तक्षेप के बिना ट्रैकिंग की अनुमति देता है। कोशिकाओं और पूरे जीवों दोनों में अध्ययन सफलतापूर्वक PAFPs को नियोजित किया है, जैसे कैंसर और मेटास्टेसिस के विकास, विधानसभा या साइटोस्केलेटन के disassembly, और आरएनए-डीएनए/प्रोटीन इंटरैक्शन3। इस पांडुलिपि में, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के सी एलिगेंस मॉडल में वीवो में एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन हंटिंगटिन (एचटीटी) की कारोबार दरों को उजागर करने के लिए हल्के माइक्रोस्कोपी और पीएएफपी का उपयोग किया जाता है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल फ्यूजन प्रोटीन हंटिंगटिन-Dendra2 (HTT-D2) की स्थिरता और गिरावट की मात्रा। Dendra2 एक दूसरी पीढ़ी के मोनोमेरिक PAFP4 है कि अपरिवर्तनीय या तो यूवी या दिखाई नीली रोशनी के जवाब में हरे रंग से लाल करने के लिए अपने उत्सर्जन/उत्तेजन स्पेक्ट्रा स्विच, ४,०००-गुना5, 6,6तक की तीव्रता में वृद्धि के साथ । हंटिंगटिन हंटिंगटन रोग (एचडी) के कारण, एक घातक वंशानुगत न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार के कारण जिम्मेदार प्रोटीन है। हंटिंगटिन एक्सान-1 में ग्लूटामाइंस (सीएजी, क्यू) का खिंचाव होता है। जब प्रोटीन 39Q से अधिक के साथ व्यक्त किया जाता है, यह एक उत्परिवर्ती, विषाक्त, और रोगजनक प्रोटीन में गलत गुना । उत्परिवर्ती एचटीटी एकत्रीकरण से ग्रस्त है और न्यूरोनल सेल मृत्यु और पतन की ओर जाता है, या तो छोटी अल्पाहारिक प्रजातियों के रूप में या बड़े अत्यधिक संरचित एमिलॉयड7के रूप में।
नेमाटोड उम्र बढ़ने और न्यूरोडिजेनरेशन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली है, जो इसकी हेरफेर की आसानी, आइसोजेनिक प्रकृति, छोटी उम्र और इसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता8के लिए धन्यवाद है। वीवो में एचटीटी की स्थिरता का अध्ययन करने के लिए, सी एलिगेंसके तंत्रिका तंत्र में एक संलयन निर्माण व्यक्त किया गया था। एक एचटीटी-डी 2 ट्रांसजीन जिसमें या तो 25Qs (HTTQ25-D2) का शारीरिक खिंचाव या 97Qs (HTTQ97-D2) का एक रोग खंड है, जो नेमाटोड के जीवनकाल9में पैन-न्यूरोनैली से अधिक है। लाइव सी एलिगेंस को प्रकाश के एक संक्षिप्त और केंद्रित बिंदु पर अधीन करके, एक न्यूरॉन फोटोस्विच किया जाता है और परिवर्तित एचटीटी-डी 2 को समय के साथ ट्रैक किया जाता है। एचटीटी-डी2 अवक्रमित की मात्रा स्थापित करने के लिए, हौसले से परिवर्तित एचटीटी-डी2 के रेड सिग्नल के बीच अंतर की तुलना निर्धारित अवधि के बाद एचटीटी-डी2 के शेष रेड सिग्नल से की जाती है । इसलिए, यह जांच करना संभव हो जाता है कि इसके शारीरिक रूप की तुलना में इसके विस्तारित और जहरीले रूप में पाए जाने पर हंटिंगटिन को कैसे अपमानित किया जाता है; कैसे पूर्वकाल या पीछे न्यूरॉन्स Q97 बनाम Q25 की उपस्थिति के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया, विशेष रूप से लंबे समय तक अवधि में; और कैसे उम्र बढ़ने के दौरान प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क (पीएन) के पतन क्षरण दरों में अंतर करने के लिए योगदान करते हैं । ये परिणाम केवल एचटीटी-डी2 के कारोबार पर टिप्पणियों के एक छोटे सेट का वर्णन करते हैं। हालांकि, प्रोटीन एकत्रीकरण और प्रोटेओस्टेसिस दोनों के क्षेत्र से संबंधित कई और जैविक प्रश्नों को वीवो एप्लिकेशन में इसके साथ संबोधित किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

प्रोटीन को होमोस्टेसिस बनाए रखने के लिए एक कोशिका के भीतर लगातार संश्लेषित और अपमानित किया जाता है। ब्याज की एक प्रोटीन के क्षरण की निगरानी करने में सक्षम होने के नाते न केवल अपने जीवन चक्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क में असंतुलन को उजागर करने के लिए । इस विधि से पता चलता है कि रोग पैदा करने वाले प्रोटीन हंटिंगटिन के क्षरण को कैसे ट्रैक किया जाए। Dendra2 से जुड़े हंटिंगटिन के दो संस्करण सी एलिगेंस तंत्रिका तंत्र में व्यक्त किए जाते हैं: एक शारीरिक संस्करण या ग्लूटामाइंस के विस्तारित और रोगजनक खिंचाव के साथ एक। Dendra2 एक फोटोवर्टिबल फ्लोरोसेंट प्रोटीन है; एक छोटे पराबैंगनी (यूवी) विकिरण नाड़ी पर, Dendra2 हरे रंग से लाल करने के लिए अपने उत्तेजन/उत्सर्जन स्पेक्ट्रा स्विच । नाड़ी-चेस प्रयोग के समान, परिवर्तित लाल-Dendra2 के कारोबार की निगरानी और मात्रा निर्धारित की जा सकती है, चाहे नए संश्लेषित हरे-Dendra2 से हस्तक्षेप कुछ भी हो। कॉन्फोकल-आधारित माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना और सी एलिगेंसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता के कारण, जीवित, उम्र बढ़ने वाले जीव में हंटिंगटिन-Dendra2 के क्षरण की निगरानी और मात्रा निर्धारित करना संभव है। न्यूरोनल हंटिंगटिन-Dendra2 को रूपांतरण के तुरंत बाद आंशिक रूप से अपमानित किया जाता है और समय के साथ आगे मंजूरी दे दी जाती है। गिरावट को नियंत्रित करने वाली प्रणालियों में उत्परिवर्ती हंटिंगटिन की उपस्थिति में कमी होती है और उम्र बढ़ने के साथ और बिगड़ा होता है। एक ही तंत्रिका तंत्र के भीतर न्यूरोनल उपप्रकार हंटिंगटिन-Dendra2 के लिए विभिन्न कारोबार क्षमताओं का प्रदर्शन करते हैं। कुल मिलाकर, Dendra2 के लिए जुड़े ब्याज के किसी भी प्रोटीन की निगरानी न केवल इसके क्षरण और इसमें शामिल प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क के खिलाड़ियों पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं, लेकिन यह भी अपने स्थान, तस्करी, और परिवहन पर ।

फोटोवर्टिबल प्रोटीन Dendra2 के साथ फ्रेम में हंटिंगटिन एक्सॉन-1 प्रोटीन टुकड़ा व्यक्त करने वाले दो सूत्रकृमि उपभेदों को माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त किया गया था और प्लाज्मिड को एक एक?...

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In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

यहां प्रस्तुत प्रोटीन हंटिंगटिन के क्षरण की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल है जो फोटोकंवर्टिबल फ्लोरोफोर Dendra2 को फ्यूज किया गया है।

फोटोवर्टिबल Dendra2 का उपयोग कर एजिंग सी Elegans में प्रोटीन कारोबार के वीवो क्वांटिफिकेशन में

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

यह प्रोटोकॉल लाइव और एजिंग सी एलिगेंस में रुचि के प्रोटीन के क्षरण को ट्रैक करने और परिमाणीकरण के लिए अनुमति देता है। वीवो और नॉनइनवेसिव तकनीक में डींद्र2 को उज्ज्वल और स्थिर फ्लोरोफोर में बदलने के लिए केवल थोड़ी माइक्रोस्कोपी की आवश्यकता होती है। विधि स्तनधारी प्रणालियों के साथ-साथ जेब्राफिश के अनुकूल है।अध्ययन करने के लिए, प्रोटेओस्टैटिस नेटवर्क के साथ-साथ परिवहन और तस्करी के भीतर कारोबार में डाल दिया । ब्लू लाइट लेजर के साथ स्कैनिंग करते समय Dendra2 के अवांछित रूपांतरण को भड़काने के लिए नहीं, और परीक्षण और प्रत्येक प्रणाली और संलयन प्रोटीन के लिए अधिग्रहण सेटिंग्स और रूपांतरण सेटिंग्स का अनुकूलन करने के लिए ध्यान रखना। प्रयोग के लिए वांछित उम्र के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ती उम्र से मेल वाले सूत्रकृमि से शुरू करें।इमेजिंग प्रयोग के दिन, डबल आसुत पानी में 3% एकाग्रता पर सामान्य ग्रेड एगर उठे। जबकि एगर उठे ठंडा हो रहा है, पिघले हुए एग्राम के लगभग 400 माइक्रोलीटर की आकांक्षा को सुविधाजनक बनाने के लिए एक मिलीलीटर पिपेट टिप की नोक को काट दें। ध्यान से एक साफ ग्लास स्लाइड पर agarose की कुछ बूंदें जोड़ें और तुरंत दो कांच के टुकड़ों के बीच agarose की एक पतली पैड बनाने के लिए बूंदों के शीर्ष पर एक और स्लाइड जगह है ।जब एगर उठे सूख गए हैं, तो शीर्ष स्लाइड को ध्यान से हटा दें। जब पर्याप्त स्लाइड तैयार हो गए हों, तो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर खोलें और उत्तेजन और उत्सर्जन के लिए प्रकाश पथ निर्धारित करें। हरे रंग के Dendra2 के लिए 553 नैनोमीटर के लिए 486 जोड़ें, और लाल Dendra2 के लिए 580 से 740 नैनोमीटर जोड़ें।फ्लोरोफोर की तीव्रता के अनुसार दोनों चैनलों की शक्ति और लाभ को समायोजित करें और पिनहोल को पूरी तरह से खोलने के लिए सेट करें। एक अनुक्रमिक चैनल मोड का चयन करें और हर फ्रेम स्विच करने के लिए ट्रैक सेट करें। एक के एक लाइन चरण के साथ 1024 तक फ्रेम और फ्रेम आकार के रूप में स्कैन मोड सेट करें।औसत को दो से सेट करें और औसत विधि और एकदिशात्मक रेखा के मोड से औसत करें। आठ बिट्स के लिए थोड़ा गहराई सेट करें। Dendra2 के रूपांतरण के लिए बहुआयामी अधिग्रहण सेटिंग को परिभाषित करें।कन्वर्जन और ब्लीचिंग के लिए 405 नैनोमीटर डायोड लेजर सेट टू 60% एनर्जी पावर का इस्तेमाल करें। चक्र और एक सामान्य शुरुआत और स्टॉप के बीच 0.0 मिलीसेकंड अंतराल के साथ दो चक्रों की एक समय श्रृंखला का चयन करें। दो में से एक को स्कैन करने के बाद शुरू करने के लिए ब्लीचिंग सेट करें, 30 पुनरावृत्तियों के लिए दोहराने के लिए और जब तीव्रता 50% तक गिर जाती है तो, अधिग्रहण पिक्सेल की गति को परिभाषित करने के लिए रूपांतरण के लिए तेजी से और एक तस्वीर छवि पर कब्जा करने के लिए माध्यम के लिए रहते हैं।स्लाइड पर सूत्रकृमि माउंट करने के लिए, प्रत्येक स्लाइड पर एग्राजिंग पैड के विपरीत चार वर्गों के साथ एक खिड़की को आकर्षित करने और नंबर करने के लिए एक स्थायी मार्कर का उपयोग करें। एगर उठे पैड के बीच में लेविमिसोल के 15 माइक्रोलीटर जोड़ें और बूंद में उम्र से मेल खाने वाले नेमाटोड के लिए स्थानांतरित करने के लिए एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप और एक तार लेने का उपयोग करें। प्रत्येक सूत्रकृमि को वर्ग की एक खिड़की में धीरे-धीरे स्थानांतरित करने के लिए एक बरौनी पिक का उपयोग करें।जब सभी सूत्रकृमि को फिर से तैनात किया गया है, तो तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि कीड़े ने इमेजिंग के दौरान सूत्रकृमि को स्थिर करने के लिए तरल पर कवर स्लिप रखने से पहले आगे बढ़ना बंद कर दिया है। फिर, स्लाइड को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप चरण पर रखें। ग्रीन Dendra2 रूपांतरण के लिए, पहले सूत्रकृमि का पता लगाने और सिर या पूंछ पर ध्यान केंद्रित करने के लिए हरे रंग की फ्लोरेसेंस के तहत 20 एक्स उद्देश्य के आईपीस का उपयोग करें।कॉन्फोकल मोड पर स्विच करें और संतृप्त छवि प्राप्त करने के लिए लाभ और लेजर शक्ति को बढ़ाएं या कम करें, लेकिन अधिक उजागर छवि नहीं। चयनित न्यूरॉन के आसपास ब्याज का एक क्षेत्र ड्रा और पूंछ है कि ब्याज का पहला क्षेत्र भी शामिल है चारों ओर ब्याज की एक दूसरी बड़ी क्षेत्र आकर्षित । अधिग्रहीत, प्रक्षालित और विश्लेषण करने के लिए पहला क्षेत्र सेट करें।ब्याज के दूसरे क्षेत्र को अधिग्रहीत और विश्लेषण करने के लिए सेट करें, लेकिन प्रक्षालित नहीं। स्कैनिंग की गति को अधिकतम करने के लिए सेट करें और चयनित Dendra2 न्यूरॉन्स को बदलने के लिए स्कैन शुरू करें। रूपांतरण के तुरंत बाद, लाल चैनल में Dendra2 कल्पना करने के लिए हरे रंग की 561 नैनोमीटर लेजर के साथ लाइव स्कैनिंग शुरू करें और परिवर्तित न्यूरॉन का फोकस और संबंधित अधिकतम प्रक्षेपण ढूंढें।जल्दी से एक कम पिक्सेल निवास गति के लिए स्कैन दर निर्धारित करते हैं और एक उच्च संकल्प पर दोनों चैनलों की एक स्नैपशॉट छवि प्राप्त करते हैं। इस छवि को रूपांतरण के बाद शून्य समय पर माना जाता है। फिर, स्कैन को पहचाने जाने योग्य नाम और या संख्या के साथ सहेजें, इसके बाद समय शून्य लेबल।समय के साथ Dendra2 गिरावट को ट्रैक करने के लिए, संबंधित सूत्रकृमि न्यूरॉन के समय शून्य छवि को खोलें। एक ही छवि सेटिंग का उपयोग करना, लाल चैनल में लाइव स्कैनिंग शुरू और ध्यान में परिवर्तित लाल न्यूरॉन लाने के लिए। फिर, किसी भी अधिग्रहण मापदंडों को बदले बिना, पहली छवि के समान गति से एक स्नैपशॉट प्राप्त करें।Dendra2 को कुशलतापूर्वक और पर्याप्त रूप से परिवर्तित करने और विभिन्न समय बिंदुओं पर समान अधिग्रहण मापदंडों को बनाए रखने के लिए अपनी रूपांतरण सेटिंग को सावधानीपूर्वक परिभाषित करना सुनिश्चित करें। परिवर्तित Dendra2 छवियों का विश्लेषण करने के लिए, फिजी में समय शून्य और दूसरी बार बिंदु छवियों को खोलें और विश्लेषण और सेट मापन खोलें। क्षेत्र और एकीकृत घनत्व कार्यों का चयन करें और लाल चैनल के साथ प्राप्त छवि का चयन करें।बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करना, शून्य परिवर्तित न्यूरॉन के समय के आसपास रुचि का एक क्षेत्र आकर्षित करें। न्यूरॉन की रूपरेखा को ठीक से पहचानने के लिए, तीव्रता सीमा को उजागर करने के लिए छवि, समायोजित और सीमा का चयन करें। एक बार चयन परिभाषित किया गया है, विश्लेषण और उपाय पर क्लिक करें ।एक पॉप अप परिणाम विंडो दिखाई देगी, जिसमें रुचि के चयनित क्षेत्र के लिए क्षेत्र, एकीकृत घनत्व और कच्चे एकीकृत घनत्व मूल्य शामिल हैं। दूसरी बार बिंदु से छवि के लिए चयन और माप की एक ही प्रक्रिया प्रदर्शन करते हैं। फिर, मूल्यों को स्प्रेडशीट में कॉपी करें।रूपांतरण से पहले इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, जब नमूना लाल चैनल में उत्साहित था तो कोई लाल संकेत दिखाई नहीं दे रहा था। विकिरण पर, ग्रीन सिग्नल कम हो गया क्योंकि एचटीटी-डी2 को परिवर्तित कर दिया गया था और बाद में एक लाल संकेत दिखाई दिया। HTT-D2 अभिव्यक्ति समय के साथ अपमानित, लाल HTT-D2 संकेत के स्तर में कमी और अधिक संलयन प्रोटीन के रूप में हरी HTT-D2 संकेत की एक संभावित वृद्धि के परिणामस्वरूप नए संश्लेषित किया गया ।विशेष रूप से, पूंछ क्षेत्र के न्यूरॉन्स सिर के उन लोगों की तुलना में काफी अधिक सक्रिय होने के लिए निर्धारित किया गया था। इसके अलावा, रूपांतरण के 24 घंटे बाद नियंत्रण HTTQ25-D2 का काफी अधिक क्षरण हुआ, फिर सिर और पूंछ न्यूरॉन्स दोनों में दो घंटे के बाद। यह अंतर रोगजनक HTTQ97-D2 में नहीं देखा गया था, हालांकि, सुझाव है कि प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क एचटीटी-डी 2 को हटाने में असमर्थ था जिसमें तंत्रिका तंत्र में लंबे समय तक ग्लूटामाइन फैला हुआ था।HTTQ97-D2 को बहुत पुराने सूत्रकृमि में एचटीक्यू25-डी 2 के रूप में कुशलता से अपमानित नहीं किया गया था, जो पुराने जानवरों में हंटिंगटिन की एकत्रित और संभवतः विषाक्त प्रजातियों को हटाने के लिए प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क की असमर्थता को रेखांकित करता था। महत्वपूर्ण बात, पूंछ न्यूरॉन्स युवा सूत्रकृमि में विषाक्त HTTQ97-D2 के साथ सामना करने में सक्षम थे, सुझाव है कि विभिन्न सहवर्ती प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क तंत्र काम पर हो सकता है HTT-D2 को दूर करने के लिए । प्रत्येक नमूने के अधिग्रहण और गैर-अतिउपशोर और गैर-संतृप्त छवि के लिए रूपांतरण के तुरंत बाद और उस नमूने के लिए एक ही सेटिंग का उपयोग समय भर में करें।इस प्रोटोकॉल के साथ, रोग से जुड़े प्रोटीन के प्रसार को ट्रैक करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी की मदद से, एक प्रोटेओस्टैटिस नेटवर्क में परिवर्तनों का परीक्षण करना संभव है।

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

स्थिर ट्रांसजेनिक सी. Microinjection का उपयोग एलिगेंस पीढ़ी

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

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जी प्रोटीन रिसेप्टर युग्मित spectrally हल दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग सहभागिता के vivo मात्रा में

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

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जीवित कोशिकाओं में ubiquitin-एंटीबॉडी गतिविधि की निगरानी एक Degron (DGN) अस्थिर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर (GFP) आधारित प्रोटीन का उपयोग

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

एंटीबॉडी धुंधला में<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; &quot;रुक क्रैकिंग&quot; का प्रयोग

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

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में विकास की प्रक्रिया पर नज़र रखने और बढ़ाता<em&gt; सी। एलिगेंस</em&gt; खुले स्रोत उपकरण का उपयोग

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis एलिगेंस में आयु के साथ अंतर्निहित प्रोटीन एकत्रीकरण में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए विधियाँ

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

ठहराव of Site-विशिष्ट प्रोटीन Lysine Acetylation और Succinylation Stoichiometry का उपयोग डाटा-स्वतंत्र अधिग्रहण जन स्पेक्ट्रोमेट्री

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

सी. एलिगेंस में शारीरिक तनाव प्रतिक्रियाओं के माप

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

सी एलिगेंस में भागा पेप्टाइड विषाक्तता को मापने

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...