Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
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Riconosciamo il DFG (KI-1988/5-1 a JK, borsa di dottorato NeuroCure dal Cluster di Eccellenza NeuroCure a MLP) per il finanziamento. Riconosciamo anche l'Imaging Core Facility dell'Istituto di ricerca Leibniz per la farmacologia molecolare di Berlino (FMP) per aver fornito l'imaging creato. Inoltre, vorremmo ringraziare Diogo Feleciano che ha stabilito il sistema Dendra2 in laboratorio e ha fornito istruzioni.

1. Generazione di C. elegans che esprimono proteina di fusione neuronale Huntingtina-Dendra2
<ol><li>Clonare il gene che codifica il POI in un vettore di espressione nematode (cioè, pPD95_75, Addgene #1494), con l'enzima di restrizione tradizionale digest10, Gibson assembly11,o qualsiasi metodo di scelta. Inserire un promotore per guidare l'espressione in un tessuto desiderato o in una fase di sviluppo desiderata. Inserire il fluoroforo Dendra2 N o C nel telaio ...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis.">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).</li><li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells.">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li></ol>

Per comprendere la funzione di una proteina è importante comprenderne la sintesi, la posizione e la degradazione. Con lo sviluppo di FP nuovi, stabili e luminosi, la visualizzazione e il monitoraggio dei POI sono diventati più facili ed efficienti. I PAFP di fusione geneticamente espressi come Dendra2 sono posizionati in modo univoco per studiare la stabilità di un POI. Dopo l'esposizione alla luce viola-blu, Dendra2 si rompe in una posizione precisa all'interno di una triade di aminoacidi conservati. Il fluoroforo su...

Il proteoma di un organismo vivente si rinnova costantemente. Le proteine sono continuamente degradate e sintetizzate in base alla domanda fisiologica di una cellula. Alcune proteine vengono rapidamente eliminate, mentre altre sono più vissute. Il monitoraggio delle dinamiche delle proteine è un compito più semplice, più accurato e meno invasivo quando si utilizzano proteine fluorescenti geneticamente codificate (FP). Le FP si formano automaticamente e possono essere fuse in qualsiasi proteina di interesse (POI), ma non richiedono enzimi per piegare o hanno bisogno di cofattori risparmiano perl'ossigeno 1. Una nuova generazione di SP è stata recentemente progettata per cambiare colore all'irradiazione con un impulso luminoso di lunghezza d'onda determinata. Questi FP fotoattivabili (PAFP) consentono l'etichettatura e il tracciamento dei POI, o degli organelli o delle cellule in cui risiedono, e di esaminare i loro parametri quantitativi e/o qualitativi2. Gli FP consentono di tracciare qualsiasi movimento, direzionalità, tasso di locomozione, coefficiente di diffusione, frazioni mobili o frazioni immobili, il tempo in cui risiede in un vano cellulare, nonché il suo tasso di avvicendamento. Per organelli specifici, è possibile determinare eventi di fissione e fusione. Per un particolare tipo di cella, è possibile stabilire la posizione di una cella, la velocità di divisione, il volume e la forma. Fondamentalmente, l'uso di PAFP consente il monitoraggio senza visualizzazione continua e senza interferenze da qualsiasi sonda appena sintetizzata. Studi sia nelle cellule che in organismi interi hanno impiegato con successo PAFP per affrontare questioni biologiche in vivo, come lo sviluppo di cancro e metastasi, l'assemblaggio o lo smontaggio del citoscheletro e le interazioni RNA-DNA/proteina3. In questo manoscritto, la microscopia leggera e i PAFP sono utilizzati per scoprire i tassi di rotazione della huntingtina proteica incline all'aggregazione (HTT) in vivo in un modello C. elegans della malattia neurodegenerativa.
Il protocollo qui descritto quantifica la stabilità e la degradazione della proteina di fusione huntingtina-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 è un PAFP4 monomerico di seconda generazione che cambia irreversibilmente i suoi spettri di emissione/eccitazione dal verde al rosso in risposta ai raggi UV o alla luce blu visibile, con un aumento della sua intensità fino a 4.000-fold5,6. L'huntingtina è la proteina responsabile della malattia di Huntington (HD), un disturbo neurodegenerativo ereditario fatale. Huntingtina exon-1 contiene un tratto di glutammine (CAG, Q). Quando la proteina è espressa con oltre 39Q, si trasforma male in una proteina mutante, tossica e patogena. Mutant HTT è incline all'aggregazione e porta alla morte e degenerazione delle cellule neuronali, sia come specie oligomeriche corte o come amiloidi altamente strutturati più grandi7 .
Il nematode è un sistema modello per studiare l'invecchiamento e la neurodegenerazione grazie alla sua facilità di manipolazione, natura isogenica, breve durata di vita e la sua trasparenza ottica8. Per studiare la stabilità dell'HTT in vivo, un costrutto di fusione è stato espresso nel sistema nervoso di C. elegans. Un transgene HTT-D2 contenente un tratto fisiologico di 25Q (HTTQ25-D2) o un tratto patologico di 97Q (HTTQ97-D2) è sovraespresso pan-neuronalmente per tutta la durata del nematode9. Sottoponendo C. elegans dal vivo a un breve e concentrato punto di luce, un singolo neurone viene commutato foto e l'HTT-D2 convertito viene tracciato nel tempo. Per stabilire la quantità di HTT-D2 degradata, la differenza tra il segnale rosso dell'HTT-D2 appena convertito viene confrontata con il segnale rosso rimanente di HTT-D2 dopo un determinato periodo di tempo. Pertanto, diventa possibile studiare come la huntingtina viene degradata quando si trova nella sua forma espansa e tossica rispetto alla sua forma fisiologica; come i neuroni anteriori o posteriori rispondono in modo diverso alla presenza di Q97 rispetto al Q25, specialmente in periodi di tempo prolungati; e come il collasso della rete proteostasi (PN) durante l'invecchiamento contribuisca alle differenze nei tassi di degradazione. Questi risultati descrivono solo una piccola serie di osservazioni sul fatturato di HTT-D2. Tuttavia, molte altre questioni biologiche rilevanti sia per il campo dell'aggregazione proteica che per la proteostasi possono essere affrontate con questa applicazione in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

Le proteine sono sintetizzate e degradate costantemente all'interno di una cellula per mantenere l'omeostasi. Essere in grado di monitorare la degradazione di una proteina di interesse è fondamentale per comprendere non solo il suo ciclo di vita, ma anche per scoprire gli squilibri nella rete proteostasi. Questo metodo mostra come monitorare la degradazione della proteina huntingtina che causa la malattia. Due versioni di huntingtina fusa a Dendra2 sono espresse nel sistema nervoso C. elegans: una versione fisiologica o una con un tratto espanso e patogeno di glutammine. Dendra2 è una proteina fluorescente fotoconvertibile; su un breve impulso ultravioletto di irradiazione (UV), Dendra2 commuta i suoi spettri di eccitazione/emissione dal verde al rosso. Simile a un esperimento di pulse-chase, il turnover del red-Dendra2 convertito può essere monitorato e quantificato, indipendentemente dall'interferenza da nuovo sintetizzato verde-Dendra2. Utilizzando la microscopia a base confocale e grazie alla trasparenza ottica di C. elegans,è possibile monitorare e quantificare la degradazione della huntingtina-Dendra2 in un organismo vivente e invecchiato. La huntingtina-Dendra2 neuronale è parzialmente degradata subito dopo la conversione e cancellata ulteriormente nel tempo. I sistemi che controllano la degradazione sono carenti in presenza di huntingtina mutata e sono ulteriormente compromessa dall'invecchiamento. I sottotipi neuronali all'interno dello stesso sistema nervoso presentano diverse capacità di turnover per huntingtina-Dendra2. Nel complesso, il monitoraggio di qualsiasi proteina di interesse fusa in Dendra2 può fornire informazioni importanti non solo sul suo degrado e sugli attori della rete proteostasis coinvolti, ma anche sulla sua posizione, traffico e trasporto.

Due ceppi di nematodi che esprimono il frammento di proteina huntingtina esoneso-1 nel telaio con la proteina fotoconvertibile Dendra2 sono stati ottenuti tramite microiniezione e i plasmidi sono stati mantenuti come un array extracromosomico. Il costrutto di fusione è stato espresso in tutto il sistema nervoso C. elegans dallo sviluppo durante l'invecchiamento. In questo caso, hTT-D2 conteneva il tratto fisiologico di 25 poliglutamine (HTTQ25-D2, Figura 1</...

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In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Presentato qui è un protocollo per monitorare la degradazione della proteina huntingtina fusa al fluoroforo fotoconvertibile Dendra2.

Quantificazione in vivo del fatturato proteico nell'invecchiamento C. Elegans utilizzando Dendra2 fotoconvertibile

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Questo protocollo consente il tracciamento e la quantificazione della degradazione di una proteina di interesse per i C.elegans vivi e invecchiati. Questa tecnica in vivo e non invasiva richiede solo poca microscopia impostata per convertire in modo affidabile Dendra2 in un fluoroforo luminoso e stabile. Il metodo è adattabile ai sistemi dei mammiferi, così come al pesce zebra.Studiare, inserire il fatturato all'interno della rete proteostatis, nonché i trasporti e il traffico. Fare attenzione a non provocare conversioni indesiderate di Dendra2 durante la scansione con il laser a luce blu e a testare e ottimizzare le impostazioni di acquisizione e conversione per ogni sistema e proteina di fusione. Inizia coltivando nematodi abbinati all'età a 20 gradi Celsius all'età desiderata per l'esperimento.Il giorno dell'esperimento di imaging, sciogliere l'agarosio di grado generale a una concentrazione del 3% in acqua distillata doppia. Mentre l'agarosio si sta raffreddando, tagliare la punta di una punta di pipetta millilitro per facilitare l'aspirazione di circa 400 microlitri dell'agarosio fuso. Aggiungere con cura alcune gocce di agarosio su uno scivolo di vetro pulito e posizionare immediatamente un altro scivolo sopra le gocce per creare un sottile tampone di agarosio tra i due pezzi di vetro.Quando l'agarosio si è asciugato, rimuovere con cura lo scivolo superiore. Quando sono state preparate abbastanza diapositive, aprire il software al microscopio confocale e impostare il percorso della luce per l'eccitazione e l'emissione. Per dendra2 verde aggiungere da 486 a 553 nanometri, e per dendra2 rosso aggiungere da 580 a 740 nanometri.Regolare la potenza e il guadagno di entrambi i canali in base all'intensità del fluoroforo e impostare il foro a spillo in modo che si apra completamente. Selezionare una modalità canale sequenziale e impostare la traccia per cambiare ogni fotogramma. Impostare la modalità di scansione come fotogramma e le dimensioni del fotogramma come 1024 entro 1024 con un passo di linea di uno.Impostare la media su due e sulla media in base al metodo medio e alla modalità della linea unidirezionale. Impostare la profondità del bit su otto bit. Definite l'impostazione di acquisizione multidimensionale per la conversione di Dendra2.Per la conversione e lo sbiancamento, utilizzare il laser a diodo da 405 nanometri impostato sul 60% di energia. Selezionare una serie temporale di due cicli con un intervallo di 0,0 millisecondi tra i cicli e un normale inizio e arresto. Impostare lo sbiancamento per iniziare dopo la scansione uno dei due, ripetere per 30 iterazioni e fermarsi quando l'intensità scende al 50%Quindi, definire la velocità del pixel di acquisizione in modo che si rilevi rapidamente per la conversione e su medio per acquisire un'immagine di aggancio.Per montare i nematodi sulle diapositive, utilizzare un marcatore permanente per disegnare e numerare una finestra con quattro quadrati sull'opposto del pad di agarosio su ogni diapositiva. Aggiungere 15 microlitri di levamisolo al centro del pad di agarosio e utilizzare un microscopio stereo e un piccone di filo da trasferire per nematodi abbinati all'età nella goccia. Utilizzare un piccone per spostare delicatamente ogni nematode in una finestra del quadrato.Quando tutti i nematodi sono stati riposizionati, attendere che i vermi abbiano smesso di muoversi prima di posizionare una copertura scivolare sul liquido per immobilizzare i nematodi durante l'imaging. Quindi, posizionare lo scivolo sullo stadio del microscopio confocale. Per la conversione dendra2 verde, utilizzare l'oculare dell'obiettivo 20 X sotto la fluorescenza verde per localizzare il primo nematode e concentrarsi sulla testa o sulla coda.Passare alla modalità confocale e aumentare o diminuire il guadagno e la potenza laser per ottenere un'immagine satura, ma non sovraesposta. Disegna una regione di interesse attorno al neurone selezionato e disegna una seconda regione di interesse più grande intorno alla coda che include la prima regione di interesse. Impostare la prima regione da acquisire, sbiancare e analizzare.Impostare la seconda regione di interesse da acquisire e analizzare, ma non sbiancata. Impostare la velocità di scansione al massimo e avviare la scansione per convertire i neuroni Dendra2 selezionati. Subito dopo la conversione, inizia la scansione dal vivo con il laser verde da 561 nanometri per visualizzare Dendra2 nel canale rosso e trovare la messa a fuoco e la rispettiva proiezione massima del neurone convertito.Impostare rapidamente la velocità di scansione su una velocità di rigonfiamento dei pixel inferiore e acquisire un'immagine istantanea di entrambi i canali a una risoluzione più elevata. Questa immagine viene considerata al momento zero dopo la conversione. Quindi, salvare la scansione con un nome e un numero identificabili, seguiti dall'etichetta time zero.Per tracciare la degradazione di Dendra2 nel tempo, aprire l'immagine per zero del rispettivo neurone nematode. Usando la stessa impostazione dell'immagine, inizia la scansione dal vivo nel canale rosso e porta a fuoco il neurone rosso convertito. Quindi, senza modificare alcun parametri di acquisizione, ottenere un'istantanea alla stessa velocità della prima immagine.Assicurati di definire attentamente l'impostazione di conversione per convertire Dendra2 in modo efficiente e sufficiente e per mantenere gli stessi parametri di acquisizione in diversi punti di tempo. Per analizzare le immagini Dendra2 convertite, aprite le immagini del tempo zero e del secondo punto di tempo nelle Figi e aprite Analizza e imposta misure. Selezionare le funzioni Area e Densità integrata e selezionare l'immagine ottenuta con il canale rosso.Utilizzando lo strumento di selezione poligonale, disegna una regione di interesse intorno al tempo in cui zero neurone convertito. Per identificare correttamente i contorni del neurone, selezionate Immagine, Regola e Soglia per evidenziare le soglie di intensità. Una volta definita la selezione, fare clic su Analizza e misura.Verrà visualizzata una finestra dei risultati popup, che include l'area, la densità integrata e i valori di densità integrata non elaborati per l'area di interesse selezionata. Eseguire lo stesso processo di selezione e misurazione per l'immagine dal secondo punto di tempo. Quindi, copiare i valori nel foglio di calcolo.In questa analisi rappresentativa prima della conversione, nessun segnale rosso era visibile quando il campione era eccitato nel canale rosso. Dopo l'irradiazione, il segnale verde è diminuito con la conversione dell'HTT-D2 e successivamente è apparso un segnale rosso. L'espressione di HTT-D2 si è degradata nel tempo, con conseguente riduzione dei livelli di segnale HTT-D2 rosso e un possibile aumento del segnale verde HTT-D2 man mano che una maggiore proteina di fusione è stata recentemente sintetizzata.In particolare, i neuroni della regione della coda sono stati determinati per essere significativamente più attivi rispetto a quelli della testa. Inoltre, c'è stata significativamente più degradazione del controllo HTTQ25-D2 24 ore dopo la conversione, quindi dopo due ore sia nei neuroni testa che coda. Questa differenza non è stata osservata nel HTTQ97-D2 patogeno, tuttavia, suggerendo che la rete di proteostasi non fosse in grado di rimuovere htt-D2 contenente allungamenti di glutammina più lunghi in tutto il sistema nervoso.HTTQ97-D2 non è stato degradato in modo efficiente come HTTQ25-D2 in nematodi molto vecchi, evidenziando l'incapacità della rete di proteostasi di rimuovere specie aggregate e possibilmente tossiche di Huntingtin negli animali più anziani. È importante sottolineare che i neuroni della coda sono stati in grado di far fronte a HTTQ97-D2 tossici nei giovani nematodi, suggerendo che vari meccanismi di rete di proteostasi concomitanti potrebbero essere al lavoro per rimuovere HTT-D2. Per ogni campione acquisire e non sovraesposta e non saturare l'immagine immediatamente dopo la conversione e riutilizzare la stessa impostazione per quel campione nel tempo.Con questo protocollo, è possibile testare i cambiamenti in una rete di proteostati e anche, con l'aiuto della microscopia a super risoluzione, tracciare la diffusione delle proteine associate alla malattia.

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