Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

我々は、DFG(KI-1988/5-1からJK、ニューロキュア・ド・エクセレンス・クラスター・オブ・エクセレンス・オブ・エクセレンス・オブ・MLPによるニューロキュア博士フェローシップ)の資金調達を認めています。また、ライプニッツ分子薬理研究所ベルリン(FMP)のイメージングコア施設が、イメージングを提供していることを認めます。また、Dendra2システムを設置し、指示を提供してくれたディオゴ・フェレシアーノさんに感謝申し上げたいと思います。

ニューロンハンチン-デンドラ2融合タンパク質を発現するC.エレガンスの生成
<ol><li>線虫発現ベクター(すなわち、pPD95_75、addgene #1494)でPOIをコードする遺伝子をクローン化し、従来の制限酵素消化酵素10、ギブソンアセンブリ11、または任意の任意の選択方法によって。プロモーターを挿入して、所望の組織または所望の発達段階で発現を駆動させる?...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).</li><li>Kreis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylation+of+the+actin-binding+protein+drebrin+controls+oxidation+stress-resistance+in+mammalian+neurons+and+C.+elegans.">ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ubiquitinated+huntingtin+species+in+intracellular+aggregates.">Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).</li><li>Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo.">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+and+analysis+of+age-related+changes+in+Caenorhabditis+elegans.">The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+the+nervous+system.">Specification of the nervous system.</a> WormBook. , 1-19 (2005).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration?.">What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).</li><li>Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+enhanced+photoconversion+yield+in+green+fluorescent+protein-like+protein+Dendra2.">Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2.</a> Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).</li><li>Tsvetkov, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteostasis+of+polyglutamine+varies+among+neurons+and+predicts+neurodegeneration.">Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration.</a> Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).</li><li>Feleciano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis.">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).</li><li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells.">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li></ol>

タンパク質の機能を理解するには、その合成、位置、分解を理解することが重要です。新しく、安定した、明るいFPの開発に伴い、POIの可視化と監視がより簡単かつ効率的になりました。Dendra2のような遺伝的に発現した融合PAFPは、POIの安定性を研究するためにユニークに配置されています。紫色の青色光に曝されると、Dendra2は保存されたアミノ酸のトライアド内の正確な位置で壊れます。?...

生物のプロテオームは常に自分自身を更新しています。タンパク質は、細胞の生理的要求に応じて連続的に分解され、合成されます。一部のタンパク質は迅速に排除され、他のタンパク質はより長生きします。タンパク質のダイナミクスを監視することは、遺伝的にコード化された蛍光タンパク質(FP)を使用する場合、より簡単で正確で侵襲性の低いタスクです。FPは自己触媒的に形成され、目的の任意のタンパク質(POI)に融合することができるが、酵素を必要としない、または酸素1のために補因子を保存する必要はない。最近、新世代のFPは、決定された波長の光パルスで照射時に色を切り替える設計を行いました。これらの光活性化可能なFP(PAFP)は、POI、またはそれらが存在するオルガネラまたは細胞の標識および追跡を可能にし、そしてそれらの定量的および/または質的パラメータ2を調べることを可能にする。FPは、POIの動き、方向性、移動速度、拡散係数、移動画分対不動分数、1つのセルラーコンパートメントに存在する時間、および回転率を追跡することを可能にします。特定のオルガネラの場合、移動および輸送、または核分裂および核融合事象を決定することができる。特定のセルタイプでは、セルの位置、分割率、体積、形状を設定できます。重要なことに、PAFPの使用は、連続的な視覚化なしで、新しく合成されたプローブからの干渉なしに追跡を可能にする。細胞および生物全体の研究は、がんや転移の発生、細胞骨格の組み立てまたは分解、RNA-DNA/タンパク質相互作用3などの生体内の問題に対処するためにPAFPをうまく採用している。本稿では、軽い顕微鏡法とPAFPを用いて、神経変性疾患のC.エレガンスモデルにおいて生体内の凝集しやすいタンパク質ハンチンチン(HTT)の回転率を明らかにする。
ここで説明するプロトコルは、融合タンパク質ハンチン-デンドラ2(HTT-D2)の安定性および分解を定量化する。Dendra2は、UVまたは可視青色光のいずれかに応答して発光/励起スペクトルを緑色から赤色に不可逆的に切り替える第2世代単量体PAFP4であり、その強度は最大4,000倍5、66に増加する5。ハンチンチンは、ハンチントン病(HD)、致命的な遺伝性神経変性疾患を引き起こす原因となるタンパク質です。ハンチンエキソン-1は、グルタミンのストレッチが含まれています (CAG, Q).タンパク質が39Q以上で発現すると、変異体、有毒、病原性タンパク質に誤って折り畳まれ、タンパク質が誤って発現します。変異HTTは凝集しやすく、ニューロン細胞死および変性を招き、短いオリゴマー種として、またはより大きな高度に構造化されたアミロイド7と同じである。
線虫は、その操作の容易さ、アイソジェニックな性質、短い寿命、および光学的透明性8のおかげで老化と神経変性を研究するためのモデルシステムである。生体内でHTTの安定性を研究するために、C.エレガンスの神経系に融合構造が発現した。25Qs(HTTQ25-D2)の生理学的ストレッチまたは97Qs(HTTQ97-D2)の病理学的ストレッチのいずれかを含むHTT-D2トランスジーンは、線虫の寿命9を通して汎ニューロンを過剰発現する。生きたC.エレガンスを短く焦点を合わせた光の点に当てることによって、単一のニューロンが光交換され、変換されたHTT-D2が時間の経過とともに追跡される。HTT-D2分解量を確立するために、新たに変換されたHTT-D2の赤色信号との差は、決定された期間の後のHTT-D2の残りの赤色信号と比較される。したがって、その生理学的形態と比較して、ハンチンチンが拡大し、有毒な形態で見つかった場合にどのように分解されるかを調べることができ、その結果として、より多くのハンチンチンが分解される可能性があります。Q97対Q25の存在に対して、前ニューロンまたは後部ニューロンがどのように異なって反応するか、特に長期間にわたって。老化時のプロテオスタシスネットワーク(PN)の崩壊が分解率の違いにどう寄与しているか。これらの結果は、HTT-D2の売上高に関する少数の観測値のみを記述します。しかし、タンパク質凝集とプロテオスタシスの両方の分野に関連する多くの生物学的な質問は、このin vivoアプリケーションで対処することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

タンパク質は、恒常性を維持するために細胞内で絶えず合成され、分解されます。目的のタンパク質の分解を監視できることは、そのライフサイクルを理解するだけでなく、プロテオスタシスネットワークの不均衡を明らかにする鍵です。この方法は、疾患を引き起こすタンパク質ハンチンチンの分解を追跡する方法を示す。Dendra2に融合したハンチンチンの2つのバージョンは、C.エレガンス神経系で発現される:生理学的バージョンまたはグルタミンの拡大および病原性ストレッチを有する1つ。Dendra2は光変換可能な蛍光タンパク質です。短い紫外線(UV)照射パルスの際に、Dendra2は、その励起/発光スペクトルを緑から赤に切り替えます。パルス追跡実験と同様に、変換された赤デンドラ2の回転率は、新たに合成された緑色Dendra2からの干渉に関係なく、監視および定量化することができる。共焦点顕微鏡を用いて、そしてC.エレガンスの光学的透明性のために、生きている、老化した生物のハンチンタン-Dendra2の劣化を監視し、定量することができる。ニューロンハンチンデンドラ2は、変換後すぐに部分的に分解され、時間の経過とともにさらにクリアされます。分解を制御するシステムは、変異型ハンチンチンの存在下で欠損し、加齢に伴ってさらに損なわれる。同じ神経系内のニューロンサブタイプは、ハンチンデンドラ2に対して異なるターンオーバー能力を示す。全体として、Dendra2に融合した関心のあるタンパク質を監視することは、その劣化および関与するプロテオスタシスネットワークのプレーヤーだけでなく、その位置、人身売買、輸送に関する重要な情報を提供することができます。

光変換可能なタンパク質Dendra2を有するフレーム内のハンチンチンエキソン-1タンパクフラグメントを発現する2つの線虫株がマイクロインジェクションを介して得られ、プラスミドを染色体外配列として保持した。融合構築物は、老化を通じて発達から全体のC.エレガン神経系で発現した。ここで、HTT-D2は、生理学的25ポリグルタミンストレッチ(HTTQ25-D2、<strong cl...

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In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

ここで提示される光変換可能なフルオロフォアDendra2に融合したタンパク質ハンチンチンの分解を監視するプロトコルが提示される。

光変換可能なDendra2を用いた加齢C.エレガンスにおけるタンパク質代謝の定量化

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

このプロトコルは、C.elegansの生きているおよび老化の目的のタンパク質の分解の追跡および定量化を可能にする。この生体内および非侵襲的な技術は、Dendra2を確実に明るく安定した蛍光色素に変換するために設定された顕微鏡検査をほとんど必要としない。この方法は、哺乳類のシステムだけでなく、ゼブラフィッシュに適応可能です。研究するには、プロテオスタティスネットワーク内の売上高だけでなく、輸送や人身売買を入れてください。青色光レーザーでスキャン中にDendra2の不要な変換を誘発しないように注意し、各システムと融合タンパク質の取得設定と変換設定をテストし、最適化します。実験の目的の年齢に摂氏20度で年齢に一致する線虫を成長させることから始めます。イメージング実験の日に、二重蒸留水中の3%濃度で一般グレードのアガロースを溶融した。アガロースが冷却されている間、溶かしたアガロースの約400マイクロリットルの吸引を容易にするために1ミリリットルのピペット先端の先端を切る。慎重にきれいなガラスのスライドにアガロースの数滴を追加し、すぐに2つのガラス片の間にアガロースの薄いパッドを作成するために、ドロップの上に別のスライドを置きます。アガロースが乾燥したら、上のスライドを慎重に取り外します。十分なスライドが準備されたら、共焦点顕微鏡ソフトウェアを開き、励起および放出のための光路を設定する。緑のDendra2の場合は486〜553ナノメートルを追加し、赤色のDendra2は580〜740ナノメートルを追加します。両方のチャンネルのパワーとゲインを蛍光素の強度に応じて調整し、ピンホールを完全に開くように設定します。シーケンシャル チャンネル モードを選択し、トラックを設定して、フレームごとに切り替えます。スキャン モードをフレームとして、フレーム サイズを 1024 ~ 1024 に設定し、ライン ステップ 1 を設定します。平均を 2 に設定し、平均法と単一方向線のモードで平均化します。ビット深度を 8 ビットに設定します。Dendra2 の変換に対する多次元取得設定を定義します。変換と漂白には、405ナノメートルのダイオードレーザーを60%のエネルギーパワーに設定してください。サイクル間の間隔が 0.0 ミリ秒で、通常の開始と停止の間の 2 サイクルの時系列を選択します。2 つのうち 1 つをスキャンした後に開始するように漂白を設定し、30 回の反復を繰り返し、強度が 50% に下がったときに停止するように設定し、取得ピクセルの速度を高速に変換し、メディアに収まる速度を定義してスナップ 画像をキャプチャします。線虫をスライドに取り付けるには、パーマネントマーカーを使用して、各スライドのアガロースパッドの反対側に4つの正方形を持つウィンドウを描き、番号を付けます。アガロースパッドの中央にレバミゾールの15マイクロリットルを追加し、ステレオ顕微鏡とワイヤーピックを使用して、年齢に一致した線虫を液滴に移します。まつげピックを使用して、各線虫を広場の1つの窓にそっと動かします。すべての線虫が再配置されたら、ワームが動かなくなるまで待ってから、液体の上にカバースリップを置き、イメージング中に線虫を固定します。次に、スライドを共焦点顕微鏡のステージに置きます。緑色のDendra2変換の場合、緑色蛍光の下で20 Xの目的の接眼レンズを使用して、最初の線虫を見つけ、頭または尾に焦点を当てます。共焦点モードに切り替え、ゲインとレーザーパワーを増減して飽和状態にしますが、露出過多の画像は得られません。選択したニューロンの周囲に関心のある領域を描画し、最初の関心領域を含むテールの周囲に、2 番目に大きな関心領域を描画します。取得、漂白、および分析する最初の領域を設定します。取得して分析する対象の第 2 領域を設定しますが、漂白は行いません。スキャンの速度を最大に設定し、スキャンを開始して選択したDendra2ニューロンを変換します。変換直後に緑色の561ナノメートルレーザーでライブスキャンを開始し、赤チャンネルでDendra2を可視化し、変換されたニューロンの焦点とそれぞれの最大投影を見つけます。スキャン速度を低いピクセルのデュエル速度にすばやく設定し、両方のチャンネルのスナップショット画像を高い解像度で取得します。この画像は、変換後の時点 0 と見なされます。次に、スキャンを識別可能な名前と番号で保存し、その後にタイム ゼロラベルを付けます。Dendra2の経時劣化を追跡するには、それぞれの線虫ニューロンの倍ゼロ画像を開きます。同じ画像設定を使用して、赤チャンネルでライブスキャンを開始し、変換された赤いニューロンにフォーカスを移します。次に、取得パラメータを変更することなく、最初の画像と同じ速度でスナップショットを取得します。Dendra2 を効率的かつ十分に変換し、異なる時間ポイントを通じて同じ取得パラメータを維持するために、変換設定を慎重に定義してください。変換された Dendra2 画像を分析するには、フィジーでタイム ゼロと 2 番目のタイム ポイントイメージを開き、分析と測定の設定を開きます。面積と統合密度関数を選択し、赤チャンネルで取得した画像を選択します。ポリゴン選択ツールを使用して、時間ゼロ変換されたニューロンの周りに関心のある領域を描画します。ニューロンの輪郭を適切に識別するには、[イメージ]、[調整]、[しきい値]を選択して、強度のしきい値をハイライト表示します。選択を定義したら、[分析と測定] をクリックします。選択した対象領域の領域、統合密度、および生の統合密度値を含むポップアップ結果ウィンドウが表示されます。2番目のタイムポイントから画像の選択と測定の同じプロセスを実行します。次に、値をスプレッドシートにコピーします。変換前のこの代表的な分析では、サンプルが赤チャネルで励起されたときに赤信号は見えませんでした。照射時に、HTT-D2が変換され、その後赤信号が現れるにつれて緑色の信号が減少した。HTT-D2発現は経時に分解され、より多くの融合タンパク質が新たに合成されたように、赤色HTT-D2シグナルのレベルの低下と緑色のHTT-D2シグナルの増加の可能性をもたらした。特に、尾部領域のニューロンは、頭部のニューロンと比較して有意に活性であると判断された。また、変換後24時間、頭部および尾部両方のニューロンにおいて2時間後に制御HTTQ25-D2の著しく多くの分解があった。しかし、この違いは病原性HTTQ97-D2では認められなかったが、プロテオスタシスネットワークは、神経系全体に長いグルタミンストレッチを含むHTT-D2を除去することができなかったことを示唆している。HTTQ97-D2は、非常に古い線虫のHTTQ25-D2ほど効率的に分解されず、古い動物のハンチンチンの凝集および有毒種を除去するプロテオスタシスネットワークの不備を強調した。重要なことに、尾神経細胞は若い線虫の有毒なHTTQ97-D2に対処することができ、様々な付随するプロテオスタシスネットワークメカニズムがHTT-D2を除去するために働いている可能性があることを示唆した。各サンプルの取得と非露出および非飽和画像変換直後に、そのサンプルに対して同じ設定を一定期間にわたって再利用します。このプロトコルを使用すると、プロテオスタティスネットワークの変化をテストし、また、超解像顕微鏡の助けを借りて、疾患関連タンパク質の広がいを追跡することが可能です。

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

スペクトル的に解決された二光子顕微鏡を用いたGタンパク質共役受容体相互作用の in vivo定量で

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

デグロンを使用した生細胞におけるユビキチン·プロテアソーム活性のモニタリング（DGN）·不安定化緑色蛍光タンパク質（GFP）ベースのレポータータンパク質

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

抗体染色中<em&gt; C.虫</em&gt;「フリーズクラッキング」使用

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

線虫の加齢とともに固有の蛋白質の集合の変化を研究するためのメソッド

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C.エレガンスにおけるRANペプチド毒性の測定

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...