Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
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우리는 자금 조달을 위해 DFG (KI-1988/5-1 에서 JK, MLP에 대한 우수성의 NeuroCure 클러스터에 의해 NeuroCure 박사 펠로우십)을 인정합니다. 우리는 또한 이미징 세트를 제공하기위한 분자 약리학 베를린 (FMP)에 대한 라이프 니즈 연구소의 이미징 핵심 시설을 인정합니다. 또한, 우리는 실험실에서 Dendra2 시스템을 구축하고 지침을 제공 디오고 펠레치아노 감사합니다.

1. 뉴런 헌팅틴-덴드라2 융합 단백질을 표현하는 C. 엘레간 세대
<ol><li>기존의 제한 효소다이제스트(10),깁슨 어셈블리(11) 또는 임의의 선택 방법에 의해 선충발발11벡터(즉, pPD95_75, addgene #1494)에서 POI를 코딩하는 유전자를 복제한다. 프로모터를 삽입하여 원하는 조직 또는 원하는 발달 단계에서 발현을 유도합니다. DENdra2 플루오로포어를 POI와 함께 프레임...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Mariol, M. 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A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration?.">What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).</li><li>Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+enhanced+photoconversion+yield+in+green+fluorescent+protein-like+protein+Dendra2.">Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2.</a> Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).</li><li>Tsvetkov, A. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis.">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).</li><li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells.">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li></ol>

단백질의 기능을 이해하려면 합성, 위치 및 저하를 이해하는 것이 중요합니다. 소설, 안정적이고 밝은 FP의 개발로 POI를 시각화하고 모니터링하는 것이 더 쉽고 효율적입니다. Dendra2와 같은 유전적으로 발현된 융합 PAFP는 POI의 안정성을 연구하기 위해 독특하게 배치됩니다. 보라색-청색 광에 노출되면 Dendra2는 보존된 아미노산의 삼합체 내에서 정확한 위치에서 휴식을 취합니다. 불소는 작은 구조?...

살아있는 유기체의 프로테아메는 끊임없이 자신을 갱신하고 있습니다. 단백질은 세포의 생리적 요구에 따라 지속적으로 분해되고 합성됩니다. 몇몇 단백질은 빨리 제거됩니다, 그 외는 더 오래 살아있는 반면. 단백질 역학을 모니터링하는 것은 유전자 인코딩형 형광 단백질(FPs)을 사용할 때 더 간단하고 정확하며 덜 침습적인 작업입니다. FPs는 자가촉매를 형성하고 관심있는 단백질 (POI)에 융합 될 수 있지만 산소1을위해 보조 인자를 구하거나 필요로하는 효소를 필요로하지 않습니다. 새로운 세대의 FP는 최근에 결정된 파장의 가벼운 펄스로 조사 시 색상을 전환하도록 설계되었습니다. 이러한 포토액티브ApP(PAFP)는 POI, 또는 그들이 거주하는 세포기관 또는 세포의 라벨링 및 추적을 허용하고, 그들의 정량적 및/또는 질적 파라미터2를검사한다. FP는 POI의 움직임, 방향성, 운동 속도, 확산 계수, 모바일 대 움직이지 않는 분수, 한 셀룰러 컴파트먼트에 거주하는 시간, 회전율을 추적할 수 있게 합니다. 특정 소기관, 운동 및 수송, 또는 핵분열 및 융합 이벤트를 결정할 수 있다. 특정 셀 타입의 경우 셀의 위치, 분할 속도, 부피 및 형상을 확립할 수 있습니다. 결정적으로, PAFP를 사용하면 연속 시각화 없이 새로 합성된 프로브의 간섭 없이 추적할 수 있습니다. 세포와 전체 유기체 에서 모두 연구 결과는 성공적으로 암과 전이의 발달, 세포 골격의 조립 또는 분해, 및 RNA-DNA/단백질 상호 작용3과같은 생체 내생물학적 질문을 해결하기 위하여 PAFPs를 채택했습니다. 이 원고에서, 가벼운 현미경 검사법과 PAFPs는 신경 퇴행성 질병의 C. elegans 모형에 있는 생체내에서 응집되기 쉬운 단백질 헌팅틴 (HTT)의 회전율을 밝히기 위하여 이용됩니다.
여기서 설명된 프로토콜은 융합 단백질 헌팅틴-덴드라2(HTT-D2)의 안정성과 분해를 정량화한다. Dendra2는 UV 또는 가시광선에 대한 응답으로 방출/여기 스펙트럼을 녹색에서 빨간색으로 돌이킬 수 없이 전환하는 2세대 단황 PAFP4로, 최대 4,000배5,,6의강도가 증가한다. 헌팅틴은 치명적인 유전성 신경 퇴행성 질환인 헌팅턴병(헌팅턴병)을 유발하는 단백질이다. 헌팅틴 엑슨-1에는 글루타민(CAG, Q)이 들어 있습니다. 단백질이 39Q 이상으로 표현되면 돌연변이, 독성 및 병원성 단백질로 잘못 접습니다. 돌연변이 HTT는 응집되기 쉽고 짧은 올리고머 종또는 더 큰 고도로 구조화 된 아밀로이드7로뉴런 세포 죽음과 변성으로 이어집니다.
선충은 조작의 용이성, 동종 성질, 짧은 수명 및 광학 투명성8덕분에노화와 신경 변성을 연구하기 위한 모델 시스템입니다. 생체 내에서 HTT의 안정성을 연구하기 위해, 융합 구조는 C. elegans의신경계에서 발현되었다. 25Qs(HTTQ25-D2)의 생리적 스트레치 또는 97Q(HTTQ97-D2)의 병리학적 스트레칭을 포함하는 HTT-D2 트랜스진은 선충의 일생동안팬뉴런으로 과발현된다. 라이브 C. elegans를 짧고 집중적인 빛의 지점에 복종시킴으로써 단일 뉴런이 포토전환되고 변환된 HTT-D2는 시간이 지남에 따라 추적됩니다. HTT-D2의 양을 분해하기 위해, 갓 변환된 HTT-D2의 적색 신호 의 차이는 결정된 기간 후에 HTT-D2의 나머지 적신호와 비교된다. 따라서, 헌팅틴이 생리적 형태에 비해 확장되고 독성이 있는 형태로 발견될 때 헌팅틴이 어떻게 저하되는지 조사할 수 있게 된다. 전방 또는 후방 뉴런이 Q97 대 Q25의 존재에 다르게 반응하는 방법, 특히 장기간에 걸쳐; 노화 중 프로테오스타증 네트워크(PN)의 붕괴가 저하율의 차이에 어떻게 기여하는가. 이러한 결과는 HTT-D2의 회전율에 대한 작은 관찰 집합에대해서만 설명합니다. 그러나, 단백질 응집 및 proteostasis의 필드에 관련있는 더 많은 생물학 질문은 생체 응용에서 이것으로 해결될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

단백질은 항상성을 유지하기 위해 세포 내에서 지속적으로 합성되고 저하됩니다. 관심 있는 단백질의 저하를 모니터링할 수 있다는 것은 수명 주기뿐만 아니라 프로테오스타증 네트워크의 불균형을 발견하는 데 핵심적인 역할을 합니다. 이 방법은 질병을 유발하는 단백질 헌팅틴의 분해를 추적하는 방법을 보여줍니다. 덴드라2에 융합된 헌팅틴의 두 가지 버전은 C. elegans 신경계에 표현됩니다: 생리적 버전 또는 글루타민의 확장되고 병원성 스트레칭이 있는 것. 덴드라2는 광변환형광단백질; 짧은 자외선(UV) 조사 펄스에 따라 Dendra2는 초록색에서 빨간색으로 여기/방출 스펙트럼을 전환합니다. 펄스-체이스 실험과 유사하게, 새로 합성된 그린 덴드라2의 간섭에 관계없이 변환된 적색-덴드라2의 회전율을 모니터링하고 정량화할 수 있다. 공초점 기반 현미경 검사법을 사용하고 C. elegans의광학 적 투명성으로 인해 살아있는 노화 유기체에서 헌팅틴 덴드라2의 분해를 모니터링하고 정량화 할 수 있습니다. 뉴런 헌팅틴-덴드라2는 변환 직후 부분적으로 저하되고 시간이 지남에 따라 더 지워집니다. 돌연변이 헌팅틴의 존재가 부족하고 노화가 더욱 손상됩니다. 같은 신경계 내의 신경 아류형은 헌팅틴-덴드라2에 대해 서로 다른 회전율을 나타낸다. 전반적으로 Dendra2에 융합된 관심 있는 단백질을 모니터링하면 그 성능 저하및 프로테오스타증 네트워크의 플레이어뿐만 아니라 위치, 인신 매매 및 운송에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.

광변환 단백질 Dendra2와 함께 프레임에서 헌팅틴 엑슨-1 단백질 단편을 발현하는 두 개의 선충균은 미세 주입을 통해 수득되었고 플라스미드는 엑스트라크로모솜 배열로 유지되었다. 융합 구조는 노화를 통해 개발에서 전체 C. elegans 신경계에서 표현되었다. 여기서, HTT-D2는 생리학적 25폴리글루타민 스트레치(HTTQ25-D2, 도 1A)또는 97글...

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In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

여기에 제시된 단백질 헌팅틴의 분해를 광변환형 형광소 덴드라2에 융합한 분해를 모니터링하는 프로토콜이 있다.

포토컨버터블 덴드라2를 사용하여 노화 C. 엘레간스의 단백질 회전율의 생체 내 정량화

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

이 프로토콜은 살아있는 및 노화 C.elegans에 관심있는 단백질의 분해를 추적하고 정량화 할 수 있습니다. 이 생체 내 및 비침습적 기술은 Dendra2를 밝고 안정적인 불소로 안정적으로 변환하기 위해 설정된 작은 현미경 검사법만 필요합니다. 이 방법은 포유류 시스템뿐만 아니라 제브라피시에 적응할 수 있습니다.공부하려면 프로테오스타티스 네트워크 내에서의 회전율과 운송 및 인신 매매를 하십시오. 청색광 레이저로 스캔하는 동안 Dendra2의 원치 않는 변환을 유발하지 않도록주의하고 각 시스템 및 융합 단백질에 대한 획득 설정 및 변환 설정을 테스트하고 최적화하십시오. 실험에 대한 원하는 나이에 섭씨 20도에서 나이 일치 선충을 성장하여 시작합니다.이미징 실험 당일, 이중 증류수에서 3%의 농도로 일반 등급아가로즈를 녹입니다. 아가로즈가 냉각되는 동안, 녹은 아가로즈의 약 400 마이크로 리터의 포부를 용이하게하기 위해 1 밀리리터 파이펫 팁의 끝을 잘라. 조심스럽게 깨끗한 유리 슬라이드에 아가로즈 몇 방울을 추가하고 즉시 두 유리 조각 사이에 아가로즈의 얇은 패드를 만들기 위해 방울 의 상단에 또 다른 슬라이드를 배치합니다.아가로즈가 건조되면 상단 슬라이드를 조심스럽게 제거하십시오. 충분한 슬라이드가 준비되면 공초점 현미경 소프트웨어를 열고 흥분 및 방출을위한 광 경로를 설정합니다. 녹색 Dendra2의 경우 486 ~ 553 나노미터를 추가하고 빨간색 Dendra2의 경우 580 ~ 740 나노미터를 추가합니다.플루오로포어의 강도에 따라 두 채널의 힘과 게인을 조정하고 핀홀을 완전히 열도록 설정합니다. 순차채널 모드를 선택하고 트랙을 설정하여 모든 프레임을 전환합니다. 스캔 모드를 프레임으로 설정하고 프레임 크기를 1024로 1024로 설정하여 1개의 라인 스텝을 설정합니다.평균을 2로 설정하고 단방향 선의 평균 방법과 모드로 평균을 설정합니다. 비트 깊이를 8비트로 설정합니다. Dendra2 변환을 위한 다차원 획득 설정을 정의합니다.변환 및 표백을 위해 405 나노미터 다이오드 레이저를 60%의 에너지 전력으로 설정하십시오. 사이클과 일반 시작 및 중지 사이에 0.0 밀리초 간격으로 두 사이클의 시간 시리즈를 선택합니다. 표백을 두 개 중 하나를 스캔한 후 시작하여 30회 반복을 반복하고 강도가 50%로 떨어질 때 중지하려면 스냅 이미지를 캡처하기 위해 빠르게 전환하고 중간으로 떨어지는 획득 픽셀의 속도를 정의합니다.선충을 슬라이드에 장착하려면 영구 마커를 사용하여 각 슬라이드의 아가로즈 패드 반대쪽에 4개의 사각형이 있는 창을 그립니다. 아가로즈 패드 의 중간에 레바미솔 15 마이크로 리터를 추가하고 스테레오 현미경과 와이어 선택을 사용하여 노화와 일치하는 선충을 물방울로 옮길 수 있습니다. 속눈썹 선택을 사용하여 각 선충을 사각형의 한 창으로 부드럽게 이동합니다.모든 선충이 재배치되었을 때, 웜이 이동을 멈출 때까지 기다렸다가 액체 위에 덮개 미끄러짐을 놓아 이미징 중에 선충을 고정하십시오. 그런 다음 슬라이드를 공초점 현미경 단계에 놓습니다. 녹색 Dendra2 변환의 경우 녹색 형광하에서 20 X 목표의 안장을 사용하여 첫 번째 선충을 찾고 머리 또는 꼬리에 집중하십시오.공초점 모드로 전환하고 게인 및 레이저 전력을 증가 또는 감소하여 포화 된 이미지를 얻지만 과노출되지 는 않습니다. 선택한 뉴런 주위에 관심 영역을 그리고 관심의 첫 번째 영역을 포함하는 꼬리 주위에 관심의 두 번째 큰 영역을 그립니다. 획득, 표백 및 분석할 첫 번째 영역을 설정합니다.획득 및 분석할 관심의 두 번째 영역을 설정하지만 표백하지 는 않습니다. 스캔 속도를 최대로 설정하고 스캔을 시작하여 선택한 Dendra2 뉴런을 변환합니다. 변환 직후, 녹색 561 나노미터 레이저로 라이브 스캐닝을 시작하여 빨간색 채널에서 Dendra2를 시각화하고 변환된 뉴런의 초점과 각각의 최대 투영을 찾습니다.스캔 속도를 낮은 픽셀 거주 속도로 빠르게 설정하고 더 높은 해상도로 두 채널의 스냅샷 이미지를 획득합니다. 이 이미지는 변환 후 0시에 고려됩니다. 그런 다음 식별 가능한 이름과 숫자로 스캔을 저장한 다음 시간 제로 레이블을 저장합니다.시간이 지남에 따라 Dendra2 저하를 추적하려면 각 선충 뉴런의 시간 제로 이미지를 엽니 다. 동일한 이미지 설정을 사용하여 빨간색 채널에서 라이브 스캔을 시작하고 변환된 빨간색 뉴런을 초점으로 가져옵니다. 그런 다음 획득 매개 변수를 변경하지 않고 첫 번째 이미지와 동일한 속도로 스냅샷을 가져옵니다.Dendra2를 효율적이고 충분히 변환하고 서로 다른 시간 지점에서 동일한 획득 매개 변수를 유지하기 위해 전환 설정을 신중하게 정의해야 합니다. 변환된 Dendra2 이미지를 분석하려면 피지에서 시간 0 및 두 번째 시간 점 이미지를 열고 분석 및 측정 을 엽니다. 영역 및 통합 밀도 함수를 선택하고 빨간색 채널로 얻은 이미지를 선택합니다.다각형 선택 도구를 사용하여 0 변환된 뉴런을 중심으로 관심 영역을 그립니다. 뉴런의 윤곽을 제대로 식별하려면 이미지, 조정 및 임계값을 선택하여 강도 임계값을 강조 표시합니다. 선택이 정의되면 분석 및 측정을 클릭합니다.선택한 관심 영역에 대한 영역, 통합 밀도 및 원시 통합 밀도 값을 포함하여 팝업 결과 창이 나타납니다. 두 번째 시점부터 이미지에 대해 동일한 선택 및 측정 프로세스를 수행합니다. 그런 다음 값을 스프레드시트에 복사합니다.변환 하기 전에이 대표 분석에서 샘플빨간색 채널에서 흥분 했을 때 빨간색 신호가 보이지 않았다. 조사 결과 HTT-D2가 변환되고 빨간색 신호가 이후에 나타나면서 녹색 신호가 감소했습니다. HTT-D2 발현은 시간이 지남에 따라 저하되어 적색 HTT-D2 신호 의 수준이 감소하고 더 많은 융합 단백질이 새로 합성됨에 따라 녹색 HTT-D2 신호의 증가가능성을 높였습니다.특히, 꼬리 영역의 뉴런은 머리의 뉴런과 비교하여 훨씬 더 활성화된 것으로 판단되었다. 또한, 전환 후 24시간 후, 머리와 꼬리 뉴런 모두에서 2시간 후에 제어 HTTQ25-D2의 훨씬 더 저하가 있었습니다. 그러나 병원성 HTTQ97-D2에서는 이러한 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 프로테오스타증 네트워크가 신경계 전체에 걸쳐 더 긴 글루타민을 함유한 HTT-D2를 제거할 수 없음을 시사한다.HTTQ97-D2는 아주 오래된 선충에서 HTTQ25-D2만큼 효율적으로 분해되지 않았으며, 프로테오스타증 네트워크가 오래된 동물에서 응집되고 독성이 있는 종을 제거할 수 없음을 강조했습니다. 중요 한 것은, 꼬리 뉴런은 젊은 선충에서 독성 HTTQ97-D2에 대처할 수 있었다, 다양한 수반 성 프로테오스타증 네트워크 메커니즘HTT-D2를 제거하기 위해 작동 할 수 있음을 시사. 각 샘플에 대해 변환 직후 과다 노출 및 비포화 이미지를 획득하고 시간 내내 해당 샘플에 대해 동일한 설정을 다시 사용합니다.이 프로토콜을 사용하면 프로테오스타티스 네트워크의 변화를 테스트할 수 있으며, 또한 초해상도 현미경 검사의 도움으로 관련 단백질의 확산을 추적할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

연구

생물학

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

살아있는 세포에서 Ubiquitin-proteasome 활동 모니터링 Degron (dgn) - 불안정 그린 형광 단백질 (GFP) 기반 리포터 단백질을 사용하여

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

항체 염색법에<em&gt; C. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

사이트별 단백질 Lysine Acetylation 및 Succinylation 산출할 데이터 독립적인 수집 질량 분석을 사용 하 여 정량화

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. 예쁜꼬마선충에서 RAN 펩타이드 독성 측정

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...