Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

Vi anerkjenner DFG (KI-1988/5-1 til JK, NeuroCure PhD-fellesskap av NeuroCure Cluster of Excellence til MLP) for finansiering. Vi anerkjenner også Imaging Core Facility av Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) for å gi bildebehandling satt opp. I tillegg vil vi takke Diogo Feleciano som etablerte Dendra2-systemet i laboratoriet og ga instruksjoner.

1. Generasjon av C. elegans uttrykker nevronal Huntingtin-Dendra2 fusjon protein
<ol><li>Klone genet koding POI i en nematode uttrykk vektor (dvs. pPD95_75, Addgene #1494), ved tradisjonell begrensning enzym fordøye10,Gibson montering11, eller noen metode for valg. Sett inn en promotor for å drive uttrykk i et ønsket vev eller på et ønsket utviklingsstadium. Sett Dendra2 fluorophore enten N- eller C-terminalt inn i rammen med interessepunktet.</li>
	<li>Gene...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).</li><li>Kreis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylation+of+the+actin-binding+protein+drebrin+controls+oxidation+stress-resistance+in+mammalian+neurons+and+C.+elegans.">ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ubiquitinated+huntingtin+species+in+intracellular+aggregates.">Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).</li><li>Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo.">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+and+analysis+of+age-related+changes+in+Caenorhabditis+elegans.">The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+the+nervous+system.">Specification of the nervous system.</a> WormBook. , 1-19 (2005).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration?.">What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).</li><li>Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+enhanced+photoconversion+yield+in+green+fluorescent+protein-like+protein+Dendra2.">Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2.</a> Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).</li><li>Tsvetkov, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteostasis+of+polyglutamine+varies+among+neurons+and+predicts+neurodegeneration.">Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration.</a> Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).</li><li>Feleciano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis.">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).</li><li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells.">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li></ol>

For å forstå et protein funksjon er det viktig å forstå sin syntese, plassering og nedbrytning. Med utviklingen av nye, stabile og lyse FPer har visualisering og overvåking av INTERESSEPUNKTER blitt enklere og mer effektivt. Genetisk uttrykte fusjon PAFPs som Dendra2 er unikt posisjonert for å studere stabiliteten til et INTERESSEPUNKT. Ved eksponering for lilla-blått lys, dendra2 bryter på et presist sted innenfor en triade av bevarte aminosyrer. Fluorophore gjennomgår en liten strukturell endring, noe som resu...

Proteomen til en levende organisme fornyer seg hele tiden. Proteiner er kontinuerlig degradert og syntetisert i henhold til den fysiologiske etterspørselen til en celle. Noen proteiner elimineres raskt, mens andre lenger blir levd. Overvåking av proteindynamikk er en enklere, mer nøyaktig og mindre invasiv oppgave når du bruker genetisk kodede fluorescerende proteiner (FPer). FPs danner autokatalytisk og kan smeltes til ethvert protein av interesse (POI), men krever ikke enzymer for å brette eller trenger kofaktorer spare for oksygen1. En nyere generasjon av FPs har nylig blitt utviklet for å bytte farge ved bestråling med en lys puls av bestemt bølgelengde. Disse fotoaktivatable FPs (PAFPs) tillater merking og sporing av POIer, eller organeller eller celler de bor i, og for å undersøke deres kvantitative og / eller kvalitative parametere2. FPs gjør det mulig å spore noen POI bevegelse, retningsbestemthet, frekvensen av bevegelse, koeffisient av diffusjon, mobil versus immobile fraksjoner, tiden den ligger i ett mobilrom, samt omsetningshastigheten. For spesifikke organeller kan bevegelse og transport, eller fisjon og fusjonshendelser bestemmes. For en bestemt celletype kan en celleposisjon, delingshastighet, volum og form opprettes. Avgjørende, bruk av PAFPs tillater sporing uten kontinuerlig visualisering og uten interferens fra noen nylig synthetized probe. Studier både i celler og i hele organismer har brukt PAFPs for å løse biologiske spørsmål in vivo, for eksempel utvikling av kreft og metastase, montering eller demontering av cytoskeleton, og RNA-DNA/ protein interaksjoner3. I dette manuskriptet brukes lysmikroskopi og PAFPs til å avdekke omsetningsraten til aggregasjonsutsatt protein huntingtin (HTT) in vivo i en C. elegans modell av nevrodegenerativ sykdom.
Protokollen som er beskrevet her kvantifiserer stabiliteten og nedbrytningen av fusjonsproteinet huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 er en andregenerasjons monomeric PAFP4 som irreversibelt bytter sin utslipp / eksitasjonspektrast fra grønn til rød som svar på enten UV eller synlig blått lys, med en økning i intensiteten på opptil 4000 ganger5,6. Huntingtin er proteinet som er ansvarlig for å forårsake Huntington sykdom (HS), en dødelig arvelig nevrodegenerativ lidelse. Huntingtin exon-1 inneholder en strekning av glutaminer (CAG, Q). Når proteinet uttrykkes med over 39Q, feilfolder det inn i et mutert, giftig og patogent protein. Mutant HTT er utsatt for aggregering og fører til nevronal celle død og degenerasjon, enten som korte oligomeriske arter eller som større svært strukturerte amyloider7.
Nematoden er et modellsystem for å studere aldring og nevrodegenerasjon takket være sin enkle manipulasjon, isogen natur, kort levetid og optisk gjennomsiktighet8. For å studere stabiliteten til HTT in vivo, ble en fusjonskonstruksjon uttrykt i nervesystemet til C. elegans. En HTT-D2 transgene som inneholder enten en fysiologisk strekning av 25Qs (HTTQ25-D2) eller en patologisk strekning på 97Qs (HTTQ97-D2) er overexpressed pan-neuronally gjennom nematodens levetid9. Ved å utsette live C. elegans til et kort og fokusert lyspunkt, er et enkelt nevron fotowitched og den konverterte HTT-D2 spores over tid. For å fastslå mengden HTT-D2 degradert, sammenlignes forskjellen mellom det røde signalet til den nykonverterte HTT-D2 med det gjenværende røde signalet til HTT-D2 etter en bestemt tidsperiode. Derfor blir det mulig å undersøke hvordan huntingtin brytes ned når det finnes i sin utvidede og giftige form sammenlignet med den fysiologiske formen; hvordan fremre eller bakre nevroner reagerer annerledes på tilstedeværelsen av Q97 versus Q25, spesielt over lengre tidsperioder; og hvordan sammenbruddet av proteostase nettverket (PN) under aldring bidra til forskjellene i nedbrytning priser. Disse resultatene beskriver bare et lite sett med observasjoner om omsetningen av HTT-D2. Imidlertid kan mange flere biologiske spørsmål som er relevante for både feltet proteinaggregasjon og proteostase, løses med denne in vivo-applikasjonen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

Proteiner syntetiseres og degraderes hele tiden i en celle for å opprettholde homeostase. Å kunne overvåke nedbrytningen av et protein av interesse er nøkkelen til å forstå ikke bare livssyklusen, men også å avdekke ubalanser i proteostasenettverket. Denne metoden viser hvordan du sporer nedbrytningen av det sykdomsfremkallende proteinjakttinet. To versjoner av huntingtin smeltet til Dendra2 uttrykkes i C. elegans nervesystemet: en fysiologisk versjon eller en med en utvidet og patogen strekning av glutaminer. Dendra2 er et fotokonverterbart fluorescerende protein; ved en kort ultrafiolett (UV) bestrålingspuls, bytter Dendra2 eksitasjons-/utslippsspektraen fra grønt til rødt. I likhet med et pulsjakteksperiment, kan omsetningen til den konverterte rød-Dendra2 overvåkes og kvantifiseres, uavhengig av interferens fra nylig syntetisert grønn-Dendra2. Ved hjelp av konkalsk-basert mikroskopi og på grunn av den optiske gjennomsiktigheten til C. elegans,er det mulig å overvåke og kvantifisere nedbrytningen av huntingtin-Dendra2 i en levende, aldrende organisme. Neuronal huntingtin-Dendra2 er delvis degradert kort tid etter konvertering og ryddet videre over tid. Systemene som kontrollerer nedbrytning er mangelfulle i nærvær av mutert huntingtin og er ytterligere svekket med aldring. Nevronale undertyper i samme nervesystem viser ulike omsetningskapasiteter for huntingtin-Dendra2. Samlet sett kan overvåking av protein av interesse smeltet til Dendra2 gi viktig informasjon ikke bare om nedbrytning og aktørene i proteostasenettverket som er involvert, men også på plassering, menneskehandel og transport.

To nematodestammer som uttrykker huntingtin exon-1 proteinfragment i ramme med det fotokonverterbare proteinet Dendra2 ble oppnådd via mikroinjeksjon og plasmidene ble holdt som en ekstrakromosomal matrise. Fusjonskonstruksjonen ble uttrykt i hele C. elegans nervesystemet fra utvikling gjennom aldring. Her inneholdt HTT-D2 enten den fysiologiske 25 polyglutaminstrekningen (HTTQ25-D2, figur 1A)eller en fullstendig penetrant og patoge...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Presentert her er en protokoll for å overvåke nedbrytning av protein huntingtin smeltet til fotokonverterbar fluorophore Dendra2.

I Vivo Kvantifisering av proteinomsetning i aldring C. Elegans ved hjelp av photoconvertible Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Denne protokollen åpner for sporing og kvantifisering av nedbrytning av et protein av interesse for levende og aldrende C.elegans. Denne in vivo og ikke-invasive teknikken krever bare lite mikroskopi satt opp for å pålitelig konvertere Dendra2 til en lys og stabil fluorofor. Metoden er tilpasningsdyktig til pattedyrsystemer, samt sebrafisk.For å studere, sette i omsetning i proteostatis nettverket samt transport og menneskehandel. Vær forsiktig så du ikke provoserer uønsket konvertering av Dendra2 mens du skanner med blått lys laser, og for å teste og optimalisere oppkjøpet innstillinger og konvertering innstillinger for hvert system og fusjon protein. Begynn med å vokse alderstilpassede nematoder ved 20 grader Celsius til ønsket alder for eksperimentet.På dagen for bildeforsøket oppsto smelte generell karakter ved en 3% konsentrasjon i dobbelt destillert vann. Mens agarose er kjøling, kutt spissen av en en milliliter pipettespiss for å lette aspirasjonen av ca. 400 mikroliter av smeltet agarose. Legg forsiktig til noen dråper agarose på et rent glasssklie og legg umiddelbart et annet lysbilde på toppen av dråpene for å skape en tynn pute av agarose mellom de to glassbitene.Når agarose har tørket, fjern forsiktig det øverste lysbildet. Når nok lysbilder er klargjort, åpner du den konfokale mikroskopprogramvaren og setter lysbanen for eksitasjon og utslipp. For grønne Dendra2 legge 486 til 553 nanometer, og for røde Dendra2 legge 580 til 740 nanometer.Juster kraften og forsterking av begge kanalene i henhold til intensiteten av fluoroforen og sett pinhole til helt åpen. Velg en sekvensiell kanalmodus, og angi at sporet skal bytte hver ramme. Angi skannemodus som ramme og rammestørrelse som 1024 innen 1024 med et linjetrinn på ett.Sett snittet til to og gjennomsnittlig ved gjennomsnittlig metode og modus for enveislinje. Sett bitdybden til åtte biter. Definer innstillingen for flerdimensjonal anskaffelse for konvertering av Dendra2.For konvertering og bleking, bruk 405 nanometer diode laser satt til 60% energikraft. Velg en tidsserie med to sykluser med et intervall på 0,0 millisekund mellom syklusene og en normal start og stopp. Angi bleking å starte etter skanning en av to, å gjenta for 30 iterasjoner og å stoppe når intensiteten faller til 50%Deretter definere hastigheten på oppkjøpet pixel dwell til rask for konvertering og til medium for å fange et snap image.Hvis du vil montere nematodene på lysbildene, bruker du en permanent markør til å tegne og nummerere et vindu med fire firkanter på motsatt side av agaroseputen på hvert lysbilde. Tilsett 15 mikroliter levamisol til midten av agaroseputen og bruk et stereomikroskop og en trådplukk for å overføre for alderstilpassede nematoder inn i dråpet. Bruk en øyenvippe plukke å forsiktig flytte hver nematode inn i ett vindu av torget.Når alle nematodene er flyttet, vent til ormene har sluttet å bevege seg før du plasserer et deksel slip over væsken for å immobilisere nematodene under avbildning. Plasser deretter lysbildet på det konokale mikroskopstadiet. For grønn Dendra2 konvertering, bruk okularet til 20 X-målet under grønn fluorescens for å finne den første nematoden og fokusere på hodet eller halen.Bytt til konfokal modus og øk eller reduser forsterkningen og laserkraften for å oppnå et mettet, men ikke overeksponert bilde. Tegn en region av interesse rundt den valgte nevronen og tegn en annen større interesseregion rundt halen som inkluderer den første regionen av interesse. Angi at den første regionen skal anskaffes, blekes og analyseres.Angi den andre regionen av interesse som skal anskaffes og analyseres, men ikke bleket. Angi skannehastigheten til maksimum og start skanningen for å konvertere de valgte Dendra2-nevronene. Umiddelbart etter konvertering, begynne live skanning med den grønne 561 nanometer laser for å visualisere Dendra2 i den røde kanalen og finne fokus og respektive maksimal projeksjon av konvertert neuron.Angi skannehastigheten raskt til en lavere pikselbohastighet og få et øyeblikksbilde av begge kanalene med høyere oppløsning. Dette bildet vurderes på et tidspunkt null etter konvertering. Deretter lagrer du skanningen med et identifiserbart navn og eller nummer, etterfulgt av time zero-etiketten.For å spore Dendra2 nedbrytning over tid, åpne times zero-bildet av den respektive nematodenevronen. Bruk samme bildeinnstilling, begynn å skanne live i den røde kanalen og få den konverterte røde nevronen i fokus. Deretter, uten å endre noen anskaffelsesparametere, få et øyeblikksbilde med samme hastighet som det første bildet.Sørg for å definere konverteringsinnstillingen nøye for å konvertere Dendra2 effektivt og tilstrekkelig, og for å opprettholde de samme oppkjøpsparametrene gjennom ulike tidspunkter. Hvis du vil analysere de konverterte Dendra2-bildene, åpner du bildene for null og andre gang i Fiji og åpner Analyser og angi målinger. Velg funksjonene Område og Integrert tetthet, og velg bildet som er oppnådd med den røde kanalen.Ved hjelp av Polygon Selection Tool, tegne en region av interesse rundt tiden null konvertert neuron. Hvis du vil identifisere konturene av nevronen på riktig måte, velger du Bilde, Juster og Terskel for å utheve intensitetstersklene. Når valget er definert, klikker du Analyser og mål.Et popup-resultatvindu vises, inkludert området, integrert tetthet og rå integrerte tetthetsverdier for det valgte interesseområdet. Utfør den samme prosessen med valg og måling for bildet fra andre gangspunkt. Deretter kopierer du verdiene til regnearket.I denne representative analysen før konvertering var det ikke noe rødt signal synlig når prøven var begeistret i den røde kanalen. Ved bestråling ble det grønne signalet redusert etter hvert som HTT-D2 ble konvertert og et rødt signal senere dukket opp. HTT-D2-uttrykket ble degradert over tid, noe som resulterte i en reduksjon i nivåene av rødt HTT-D2-signal og en mulig økning av det grønne HTT-D2-signalet etter hvert som mer fusjonsprotein nylig ble syntetisert.Spesielt var nevronene i haleområdet fastslått å være betydelig mer aktive sammenlignet med hodet. Videre var det betydelig mer nedbrytning av kontroll HTTQ25-D2 24 timer etter konvertering, deretter etter to timer i både hodet og halen nevroner. Denne forskjellen ble ikke observert i patogene HTTQ97-D2, noe som tyder på at proteostasenettverket ikke kunne fjerne HTT-D2 som inneholder lengre glutaminstrekninger gjennom nervesystemet.HTTQ97-D2 ble ikke degradert så effektivt som HTTQ25-D2 i svært gamle nematoder, og fremhevet proteostasenettverkets manglende evne til å fjerne aggregerte og muligens giftige arter av Huntingtin hos eldre dyr. Viktigere, hale nevroner var i stand til å takle giftige HTTQ97-D2 i unge nematoder, noe som tyder på at ulike samtidig proteostase nettverksmekanismer kan være på jobb for å fjerne HTT-D2. For hvert utvalg innhente og ikke-overeksponert og ikke-mettet bilde umiddelbart etter konvertering og gjenbruke den samme innstillingen for det utvalget gjennom tidene.Med denne protokollen er det mulig å teste endringer i et proteostatisnettverk, og også ved hjelp av superoppløsningsmikroskopi, for å spore spredningen av sykdomsrelaterte proteiner.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Overvåking av Ubiquitin-proteasome aktivitet i levende celler ved hjelp av en Degron (DGN)-destabilisert grønt fluorescerende protein (GFP)-baserte reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antistoffarging i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Ved hjelp av &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Sporing og Kvantifisering utviklingsprosesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Ved hjelp av Open-source verktøy

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Metoder for å studere endringer i iboende Protein samling med alder i Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantifisering av områdespesifikke Protein lysin Acetylation og Succinylation støkiometri ved hjelp av Data-uavhengig oppkjøpet massespektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Målinger av fysiologiske stressresponser i C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Måling av RAN Peptid toksisitet i C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...