Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

Мы признаем DFG (KI-1988/5-1 для JK, NeuroCure PhD стипендий по NeuroCure кластера передового опыта в MLP) для финансирования. Мы также признаем, Imaging Core фонда Лейбниц научно-исследовательский институт молекулярной фармакологии Берлина (FMP) для обеспечения изображения создан. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Диого Фелечиано, который создал систему Dendra2 в лаборатории и дал инструкции.

1. Поколение C. elegans, выражающих нейрональный синтез Ханттин-Дендра2
<ol><li>Клон гена кодирования POI в векторе нематодного выражения (т.е., pPD95_75, Addgene #1494), традиционным ферментом ограничения дайджест10, Гибсон сборки11, или любой метод выбора. Вставьте промоутер, ?...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).</li><li>Kreis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylation+of+the+actin-binding+protein+drebrin+controls+oxidation+stress-resistance+in+mammalian+neurons+and+C.+elegans.">ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ubiquitinated+huntingtin+species+in+intracellular+aggregates.">Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).</li><li>Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo.">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+and+analysis+of+age-related+changes+in+Caenorhabditis+elegans.">The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+the+nervous+system.">Specification of the nervous system.</a> WormBook. , 1-19 (2005).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration?.">What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).</li><li>Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+enhanced+photoconversion+yield+in+green+fluorescent+protein-like+protein+Dendra2.">Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2.</a> Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).</li><li>Tsvetkov, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteostasis+of+polyglutamine+varies+among+neurons+and+predicts+neurodegeneration.">Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration.</a> Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).</li><li>Feleciano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis.">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).</li><li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells.">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li></ol>

Чтобы понять функцию белка, важно понимать его синтез, расположение и деградацию. С развитием новых, стабильных и ярких FPs, визуализация и мониторинг POI стала проще и эффективнее. Генетически выраженный фьюжн PAFPs, такие как Dendra2, имеют уникальную возможность изучить стабильность POI. При во...

Протеом живого организма постоянно обновляется. Белки постоянно деградируют и синтезируются в соответствии с физиологическим спросом клетки. Некоторые белки быстро устраняются, в то время как другие дольше живут. Мониторинг динамики белка является более простой, более точной и менее инвазивной задачей при использовании генетически закодированных флуоресцентных белков (FPs). FPs образуют аутокаталитически и могут быть слиты с любым интересующим белком (POI), но не требуют ферментов, чтобы сложить или нужно кофакторы за исключением кислорода1. Новое поколение FPs недавно было разработано, чтобы переключить цвет при облучении с легким импульсом определенной длины волны. Эти фотоактивируемые FPs (PAFPs) позволяют маркировать и отслеживать POI, или органеллы или клетки они reside в, и рассмотреть их количественные и/или качественные параметры2. FPs позволяют отслеживать любое движение POI, направленность, скорость передвижения, коэффициент диффузии, мобильные и неподвижные фракции, время, которое он находится в одном сотовом отсеке, а также скорость его оборота. Для конкретных органелл, передвижения и транспорта, или деления и слияния события могут быть определены. Для определенного типа ячейки может быть установлено положение ячейки, скорость деления, объема и формы. Важно, что использование PAFPs позволяет отслеживать без непрерывной визуализации и без вмешательства со стороны любого недавно синтезированного зонда. Исследования как в клетках, так и в целом организмов успешно использовали PAFPs для решения биологических вопросов in vivo, таких как развитие рака и метастазов, сборка или разборка цитоскелета, и РНК-ДНК / белковых взаимодействий3. В этой рукописи, свет микроскопии и PAFPs используются для выявления оборота скорости агрегации подверженных белка hunttin (HTT) in vivo в C. elegans модели нейродегенеративных заболеваний.
Протокол, описанный здесь, количественно определяет стабильность и деградацию синтеза белка Hunttin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 является вторым поколением мономерных PAFP4, что необратимо переключает его выбросов / возбуждения спектра от зеленого до красного в ответ на уф или видимый синий свет, с увеличением его интенсивности до 4000 раз5,6. Хантингтин является белок, ответственный за причинение болезни Гентингтона (HD), смертельное наследственное нейродегенеративное расстройство. Huntingtin exon-1 содержит участок глутаминов (CAG, No). Когда белок выражается с более чем 39 ", он misfolds в мутант, токсичных и патогенных белков. Мутант HTT склонен к агрегации и приводит к смерти нейронных клеток и дегенерации, либо как короткие олигомерные виды или как большие высоко структурированные амилоиды7.
Нематод является модельной системой для изучения старения и нейродегенерации благодаря своей легкости манипуляции, изогенный характер, короткий срок службы, и его оптической прозрачности8. Для изучения стабильности HTT in vivo, конструкция синтеза была выражена в нервной системе C. elegans. HTT-D2 трансген, содержащий либо физиологический участок 25 "s (HTT-25-D2) или патологический участок 97"(HTT-97-D2) является overexpressed пан-нейронально на протяжении всей жизни нематода9. Путем подвергать в реальном маштабе времени C. elegans к краткой и сфокусированной точке света, одиночный нейрон photoswitched и преобразованный HTT-D2 отслеживается над временем. Чтобы установить, сколько HTT-D2 деградировало, разница между красным сигналом недавно преобразованного HTT-D2 сопоставлена с оставшимся красным сигналом HTT-D2 после определенного периода времени. Таким образом, становится возможным исследовать, как хантин деградирует, когда находится в его расширенной и токсичной форме по сравнению с его физиологической формой; как передние или задние нейроны по-разному реагируют на наличие No97 против 25 евро, особенно в течение длительных периодов времени; и как крах протеостазной сети (PN) во время старения способствует различиям в темпах деградации. Эти результаты описывают лишь небольшой набор наблюдений по обороту HTT-D2. Тем не менее, многие другие биологические вопросы, имеющие отношение как к области агрегации белка и протеостаза могут быть решены с этим in vivo применения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

Белки синтезируются и деградируют постоянно в клетке для поддержания гомеостаза. Возможность контролировать деградацию интересующего белка является ключом к пониманию не только его жизненного цикла, но и выявлению дисбалансов в протеостазной сети. Этот метод показывает, как отслеживать деградацию болезнетворного белка хантитина. В нервной системе C. elegans выражены две версии хантингтина, слитого с Dendra2: физиологическая версия или версия с расширенным и патогенным участком глутамина. Dendra2 является фотоконвертируемым флуоресцентным белком; при коротком ультрафиолетовом (УФ) импульсе облучения, Dendra2 переключает свои спектры возбуждения/излучения с зеленого на красный. Подобно эксперименту пульс-погони, оборот преобразованного красно-dendra2 можно контролировать и количественно, независимо от вмешательства от вновь синтезированных зеленый-Dendra2. Используя конфокальную микроскопию и благодаря оптической прозрачности C. elegans,можно отслеживать и количественно оценить деградацию хантитина-Дендры2 в живом стареющем организме. Нейронная охота-дендра2 частично деградирует вскоре после преобразования и очищается дальше с течением времени. Системы, контролирующие деградацию, испытывают дефицит в присутствии мутантов-хантитинов и еще больше нарушаются со старением. Нейронные подтипы в одной и той же нервной системе обладают различными оборотными возможностями для охоты-дендры2. В целом, мониторинг любого интересующего протеина, слитого с Dendra2, может предоставить важную информацию не только о его деградации и игроках сети протеостаза, но и о ее местонахождении, торговле людьми и транспорте.

Два штамма нематод, выражающих фрагмент белка охотничьих экзон-1 в кадре с фотоопровержимым белком Dendra2, были получены с помощью микроинъекции, а плазмиды хранились как экстрахромосомный массив. Конструкция синтеза была выражена во всей нервной системе C. elegans от р...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Представлено здесь протокол для мониторинга деградации белка hunttin сливается с фотоконвертируемой фторфор Dendra2.

В Vivo Квантификация оборота белка в старении C. Elegans с помощью фотоотвержима Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Этот протокол позволяет отслеживать и количественно проводить оценку деградации белка, представляющих интерес для живых и стареющих C.elegans. Этот виво и неинвазивный метод требует лишь небольшой микроскопии, настроенной для надежного преобразования Dendra2 в яркий и стабильный флюорофор. Метод адаптируется к системам млекопитающих, а также зебрафиш.Для изучения, положить в оборот в сети протеостатис, а также транспорта и торговли людьми. Позаботьтесь, чтобы не спровоцировать нежелательное преобразование Dendra2 во время сканирования с помощью синего светового лазера, а также проверить и оптимизировать настройки приобретения и настройки преобразования для каждой системы и белка синтеза. Начните с выращивания возрастных нематод при 20 градусах Цельсия до желаемого возраста для эксперимента.В день эксперимента по визуализации растопить агарозу общего сорта при концентрации 3% в двойной дистиллированной воде. В то время как агароза охлаждается, вырежьте кончик наконечника одноми миллилитров пипетки, чтобы облегчить стремление приблизительно 400 микролитров расплавленной агарозы. Аккуратно добавьте несколько капель агарозы на чистую стеклянную горку и сразу же поместите еще один слайд поверх капель, чтобы создать тонкую площадку агарозы между двумя стеклянными кусочками.Когда агароза высохнет, аккуратно удалите верхнюю горку. Когда будет подготовлено достаточно слайдов, откройте программное обеспечение конфокального микроскопа и установите путь света для возбуждения и выбросов. Для зеленого Dendra2 добавить от 486 до 553 нанометров, а для красного Dendra2 добавить 580 до 740 нанометров.Отрегулируйте мощность и увеличение обоих каналов в зависимости от интенсивности фторфора и установите пинхол, чтобы полностью открыть. Выберите последовательный режим канала и установите трек для переключения каждого кадра. Установите режим сканирования в качестве кадра и размер кадра как 1024 к 1024 году с шагом строки одного.Установите усреднение до двух и в среднем по среднему методу и режиму однонаправленной линии. Установите глубину бита до восьми битов. Определите многомерную настройку приобретения для преобразования Dendra2.Для преобразования и отбеливания используйте 405 нанометровый диодный лазерный набор на 60% энергии. Выберите промежуток времени из двух циклов с интервалом в 0,0 миллисекунды между циклами и нормальным началом и остановкой. Установите отбеливание, чтобы начать после сканирования один из двух, повторить в течение 30 итераций и остановить, когда интенсивность падает до 50%Затем, определить скорость приобретения пикселя жить быстро для преобразования и среды для захвата оснастки изображения.Чтобы смонтировать нематод на слайдах, используйте постоянный маркер, чтобы нарисовать и номер окна с четырьмя квадратами на противоположной стороне агарозы площадку на каждом слайде. Добавьте 15 микролитров левамизола к середине агарозной площадки и используйте стерео микроскоп и проволочный выбор для переноса для возрастных нематод в каплю. Используйте ресницы забрать аккуратно переместить каждый нематод в одно окно площади.Когда все нематоды были перемещены, подождите, пока черви перестали двигаться, прежде чем поместить крышку скольжения над жидкостью, чтобы обездвижить нематод во время изображения. Затем поместите слайд на стадию конфокального микроскопа. Для зеленого преобразования Dendra2 используйте окуляр цели 20 X под зеленой флуоресценцией, чтобы найти первый нематод и сосредоточиться на голове или хвосте.Переключитесь в конфокальный режим и увеличьте или уменьшите прирост и мощность лазера, чтобы получить насыщенное, но не переэкспонированное изображение. Нарисуйте область интереса вокруг выбранного нейрона и нарисуйте вторую большую область интереса вокруг хвоста, которая включает в себя первую область интереса. Установите первый регион, который будет приобретен, отбеленные, и проанализированы.Установите второй регион, представляющий интерес для приобретения и анализа, но не отбеленный. Установите скорость сканирования до максимума и начать сканирование для преобразования выбранных нейронов Dendra2. Сразу же после преобразования, начать живое сканирование с зеленым 561 нанометровый лазер, чтобы визуализировать Dendra2 в красном канале и найти фокус и соответствующие максимальные проекции преобразован нейрона.Быстро установите скорость сканирования на более низкую скорость обитуемого пикселя и приобретете моментальный снимок обоих каналов с более высоким разрешением. Это изображение считается нулевым по времени после преобразования. Затем сохраните сканирование с идентифицируемым именем и или номером, за которым последует метка времени ноль.Чтобы отслеживать деградацию Dendra2 с течением времени, откройте нулевое изображение соответствующего нейрона нематод. Используя ту же настройку изображения, начните сканирование в прямом эфире в красном канале и привнесите преобразованный красный нейрон в фокус. Затем, не изменяя никаких параметров приобретения, получить снимок с той же скоростью, что и первое изображение.Не забудьте тщательно определить настройки конверсии, чтобы преобразовать Dendra2 эффективно и достаточно и поддерживать те же параметры приобретения в разных точках времени. Чтобы проанализировать преобразованные изображения Dendra2, откройте изображения нулевой и второй точки времени на Фиджи и откройте измерения анализа и набора. Выберите функции Area и Integrated Density и выберите изображение, полученное с помощью красного канала.Используя инструмент выбора полигонов, нарисуйте область интереса вокруг нулевого преобразованного нейрона времени. Чтобы правильно определить контуры нейрона, выберите изображение, настроить и порог, чтобы подчеркнуть пороги интенсивности. После того, как выбор был определен, нажмите Анализ и измерения.Появится всплывающее окно результатов, включая область, интегрированную плотность и необработанные интегрированные значения плотности для выбранного региона, представляющий интерес. Выполните тот же процесс отбора и измерения изображения со второй точки времени. Затем скопировать значения в электронную таблицу.В этом репрезентативном анализе перед преобразованием не было видно красного сигнала, когда образец был возбужден в красном канале. После облучения зеленый сигнал уменьшился по мере того, как HTT-D2 был преобразован, и впоследствии появился красный сигнал. Выражение HTT-D2 деградировало с течением времени, что привело к снижению уровня красного сигнала HTT-D2 и возможному увеличению зеленого сигнала HTT-D2 по мере того, как вновь синтезировался больше белка синтеза.Примечательно, что нейроны хвостовой области были определены как значительно более активные по сравнению с нейронами головы. Кроме того, произошло значительно больше деградации контроля HTT-25-D2 через 24 часа после преобразования, затем через два часа как в головных, так и в хвостовых нейронах. Эта разница не наблюдалась в патогенных HTT-97-D2, однако, предполагая, что протеостаз сети не смог удалить HTT-D2, содержащий больше глутамина тянется по всей нервной системе.HTT-97-D2 не деградировал так же эффективно, как HTT-25-D2 в очень старых нематод, подчеркивая неспособность сети протеостаза для удаления агрегированных и, возможно, токсичных видов Хантингтина у пожилых животных. Важно отметить, что хвостовые нейроны были в состоянии справиться с токсичными HTT-97-D2 в молодых нематод, предполагая, что различные сопутствующие протеостаз сетевые механизмы могут быть на работе, чтобы удалить HTT-D2. Для каждого образца приобретают и не переэкспонированные и ненасыщенные изображения сразу после преобразования и повторно использовать тот же параметр для этого образца во времени.С помощью этого протокола можно протестировать изменения в сети протеостатис, а также, с помощью микроскопии супер-разрешения, отслеживать распространение связанных с болезнью белков.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Генерация Стабильный Трансгенные Элеганс C. Использование Микроинъекция

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

В естественных условиях Количественная оценка G белком рецептор взаимодействий с использованием спектрально Решено Двухфотонное микроскопии

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Мониторинг убиквитин-протеасомной активности в живых клетках с помощью Degron (DGN)-дестабилизировали зеленого флуоресцентного белка (GFP)-Reporter на основе белков

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Антитела Окрашивание в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование &quot;Freeze-Крекинг&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Отслеживание и Количественная процессов развития в<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Использование инструментов с открытым кодом

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Методы для изучения изменений в присущих агрегации белков с возрастом у нематоды Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Количественная оценка конкретных участков белка лизин ацетилирования и стехиометрии Succinylation с помощью приобретения данных независимые масс-спектрометрия

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Измерения физиологических стрессовых реакций у C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Измерение токсичности пептида РАН в C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...