Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
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Reconocemos la beca DFG (KI-1988/5-1 to JK, NeuroCure PhD fellowship by the NeuroCure Cluster of Excellence to MLP) para su financiación. También reconocemos la instalación básica de imágenes del Instituto de Investigación Leibniz de Farmacología Molecular de Berlín (FMP) por proporcionar la configuración de imágenes. Además, queremos dar las gracias a Diogo Feleciano que estableció el sistema Dendra2 en el laboratorio y proporcionó instrucciones.

1. Generación de C. elegans que expresan la proteína de fusión neuronal Huntingtin-Dendra2
<ol><li>Clonar el gen que codifica el PDI en un vector de expresión de nematodos (es decir, pPD95_75, Addgene #1494), por digestión de enzima de restricción tradicional10,ensamblaje Gibson11o cualquier método de elección. Inserte un promotor para impulsar la expresión en el tejido deseado o en la etapa de desarrollo deseada. Inserte el fluoróforo Dendra2 en N- o C...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Mariol, M. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ubiquitinated+huntingtin+species+in+intracellular+aggregates.">Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).</li><li>Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo.">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis.">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).</li><li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells.">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li></ol>

Para comprender la función de una proteína es importante entender su síntesis, ubicación y degradación. Con el desarrollo de FPs novedosos, estables y brillantes, la visualización y supervisión de los PDI se ha vuelto más fácil y eficiente. Los PAFP de fusión expresada genéticamente, como Dendra2, están en una posición única para estudiar la estabilidad de un PDI. Tras la exposición a la luz púrpura-azul, Dendra2 se rompe en un lugar preciso dentro de una tríada de aminoácidos conservados. El fluorófor...

El proteome de un organismo vivo se está renovando constantemente. Las proteínas se degradan y sintetizan continuamente de acuerdo con la demanda fisiológica de una célula. Algunas proteínas se eliminan rápidamente, mientras que otras son de vida más larga. La monitorización de la dinámica de proteínas es una tarea más simple, precisa y menos invasiva cuando se utilizan proteínas fluorescentes codificadas genéticamente (OP). LosFP se forman autocatalíticamente y se pueden fusionar con cualquier proteína de interés (POI), pero no requieren que las enzimas se doblen o necesiten cofactores salvo oxígeno1. Recientemente se ha diseñado una nueva generación de FPs para cambiar de color tras la irradiación con un pulso de luz de longitud de onda determinada. Estos FPs fotoactivables (PAFP) permiten el etiquetado y seguimiento de PDI, o de los orgánulos o células en los que residen, y examinar sus parámetros cuantitativos y/o cualitativos2. Los FPs permiten rastrear el movimiento de cualquier PDI, la direccionalidad, la tasa de locomoción, el coeficiente de difusión, las fracciones móviles frente a las inmóviles, el tiempo que reside en un compartimiento celular, así como su tasa de rotación. Para orgánulos específicos, se pueden determinar la locomoción y el transporte, o eventos de fisión y fusión. Para un tipo de celda determinado, se puede establecer la posición, la tasa de división, el volumen y la forma de una celda. Fundamentalmente, el uso de PAFP permite el seguimiento sin visualización continua y sin interferencia de cualquier sonda recién sintetizada. Los estudios tanto en células como en organismos enteros han empleado con éxito PAFP para abordar cuestiones biológicas in vivo, como el desarrollo de cáncer y metástasis, montaje o desmontaje del citoesqueleto, e interacciones ARN-ADN/proteína3. En este manuscrito, la microscopía de luz y los PAFP se utilizan para descubrir las tasas de rotación de la proteína huntingtina propensa a la agregación (HTT) in vivo en un modelo C. elegans de enfermedad neurodegenerativa.
El protocolo descrito aquí cuantifica la estabilidad y degradación de la proteína de fusión huntingtina-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 es un PAFP monomérico de segunda generación4 que cambia irreversiblemente sus espectros de emisión/excitación de verde a rojo en respuesta a la luz UV o azul visible, con un aumento en su intensidad de hasta 4.000 veces5,6. La huntingtina es la proteína responsable de causar la enfermedad de Huntington (EH), un trastorno neurodegenerativo hereditario fatal. Huntingtin exon-1 contiene un tramo de glutaminas (CAG, Q). Cuando la proteína se expresa con más de 39T, se desmoría en una proteína mutante, tóxica y patógena. El HTT mutante es propenso a la agregación y conduce a la muerte y degeneración de las células neuronales, ya sea como especies oligoméricas cortas o como amiloides altamente estructurados más grandes7.
El nematodo es un sistema modelo para el estudio del envejecimiento y la neurodegeneración gracias a su facilidad de manipulación, naturaleza isogénica, corta vida útil, y su transparencia óptica8. Para estudiar la estabilidad de HTT in vivo, se expresó una construcción de fusión en el sistema nervioso de C. elegans. Un transgén HTT-D2 que contiene un tramo fisiológico de 25Q (HTTQ25-D2) o un tramo patológico de 97Qs (HTTQ97-D2) está sobreexpresado pan-neuronalmente a lo largo de la vida útil del nematodo9. Al someter a C. elegans en vivo a un punto de luz breve y centrado, una sola neurona es fotointerruptora y el HTT-D2 convertido es rastreado con el tiempo. Para establecer la cantidad de HTT-D2 degradada, la diferencia entre la señal roja del HTT-D2 recién convertido se compara con la señal roja restante de HTT-D2 después de un período de tiempo determinado. Por lo tanto, es posible investigar cómo la huntingtina se degrada cuando se encuentra en su forma expandida y tóxica en comparación con su forma fisiológica; cómo las neuronas anteriores o posteriores responden de manera diferente a la presencia de Q97 frente a Q25, especialmente durante períodos de tiempo prolongados; y cómo el colapso de la red de proteostasis (PN) durante el envejecimiento contribuye a las diferencias en las tasas de degradación. Estos resultados sólo describen un pequeño conjunto de observaciones sobre el volumen de negocios de HTT-D2. Sin embargo, muchas más preguntas biológicas relevantes tanto para el campo de la agregación de proteínas como para la proteostasis pueden abordarse con esta aplicación in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

Las proteínas se sintetizan y degradan constantemente dentro de una célula para mantener la homeostasis. Ser capaz de monitorear la degradación de una proteína de interés es clave para entender no sólo su ciclo de vida, sino también para descubrir desequilibrios en la red de proteostasis. Este método muestra cómo rastrear la degradación de la huntingtina de proteína causante de la enfermedad. Dos versiones de huntingtina fusionadas con Dendra2 se expresan en el sistema nervioso C. elegans: una versión fisiológica o una con un tramo expandido y patógeno de glutaminas. Dendra2 es una proteína fluorescente fotoconvertible; tras un corto pulso de irradiación ultravioleta (UV), Dendra2 cambia sus espectros de excitación/emisión de verde a rojo. Al igual que un experimento de persecución de pulsos, el volumen de negocios del rojo-Dendra2 convertido puede ser monitoreado y cuantificado, independientemente de la interferencia de green-Dendra2 recién sintetizado. Utilizando microscopía a base de confocal y debido a la transparencia óptica de C. elegans,es posible monitorear y cuantificar la degradación de la huntingtina-Dendra2 en un organismo vivo y envejecido. La huntingtina-Dendra2 neuronal se degrada parcialmente poco después de la conversión y se elimina aún más con el tiempo. Los sistemas que controlan la degradación son deficientes en presencia de huntingtina mutada y se ven afectados aún más por el envejecimiento. Los subtipos neuronales dentro del mismo sistema nervioso exhiben diferentes capacidades de rotación para huntingtina-Dendra2. En general, el seguimiento de cualquier proteína de interés fusionada con Dendra2 puede proporcionar información importante no sólo sobre su degradación y los actores de la red de proteostasis involucrados, sino también sobre su ubicación, tráfico y transporte.

Dos cepas de nematodos que expresan el fragmento de proteína huntingtina exon-1 en marco con la proteína fotoconvertible Dendra2 se obtuvieron mediante microinyección y los plásmidos se mantuvieron como una matriz extracrosómica. La construcción de fusión se expresó en todo el sistema nervioso de C. elegans desde el desarrollo durante el envejecimiento. Aquí, HTT-D2 contenía el estiramiento fisiológico de 25 poliglutaminas (HTTQ25-D2, Figura 1</str...

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In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Aquí se presenta un protocolo para monitorear la degradación de la proteína huntingtina fusionada con el fluoróforo fotoconvertible Dendra2.

En la cuantificación vivo de la rotación de proteínas en el envejecimiento C. Elegans usando Dendra fotoconvertible2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Este protocolo permite el seguimiento y cuantificación de la degradación de una proteína de interés en C.elegans vivos y envejecidos. Esta técnica in vivo y no invasiva requiere sólo poca configuración de microscopía para convertir de forma fiable Dendra2 en un fluoróforo brillante y estable. El método es adaptable a los sistemas de mamíferos, así como al pez cebra.Estudiar, poner en volumen de negocios dentro de la red de proteostatis, así como el transporte y el tráfico. Tenga cuidado de no provocar la conversión no deseada de Dendra2 mientras escanea con el láser de luz azul, y para probar y optimizar la configuración de adquisición y la configuración de conversión para cada sistema y proteína de fusión. Comience por cultivar nematodos coincidentes con la edad a 20 grados centígrados a la edad deseada para el experimento.El día del experimento de diagnóstico por imágenes, derrite la agarosa de grado general a una concentración del 3% en agua destilada doble. Mientras la agarosa se está enfriando, corte la punta de una punta de pipeta de un mililitro para facilitar la aspiración de aproximadamente 400 microlitros de la agarosa derretida. Agregue cuidadosamente unas gotas de agarosa en un portaobjetos de vidrio limpio e inmediatamente coloque otra diapositiva en la parte superior de las gotas para crear una fina almohadilla de agarosa entre las dos piezas de vidrio.Cuando la agarosa se haya secado, retire cuidadosamente la corredera superior. Cuando se hayan preparado suficientes diapositivas, abra el software del microscopio confocal y establezca la ruta de la luz para la excitación y la emisión. Para Dendra2 verde añadir 486 a 553 nanómetros, y para rojo Dendra2 añadir 580 a 740 nanómetros.Ajuste la potencia y la ganancia de ambos canales de acuerdo con la intensidad del fluoróforo y ajuste el agujero para que se abra por completo. Seleccione un modo de canal secuencial y configure la pista para cambiar cada fotograma. Establezca el modo de escaneo como fotograma y el tamaño del fotograma como 1024 por 1024 con un paso de línea de uno.Establezca el promedio en dos y promediar por el método medio y el modo de línea unidireccional. Establezca la profundidad de bits en ocho bits. Defina la configuración de adquisición multidimensional para la conversión de Dendra2.Para la conversión y el blanqueo, utilice el láser de diodo de 405 nanómetros establecido en 60% de potencia de energía. Seleccione una serie temporal de dos ciclos con un intervalo de 0,0 milisegundos entre los ciclos y un inicio y una parada normales. Establezca el blanqueo para que comience después de escanear uno de dos, para que se repita durante 30 iteraciones y para detenerse cuando la intensidad baje a 50%Entonces, defina la velocidad del píxel de adquisición que mora para la conversión rápida y a medio para capturar una imagen de ajuste.Para montar los nematodos en las diapositivas, utilice un marcador permanente para dibujar y numerar una ventana con cuatro cuadrados en el opuesto de la almohadilla de agarosa en cada diapositiva. Agregue 15 microlitros de levamisol a la mitad de la almohadilla de agarosa y utilice un microscopio estéreo y una selección de alambre para transferirlos a nematodos coincidentes con la edad en la gota. Use un pico de pestañas para mover suavemente cada nematodo en una ventana del cuadrado.Cuando todos los nematodos hayan sido reposicionados, espere hasta que los gusanos hayan dejado de moverse antes de colocar un resbalón de cubierta sobre el líquido para inmovilizar los nematodos durante la toma de imágenes. A continuación, coloque la diapositiva en la etapa del microscopio confocal. Para la conversión verde Dendra2, utilice el ocular del objetivo 20 X bajo fluorescencia verde para localizar el primer nematodo y centrarse en la cabeza o la cola.Cambie al modo confocal y aumente o disminuya la ganancia y la potencia láser para obtener una imagen saturada, pero no sobreexpuesta. Dibuja una región de interés alrededor de la neurona seleccionada y dibuja una segunda región más grande de interés alrededor de la cola que incluya la primera región de interés. Establezca la primera región que se va a adquirir, blanquear y analizar.Establezca la segunda región de interés que se va a adquirir y analizar, pero no blanquear. Establezca la velocidad de escaneo al máximo e inicie el escaneo para convertir las neuronas Dendra2 seleccionadas. Inmediatamente después de la conversión, comience a escanear en vivo con el láser verde de 561 nanómetros para visualizar Dendra2 en el canal rojo y encontrar el enfoque y la proyección máxima respectiva de la neurona convertida.Ajuste rápidamente la velocidad de escaneo a una velocidad de permanencia de píxeles más baja y adquiera una imagen instantánea de ambos canales a una resolución más alta. Esta imagen se considera en el momento cero después de la conversión. A continuación, guarde el análisis con un nombre y un número identificables, seguido de la etiqueta de tiempo cero.Para realizar un seguimiento de la degradación de Dendra2 a lo largo del tiempo, abra la imagen de tiempo cero de la neurona nematodara respectiva. Usando la misma configuración de imagen, comience a escanear en vivo en el canal rojo y ponga la neurona roja convertida en el foco. A continuación, sin cambiar ningún parámetro de adquisición, obtenga una instantánea a la misma velocidad que la primera imagen.Asegúrese de definir su configuración de conversión cuidadosamente para convertir Dendra2 de manera eficiente y suficiente y para mantener los mismos parámetros de adquisición a lo largo de diferentes puntos de tiempo. Para analizar las imágenes Dendra2 convertidas, abra las imágenes de punto de tiempo cero y segundo en Fiji y abra Analizar y establecer mediciones. Seleccione las funciones Area y Integrated Density y seleccione la imagen obtenida con el canal rojo.Usando la Herramienta Selección de Polígonos, dibuja una región de interés alrededor del tiempo cero neurona convertida. Para identificar correctamente los contornos de la neurona, seleccione Imagen, Ajustar y Umbral para resaltar los umbrales de intensidad. Una vez definida la selección, haga clic en Analizar y medir.Aparecerá una ventana de resultados emergente, que incluye el área, la densidad integrada y los valores de densidad integrada sin procesar para la región de interés seleccionada. Realice el mismo proceso de selección y medición de la imagen desde el segundo punto de tiempo. A continuación, copie los valores en la hoja de cálculo.En este análisis representativo antes de la conversión, ninguna señal roja era visible cuando la muestra se excitaba en el canal rojo. Tras la irradiación, la señal verde disminuyó a medida que se convertía HTT-D2 y posteriormente apareció una señal roja. La expresión HTT-D2 se degradó con el tiempo, lo que resultó en una reducción en los niveles de señal HTT-D2 roja y un posible aumento de la señal HTT-D2 verde a medida que se sintetizaba recientemente más proteína de fusión.En particular, las neuronas de la región de la cola estaban determinadas a ser significativamente más activas en comparación con las de la cabeza. Además, hubo una degradación significativamente mayor del control HTTQ25-D2 24 horas después de la conversión, luego después de dos horas en las neuronas de la cabeza y la cola. Esta diferencia no se observó en HTTQ97-D2 patógeno, sin embargo, lo que sugiere que la red de proteostasis no pudo eliminar HTT-D2 que contenía tramos más largos de glutamina en todo el sistema nervioso.HTTQ97-D2 no se degradó tan eficientemente como HTTQ25-D2 en nematodos muy viejos, destacando la incapacidad de la red de proteostasis para eliminar especies agregadas y posiblemente tóxicas de Huntingtin en animales mayores. Es importante destacar que las neuronas de cola fueron capaces de hacer frente a HTTQ97-D2 tóxico en nematodos jóvenes, lo que sugiere que varios mecanismos concomitantes de la red de proteostasis podrían estar trabajando para eliminar la HTT-D2. Para cada muestra, adquiera y no sobreexpuesta y no satura la imagen inmediatamente después de la conversión y reutilice la misma configuración para esa muestra a lo largo del tiempo.Con este protocolo, es posible probar los cambios en una red de proteostatis, y también, con la ayuda de la microscopía de superresoridad, para rastrear la propagación de las proteínas asociadas a la enfermedad.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Investigación

Biología

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

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En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Control de la ubiquitina-proteasoma actividad en las células vivas utilizando un degron (dgn)-desestabilizado la proteína verde fluorescente (GFP)-basada en proteína indicadora

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Tinción de anticuerpos en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso de &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

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El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en<em&gt; C. elegans</em&gt; Uso de las herramientas de código abierto

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

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Métodos de estudio cambios de agregación inherente de proteína con la edad en Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Cuantificación de proteína específica lisina acetilación y Succinylation estequiometría usando Spectrometry total de la adquisición de datos-independiente

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Medición de la toxicidad del péptido RAN en C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...