Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

Vi bekräftar DFG (KI-1988/5-1 till JK, NeuroCure PhD stipendium av NeuroCure Cluster of Excellence till MLP) för finansiering. Vi erkänner också Imaging Core Facility vid Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) för att tillhandahålla bildbehandling inrättas. Dessutom vill vi tacka Diogo Feleciano som etablerade Dendra2-systemet i labbet och gav instruktioner.

1. Generering av C. elegans som uttrycker neuronal Huntingtin-Dendra2 fusionsprotein
<ol><li>Klona genen kodning poi i en nematod uttryck vektor (dvs. pPD95_75, Addgene #1494), genom traditionell begränsning enzym smälta10, Gibson församling11, eller någon metod för val. Sätt in en promotor för att driva uttryck i önskad vävnad eller i ett önskat utvecklingsstadium. Sätt in Dendra2 fluorofore antingen N- eller C-terminalt i ramen med poi.</li>
	<li>Gen...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).</li><li>Kreis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylation+of+the+actin-binding+protein+drebrin+controls+oxidation+stress-resistance+in+mammalian+neurons+and+C.+elegans.">ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ubiquitinated+huntingtin+species+in+intracellular+aggregates.">Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).</li><li>Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo.">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+and+analysis+of+age-related+changes+in+Caenorhabditis+elegans.">The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+the+nervous+system.">Specification of the nervous system.</a> WormBook. , 1-19 (2005).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration?.">What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).</li><li>Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+enhanced+photoconversion+yield+in+green+fluorescent+protein-like+protein+Dendra2.">Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2.</a> Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).</li><li>Tsvetkov, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteostasis+of+polyglutamine+varies+among+neurons+and+predicts+neurodegeneration.">Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration.</a> Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).</li><li>Feleciano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis.">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).</li><li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells.">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li></ol>

För att förstå ett proteins funktion är det viktigt att förstå dess syntes, plats och nedbrytning. Med utvecklingen av nya, stabila och ljusa FPs, visualisera och övervaka SEVÄRDHETER har blivit enklare och effektivare. Genetiskt uttryckt fusion PAFPs såsom Dendra2 är unikt placerade för att studera stabiliteten hos en sevärdhet. Vid exponering för lila-blått ljus, Dendra2 bryter på en exakt plats inom en triad av bevarade aminosyror. Fluorofore genomgår en liten strukturell förändring, vilket resultera...

Proteomen av en bosatt organism förnyar sig ständigt. Proteiner bryts kontinuerligt ned och syntetiseras enligt en cells fysiologiska efterfrågan. Vissa proteiner elimineras snabbt, medan andra är längre levde. Övervakning av proteindynamiken är en enklare, mer exakt och mindre invasiv uppgift när du använder genetiskt kodade fluorescerande proteiner (FPs). FPs bildar autokatalytiskt och kan smälts till något protein av intresse (POI), men kräver inte enzymer att vika eller behöver kofaktorer spara för syre1. En nyare generation av FPs har nyligen konstruerats för att byta färg vid bestrålning med en ljuspuls av bestämd våglängd. Dessa fotoaktiva FPs (PAFPs) möjliggör märkning och spårning av långlivade organiska organisationer, eller organeller eller celler som de bor i, och att undersöka deras kvantitativa och/eller kvalitativa parametrar2. FPs gör det möjligt att spåra alla SEI: s rörelse, riktning, graden av förflyttning, koefficient för diffusion, mobil kontra orörlig fraktioner, den tid den finns i ett cellulärt fack, liksom dess omsättning. För specifika organeller kan förflyttning och transport, eller fission och fusion händelser bestämmas. För en viss celltyp kan en cells position, delningshastighet, volym och form fastställas. Avgörande, användningen av PAFPs tillåter spårning utan kontinuerlig visualisering och utan störningar från någon nyligen syntetiserade sond. Studier både i celler och i hela organismer har framgångsrikt använt PAFPs för att ta itu med biologiska frågor in vivo, såsom utveckling av cancer och metastasering, montering eller demontering av cytoskelettet, och RNA-DNA/protein interaktioner3. I detta manuskript används ljusmikroskopi och PAP:er för att avslöja omsättningshastigheten för aggregeringsbenägna protein huntingtin (HTT) in vivo i en C. elegans-modell av neurodegenerativa sjukdomar.
Protokollet beskrivs här kvantifierar stabilitet och nedbrytning av fusion protein huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 är en andra generationens monomeriska PAFP4 som oåterkalleligen växlar dess utsläpp / excitation spektra från grönt till rött som svar på antingen UV eller synligt blått ljus, med en ökning av dess intensitet på upp till 4.000-faldig5,6. Huntingtin är det protein som orsakar Huntingtons sjukdom (HS), en dödlig ärftlig neurodegenerativ sjukdom. Huntingtin exon-1 innehåller en sträcka av glutaminer (CAG, Q). När proteinet uttrycks med över 39Q, det misfolds i en mutant, giftiga och patogena protein. Mutant HTT är benägen att aggregering och leder till neuronal cell död och degeneration, antingen som korta oligomeric arter eller som större mycket strukturerade amyloids7.
Nematoden är ett modellsystem för att studera åldrande och neurodegeneration tack vare sin enkla manipulation, isogen natur, kort livslängd och dess optiska transparens8. För att studera stabiliteten hos HTT in vivo uttrycktes en fusionskonstruktion i nervsystemet hos C. elegans. En HTT-D2 transgen som innehåller antingen en fysiologisk sträcka på 25Qs (HTTQ25-D2) eller en patologisk sträcka på 97Qs (HTTQ97-D2) är överuttryckt pan-neuronally under hela nematodens livstid9. Genom att utsätta live C. elegans till en kort och fokuserad ljuspunkt, är en enda neuron fotostwitched och den konverterade HTT-D2 spåras med tiden. För att fastställa mängden HTT-D2 försämrad jämförs skillnaden mellan den röda signalen från den nyligen konverterade HTT-D2 med den återstående röda signalen från HTT-D2 efter en bestämd tidsperiod. Därför blir det möjligt att undersöka hur huntingtin bryts ned när den finns i dess utökade och giftiga form jämfört med dess fysiologiska form; hur främre eller bakre nervceller reagerar annorlunda på förekomsten av Q97 jämfört med Q25, särskilt under längre tidsperioder; och hur kollapsen av proteostasnätverket (PN) under åldrandet bidrar till skillnaderna i nedbrytningshastigheter. Dessa resultat beskriver endast en liten uppsättning observationer av HTT-D2:s omsättning. Många fler biologiska frågor som är relevanta för både området proteinaggregering och proteostas kan dock behandlas med denna in vivo-applikation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

Proteiner syntetiseras och bryts ned ständigt i en cell för att upprätthålla homeostas. Att kunna övervaka nedbrytningen av ett protein av intresse är nyckeln till att förstå inte bara dess livscykel, men också att upptäcka obalanser i proteostasnätverket. Denna metod visar hur man spårar nedbrytningen av det sjukdomsframkallande protein huntingtin. Två versioner av huntingtin smält till Dendra2 uttrycks i C. elegans nervsystemet: en fysiologisk version eller en med en utökad och patogen sträcka av glutaminer. Dendra2 är ett fotokonvertibelt fluorescerande protein; på en kort ultraviolett (UV) bestrålning puls, Dendra2 växlar sin excitation / utsläpp spektra från grönt till rött. I likhet med en puls-chase experiment, omsättningen av den konverterade röd-Dendra2 kan övervakas och kvantifieras, oavsett störningar från nyligen syntetiserade grön-Dendra2. Med hjälp av konfokalbaserad mikroskopi och på grund av den optiska transparensen i C. elegansär det möjligt att övervaka och kvantifiera nedbrytningen av huntingtin-Dendra2 i en levande, åldrande organism. Neuronal huntingtin-Dendra2 är delvis försämras strax efter omvandling och rensas ytterligare över tiden. De system som styr nedbrytningen är bristfälliga i närvaro av mutant huntingtin och är ytterligare nedsatt med åldrande. Neuronala subtyper inom samma nervsystem uppvisar olika omsättning kapacitet för huntingtin-Dendra2. Övergripande, övervakning av protein av intresse smält till Dendra2 kan ge viktig information inte bara om dess nedbrytning och aktörerna i proteostas nätverk inblandade, men också om dess läge, människohandel och transport.

Två nematod stammar uttrycker huntingtin exon-1 protein fragment i ram med fotokonvertibla protein Dendra2 erhölls via microinjection och plasmids hölls som en extrachromosomal array. Fusionskonstruktionen uttrycktes i hela C. elegans nervsystemet från utveckling under hela åldrandet. Här innehöll HTT-D2 antingen den fysiologiska sträckan 25 polyglutamin (HTTQ25-D2, figur 1A) eller en helt penetrerande och patogen upprepning ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Presenteras här är ett protokoll för att övervaka nedbrytningen av protein huntingtin smält till fotokonverterbara fluorofore Dendra2.

In Vivo Kvantifiering av proteinomsättning i åldrande C. Elegans med photoconvertible Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Detta protokoll möjliggör spårning och kvantifiering av nedbrytningen av ett protein av intresse för levande och åldrande C.elegans. Denna in vivo och noninvasive teknik kräver endast lite mikroskopi inrättas för att tillförlitligt omvandla Dendra2 till en ljus och stabil fluorophore. Metoden är anpassningsbar till däggdjurssystem, samt zebrafisk.Att studera, sätta i omsättning inom proteostatisnätverket samt transport och trafficking. Var noga med att inte provocera oönskad konvertering av Dendra2 medan du skannar med den blå ljuslasern, och för att testa och optimera förvärvsinställningarna och konverteringsinställningarna för varje system och fusionsprotein. Börja med att växa åldersmatchade nematoder vid 20 grader Celsius till önskad ålder för experimentet.På dagen för bildframställning experiment, smälta allmän kvalitet uppstod vid en 3%koncentration i dubbel destillerat vatten. Medan agaros kyler, skär spetsen på en en milliliter pipett spets för att underlätta aspiration av cirka 400 mikroliter av den smälta agaros. Tillsätt försiktigt några droppar agaros på en ren glasrutschkana och placera omedelbart en annan bild ovanpå dropparna för att skapa en tunn dyna av agaros mellan de två glasbitarna.När agaros har torkat, försiktigt bort den övre bilden. När tillräckligt med diabilder har förberetts, öppna konfokalmikroskop programvara och ställa in ljusvägen för excitation och utsläpp. För grön Dendra2 tillsätt 486 till 553 nanometer, och för röda Dendra2 lägga 580 till 740 nanometer.Justera kraften och förstärkningen av båda kanalerna efter fluoroforeens intensitet och ställ in tapphålet så att det öppnas helt. Välj ett sekventiellt kanalläge och ställ in spåret så att varje bildruta växlar. Ange skanningsläget som ram och ramstorleken som 1024 med 1024 med ett linjesteg på ett.Ställ in medelvärdet till två och till genomsnitt med medelvärdet metod och läge för enkelriktad linje. Ställ in bitdjupet på åtta bitar. Definiera inställningen för flerdimensionellt förvärv för konverteringen av Dendra2.För konvertering och blekning, använd 405 nanometerdiodlaser inställd på 60%energieffekt. Välj en tidsserie med två cykler med ett 0,0 millisekundersintervall mellan cyklerna och en normal start och stopp. Ställ in blekningen till att starta efter scan en av två, att upprepa för 30 iterationer och att stoppa när intensiteten sjunker till 50%Sedan definiera hastigheten på förvärvet pixel bo för att snabbt för konvertering och till medium för att fånga en snap bild.För att montera nematoder på bilderna, använd en permanent markör för att rita och nummer ett fönster med fyra rutor på motsatsen till agarospaden på varje bild. Tillsätt 15 mikroliter levamisole till mitten av agarospaden och använd ett stereomikroskop och en trådplockning för att överföra för åldersmatchade nematoder i droppen. Använd en ögonfransplockning för att försiktigt flytta varje nematod in i ett fönster på torget.När alla nematoder har flyttats, vänta tills maskarna har slutat röra sig innan du placerar ett lock glida över vätskan för att immobilisera nematoder under bildbehandling. Placera sedan bilden på konfokalmikroskopet scenen. För grön Dendra2 konvertering, använd okularet av 20 X objektivet under grön fluorescens för att lokalisera den första nematoden och fokusera på huvudet eller svansen.Växla till konfokalläge och öka eller minska förstärkningen och lasereffekten för att få en mättad, men inte överexponerad bild. Rita en region av intresse runt den valda neuron och dra en andra större region av intresse runt svansen som inkluderar den första regionen av intresse. Ställ in den första regionen som ska förvärvas, blekas och analyseras.Ställ in den andra intresseregionen som ska förvärvas och analyseras, men inte blekas. Ställ in hastigheten för skanning till maximal och starta skanningen för att konvertera de valda Dendra2 nervceller. Omedelbart efter konvertering, börja levande skanning med den gröna 561 nanometerlaser för att visualisera Dendra2 i den röda kanalen och hitta fokus och respektive maximal projektion av den konverterade neuron.Snabbt ställa in skanningshastigheten till en lägre pixel bo hastighet och skaffa en ögonblicksbild bild av båda kanalerna med en högre upplösning. Denna bild anses vid tid noll efter konvertering. Spara sedan skanningen med ett identifierbart namn och eller nummer, följt av etiketten tid noll.För att spåra Dendra2 nedbrytning över tiden, öppna gånger noll bild av respektive nematod neuron. Använda samma bildinställning, börja skanna live i den röda kanalen och föra den konverterade röda neuron i fokus. Sedan, utan att ändra några förvärvsparametrar, få en ögonblicksbild med samma hastighet som den första bilden.Se till att definiera din konverteringsinställning noggrant för att konvertera Dendra2 effektivt och tillräckligt och för att upprätthålla samma förvärvsparametrar under olika tidpunkter. Om du vill analysera de konverterade Dendra2-bilderna öppnar du bilderna för tid noll och andra tidspunkt i Fiji och öppnar Analysera och Ange mått. Välj funktionerna Område och Integrerad densitet och välj den bild som erhålls med den röda kanalen.Använda Polygon Selection Tool, rita en region av intresse runt tiden noll konverterade neuron. Om du vill identifiera konturerna av neuronen på rätt sätt väljer du Bild, Justera och Tröskelvärde för att markera intensitetströsklarna. När markeringen har definierats klickar du på Analysera och mät.Ett pop up-resultatfönster kommer att visas, inklusive området, integrerad densitet och rå integrerad densitet värden för den valda regionen av intresse. Utför samma process för val och mätning för bilden från den andra tidspunkten. Kopiera sedan in värdena i kalkylbladet.I denna representativa analys före konverteringen var ingen röd signal synlig när provet var upprymd i den röda kanalen. Vid bestrålning, den gröna signalen minskat som HTT-D2 konverterades och en röd signal därefter dök upp. HTT-D2 uttryck försämras med tiden, vilket resulterar i en minskning av nivåerna av röda HTT-D2 signal och en möjlig ökning av den gröna HTT-D2 signalen som mer fusion protein var nyligen syntetiserade.Noterbart är att nervcellerna i svansregionen var fast beslutna att vara betydligt mer aktiva jämfört med huvudet. Vidare fanns det betydligt mer nedbrytning av kontroll HTTQ25-D2 24 timmar efter konvertering, sedan efter två timmar i både huvud och svans nervceller. Denna skillnad observerades inte i patogena HTTQ97-D2, dock, vilket tyder på att proteostasis nätverket inte kunde ta bort HTT-D2 som innehåller längre glutamin sträcker sig över hela nervsystemet.HTTQ97-D2 var inte försämras så effektivt som HTTQ25-D2 i mycket gamla nematoder, belyser oförmåga proteostas nätverk för att ta bort aggregerade och eventuellt giftiga arter av Huntingtin i äldre djur. Viktigt, svans nervceller kunde klara av giftiga HTTQ97-D2 i unga nematoder, vilket tyder på att olika samtidiga proteostas nätverksmekanismer kan vara på jobbet för att ta bort HTT-D2. För varje prov förvärva och icke-överexponerad och icke-mättad bild omedelbart efter konvertering och återanvända samma inställning för det provet under hela tiden.Med detta protokoll är det möjligt att testa förändringar i ett proteostatisnätverk, och även, med hjälp av superupplösningsmikroskopi, för att spåra spridningen av sjukdomstillhörande proteiner.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Generering av Stabil Transgena C. elegans Använda mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Kvantifiering av G Tillsammans Interaktioner protein receptor med spektralt korrigerats inom två-photon Mikroskopi

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Övervakning av ubiquitin-proteasom aktivitet i levande celler Använda en Degron (DGN)-destabiliseras grönt fluorescerande protein (GFP)-baserad Reporter protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antikropp färgning i<em&gt; C. Elegans</em&gt; Använda &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Spårning och kvantifiera utvecklingsprocesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Använda Open-source-verktyg

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Metoder för att studera förändringar i inneboende Protein aggregering med åldern i Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Kvantifiering av platsspecifika Protein lysin acetylering och Succinylation stökiometri använder Data-oberoende förvärv masspektrometri

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Mätningar av fysiologiska stressreaktioner i C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Mätning ran peptid toxicitet i C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...