Name: in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

Biz DFG (KI-1988/5-1 JK, NeuroCure Doktora Bursu MLP mükemmellik NeuroCure Küme tarafından) finansman için kabul ediyoruz. Ayrıca Leibniz Moleküler Farmakoloji Enstitüsü Berlin Görüntüleme Çekirdek Tesisi (FMP) görüntüleme kurmak sağlamak için kabul ediyoruz. Buna ek olarak, laboratuvarda Dendra2 sistemini kuran ve talimatlar veren Diogo Feleciano'ya teşekkür ederiz.

1. Nöronal Huntingtin-Dendra2 füzyon proteinini ifade eden C. eleganların nesli
<ol><li>Bir nematod ekspresyonu vektör (yani, pPD95_75, Addgene #1494), geleneksel restriksiyon enzim sindirimi10, Gibson montaj11, ya da seçim herhangi bir yöntem tarafından POI kodlama gen klon. İstenilen dokuda veya istenilen gelişim aşamasında ifade yi yönlendirmek için bir organizatör yerleştirin. Dendra2 florofor'u N- veya C-terminalolarak İçN ile çerçeveye ye...

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Green+Fluorescent+Protein.">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments.">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li><li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins.">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li><li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease.">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases.">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li><li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RasGRP,+C.+elegans+RGEF-1b,+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+(Ras)+in+Sensory+Neurons.">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li><li>. Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: <a target="_blank" href="https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition">https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition</a> (2020)</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li><li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).</li><li>Kreis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylation+of+the+actin-binding+protein+drebrin+controls+oxidation+stress-resistance+in+mammalian+neurons+and+C.+elegans.">ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li><li>Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ubiquitinated+huntingtin+species+in+intracellular+aggregates.">Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).</li><li>Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo.">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+Synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li><li>Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+and+analysis+of+age-related+changes+in+Caenorhabditis+elegans.">The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+the+nervous+system.">Specification of the nervous system.</a> WormBook. , 1-19 (2005).</li><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration?.">What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).</li><li>Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+enhanced+photoconversion+yield+in+green+fluorescent+protein-like+protein+Dendra2.">Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2.</a> Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).</li><li>Tsvetkov, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteostasis+of+polyglutamine+varies+among+neurons+and+predicts+neurodegeneration.">Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration.</a> Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).</li><li>Feleciano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease.">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level.">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li><li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis.">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).</li><li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells.">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li></ol>

Bir proteinin işlevini anlamak için sentezini, yerini ve bozulmasını anlamak önemlidir. Yeni, kararlı ve parlak LP'lerin geliştirilmesiyle, İçN'lerin görselleştirilmesi ve izlenmesi daha kolay ve verimli hale gelmiştir. Dendra2 gibi genetik olarak ifade edilen füzyon PAFP'leri bir İçN'nin stabilitesini incelemek için benzersiz bir konuma sahiptir. Mor-mavi ışığa maruz kaldıktan sonra, Dendra2 korunmuş amino asitlerin bir üçlü içinde kesin bir yerde tatili. Florofor küçük bir yapısal değişi...

Yaşayan bir organizmanın proteomu sürekli kendini yeniliyor. Proteinler bir hücrenin fizyolojik talebine göre sürekli olarak bozulur ve sentezlenir. Bazı proteinler hızla ortadan kaldırılırken, diğerleri daha uzun ömürlüdür. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinler (LP)'ler kullanılırken protein dinamiklerinin izlenmesi daha basit, daha doğru ve daha az invaziv bir görevdir. FP'ler otokatalitik olarak oluşur ve herhangi bir ilgi proteinine (POI) kaynaşabilir, ancak enzimlerin katlanabilir veya oksijen1için tasarruf kofaktöre ihtiyaç duymasını gerektirmez. Yeni nesil LP'ler, belirlenen dalga boyundaki bir ışık darbesi ile ışınlama üzerine renk değiştirmek üzere tasarlandı. Bu fotoaktibl FP'ler (PAPC'ler) İçN'lerin veya içinde oturdukları organellerin veya hücrelerin etiketlemesine ve izlenmesine ve nicel ve/veya nitel parametrelerini incelemelerine olanak sağlar2. FP'ler, herhangi bir POI'nin hareketini, yönünü, hareket oranını, difüzyon katsayısını, mobil ve hareketsiz fraksiyonları, tek bir hücresel bölmede bulunduğu zamanı ve ciro oranını izlemeyi mümkün kılar. Belirli organeller için, hareket ve taşıma, ya da fizyon ve füzyon olayları belirlenebilir. Belirli bir hücre türü için, bir hücrenin konumu, bölme hızı, hacim ve şekil belirlenebilir. En önemlisi, PAAP'lerin kullanımı sürekli görselleştirme olmadan ve yeni sentezlenmiş herhangi bir sondanın müdahalesi olmadan izleme sağlar. Hem hücrelerde hem de bütün organizmalarda yapılan çalışmalar, kanser ve metastaz, sitoiskeletin montajı veya ayrışması ve RNA-DNA/protein etkileşimleri gibi biyolojik soruları vivo olarak ele almak için PADP'leri başarıyla istihdam etti3. Bu yazıda, ışık mikroskobu ve PAPC'ler nörodejeneratif hastalığın C. elegans modelinde in vivo in agregasyona eğilimli protein huntingtinin (HTT) ciro oranlarını ortaya çıkarmak için kullanılır.
Burada açıklanan protokol, huntingtin-Dendra2 (HTT-D2) füzyon proteininin stabilitesini ve bozulmasını ölçer. Dendra2 ikinci nesil monomerik PAFP4 geri dönülmez ya UV veya görünür mavi ışık yanıt olarak yeşil den kırmızı emisyon / uyarma spektrumları anahtarları, kadar yoğunluğunda bir artış ile 4,000 kat5,6. Huntingtin Huntington hastalığı (HD), ölümcül bir kalıtsal nörodejeneratif bozukluk neden sorumlu proteindir. Huntingtin exon-1 glutaminler (CAG, Q) bir streç içerir. Protein 39Q üzerinde ifade edildiğinde, bir mutant içine yanlış, toksik, ve patojenik protein. Mutant HTT toplama yatkındır ve nöronal hücre ölümü ve dejenerasyona yol açar, ya kısa oligomerik türler olarak ya da daha büyük yüksek yapılandırılmış amiloidler7.
Nematod manipülasyon kolaylığı sayesinde yaşlanma ve nörodejenerasyon eğitimi için bir model sistemidir, izojenik doğa, kısa ömrü, ve optik şeffaflık8. In vivo HTT stabilitesini incelemek için, bir füzyon yapısı C. eleganssinir sisteminde ifade edildi. 25Qs (HTTQ25-D2) fizyolojik bir streç veya 97Qs (HTTQ97-D2) patolojik bir streç içeren bir HTT-D2 transgene nematod ömrü boyunca pan-nöronsal aşırı ifade edilir9. Canlı C. eleganları kısa ve odaklanmış bir ışık noktasına tabi tutarak, tek bir nöron fotoşunla çevrilir ve dönüştürülmüş HTT-D2 zaman içinde izlenir. Bozulmuş HTT-D2 miktarını belirlemek için, yeni dönüştürülmüş HTT-D2'nin kırmızı sinyali arasındaki fark, belirlenen bir süre sonra HTT-D2'nin kalan kırmızı sinyaliile karşılaştırılır. Bu nedenle, huntingtin fizyolojik formuna göre genişletilmiş ve toksik formunda bulunduğunda nasıl bozulduğunu araştırmak mümkün olur; anterior veya posterior nöronlar Q97 karşı Q25 varlığına farklı tepki nasıl, özellikle uzun sürelerde; ve yaşlanma sırasında proteostasis ağının (PN) çöküşünün bozulma oranlarındaki farklılıklara nasıl katkıda olduğu. Bu sonuçlar sadece HTT-D2'nin cirosu üzerine küçük bir gözlem kümesini açıklar. Ancak, protein toplama ve proteostaz alanı ile ilgili daha birçok biyolojik sorular bu in vivo uygulama ile ele alınabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-Agar Kobe I</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>5210.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Universal Grade</td>
			<td>Bio &#38; Sell GmbH</td>
			<td>BS20.46.500</td>
			<td>Mounting slide component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Bacto Peptone</td>
			<td>BD-Bionsciences</td>
			<td>211677</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deckgl&#228;ser-18x18mm</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0657.2</td>
			<td>Cover slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ 1.52p</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole Hydrochloride</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4341</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710-ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Laser Scanning Confocal Micoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting stereomicroscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Mounting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ25-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neuronal-HTTQ97-Dendra2</td>
			<td>this paper</td>
			<td></td>
			<td>C. elegans strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP50 Escherichia coli</td>
			<td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Nematode food source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3957.2</td>
			<td>NGM component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard-Objekttr&#228;ger</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0656.1</td>
			<td>Glass slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2010 B SP1</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Confocal acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo quantification of protein turnover in aging c. elegans using photoconvertible dendra2

Proteinler homeostazkorumak için bir hücre içinde sürekli olarak sentezlenir ve bozulur. İlgi çekici bir proteinin bozulmasını izleyebilmek sadece yaşam döngüsünü değil, aynı zamanda proteostaz ağındaki dengesizlikleri ortaya çıkarmak için de önemlidir. Bu yöntem, hastalığa neden olan protein huntingtin bozulmasıizlemek için nasıl gösterir. Dendra2'ye erimiş huntingtin'in iki versiyonu C. elegans sinir sisteminde ifade edilir: fizyolojik bir versiyonu veya glutaminlerin genişletilmiş ve patojenik uzantısı olan bir versiyonu. Dendra2 fotoconvertible floresan proteindir; kısa bir ultraviyole (UV) ışınlama darbesi üzerine, Dendra2 uyarma / emisyon spektrumları yeşilden kırmızıya değiştirir. Bir darbe-kovalamaca deneybenzer, dönüştürülmüş kırmızı-Dendra2 cirosu izlenebilir ve ölçülebilir, ne olursa olsun yeni sentezlenen yeşil-Dendra2 gelen girişim. Konfokal tabanlı mikroskopi ve C. elegansoptik şeffaflık nedeniyle kullanarak, bir canlı, yaşlanan organizmada huntingtin-Dendra2 bozulmasını izlemek ve ölçmek mümkündür. Nöronal huntingtin-Dendra2 dönüşümden kısa bir süre sonra kısmen bozulur ve zamanla daha da temizlenir. Bozulmayı kontrol eden sistemler mutant huntingtin varlığında eksiktir ve yaşlanma ile daha da bozulur. Aynı sinir sistemi içinde nöronal alt tiphuntingtin-Dendra2 için farklı ciro kapasiteleri sergiler. Genel olarak, Dendra2'ye kaynaşmış herhangi bir ilgi proteininin izlenmesi, sadece bozulması ve ilgili proteostasis ağının oyuncuları hakkında değil, aynı zamanda konumu, ticareti ve ulaşımı hakkında da önemli bilgiler sağlayabilir.

Fotoconvertible protein Dendra2 ile çerçeve içinde huntingtin ekson-1 protein parçasını ifade eden iki nematod suşmikroenjeksiyon ile elde edilmiş ve plazmidler ekstrakromosomal dizi olarak tutulmuştur. Füzyon yapısı tüm C. elegans sinir sistemi gelişiminden yaşlanma boyunca ifade edildi. Burada HTT-D2 fizyolojik 25 poliglutamin streç (HTTQ25-D2, Şekil 1A)veya 97 glutamin (HTTQ97-D2, Şekil 1</st...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2 at JoVE.com

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Burada fotoconvertible florofor Dendra2 erimiş protein huntingtin bozulmasını izlemek için bir protokol sunulmaktadır.

Fotodönüştürülebilir Dendra2 kullanarak Yaşlanma C. Elegans Protein Ciro Vivo Quantification

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Bu protokol, canlı ve yaşlanan C.elegans ilgi bir protein in bozulması izleme ve nicelik sağlar. Bu in vivo ve noninvaziv teknik, Dendra2'yi parlak ve kararlı bir florofora güvenilir bir şekilde dönüştürmek için kurulmuş sadece küçük bir mikroskobu gerektirir. Bu yöntem memeli sistemlerine ve zebra balıklarına uyarlanabilir.Çalışma, proteostatis ağı içinde ciro koymak yanı sıra ulaşım ve kaçakçılık. Mavi ışık lazeri ile tarama yaparken Dendra2'nin istenmeyen dönüşümlerini kışkırtmamaya ve her sistem ve füzyon proteini için edinme ayarlarını ve dönüşüm ayarlarını test etmeye ve optimize etmeye özen. Deney için istenilen yaşa 20 santigrat derece yaş uyumlu nematodlar büyüyerek başlayın.Görüntüleme deneyi günü, çift distile suda % 3 konsantrasyonda genel sınıf agarose eritin. Agarose soğurken, erimiş agarose yaklaşık 400 mikrolitre aspirasyon kolaylaştırmak için bir mililitre pipet ucu ucu kesti. Dikkatle temiz bir cam slayt üzerine agarose birkaç damla ekleyin ve hemen iki cam parçaları arasında agarose ince bir yastık oluşturmak için damla üstüne başka bir slayt yerleştirin.Agarose kuruduğunda, dikkatlice üst slayt çıkarın. Yeterli slayt hazırlandığında, konfokal mikroskop yazılımını açın ve uyarma ve emisyon için ışık yolunu ayarlayın. Yeşil Dendra2 için 486 ila 553 nanometre ekleyin ve kırmızı Dendra2 için 580 ila 740 nanometre ekleyin.Florofor yoğunluğuna göre her iki kanalın gücünü ve kazancını ayarlayın ve iğne deliğini tamamen açacak şekilde ayarlayın. Sıralı bir kanal modu seçin ve parçayı her kareyi değiştirecek şekilde ayarlayın. Bir satır adım ile 1024 tarafından 1024 olarak çerçeve ve çerçeve boyutu olarak tetkik modu ayarlayın.Ortalamayı ikiye ve tek yönlü çizginin ortalama yöntemine ve moduna göre ayarlayın. Bit derinliğini sekiz bitolarak ayarlayın. Dendra2'nin dönüştürülmesi için çok boyutlu edinme ayarını tanımlayın.Dönüştürme ve ağartma için, 405 nanometre diyot lazer% 60 enerji gücü ayarlayın kullanın. Döngüler ve normal bir başlangıç ve durdurma arasında 0,0 milisaniyelik bir aralık ile iki döngüden oluşan bir zaman serisi seçin. Ağartmayı iki kişiden birini tarayadıktan sonra başlayıp 30 yineleme için tekrarlayacak ve yoğunluk %50'ye düştüğünde duracak şekilde ayarlayın Sonra, dönüşüm için hızlı ve anlık bir görüntü yakalamak için ortama dönüştürme için edinme pikselinin hızını tanımlayın.Nematodları slaytların üzerine monte etmek için, her slaytta agarose pedin in zıttı üzerinde dört kareiçeren bir pencere çizmek ve numaralandırmak için kalıcı bir işaretçi kullanın. Agarose pedin ortasına 15 mikrolitre levamisole ekleyin ve damlacık içine yaşa uygun nematodlar için aktarmak için bir stereo mikroskop ve tel çekme kullanın. Yavaşça kare bir pencereiçine her nematode taşımak için bir kirpik toplama kullanın.Tüm nematodlar yeniden konumlandırıldığında, görüntüleme sırasında nematodları etkisiz hale getirmek için sıvının üzerine bir kapak kayma koymadan önce solucanların hareket etmesini bekleyin. Daha sonra, confocal mikroskop aşamasına slayt yerleştirin. Yeşil Dendra2 dönüşüm için, ilk nematod bulmak ve baş veya kuyruk odaklanmak için yeşil floresan altında 20 X hedefinin gözlük kullanın.Konfokal moduna geçin ve doymuş, ancak aşırı pozlanmış olmayan bir görüntü elde etmek için kazancı ve lazer gücünü artırın veya azaltın. Seçilen nöronun etrafına ilgi alanı çizin ve ilk ilgi bölgesini içeren kuyruğun etrafına ikinci bir daha büyük ilgi bölgesi çizin. Edinilecek, ağartılacak ve analiz edilecek ilk bölgeyi ayarlayın.Satın alınacak ve analiz edilecek, ancak ağartılmayan ikinci ilgi bölgesini ayarlayın. Tarama hızını maksimuma ayarlayın ve seçilen Dendra2 nöronları dönüştürmek için taramayı başlatın. Dönüşümden hemen sonra, kırmızı kanalda Dendra2 görselleştirmek ve dönüştürülmüş nöron ilgili odak ve ilgili maksimum projeksiyon bulmak için yeşil 561 nanometre lazer ile canlı tarama başlar.Hızlı bir şekilde daha düşük bir piksel dwell hızına tonlamak ve daha yüksek bir çözünürlükte her iki kanal anlık görüntü elde. Bu resim, dönüştürmeden sonra sıfır zamanda kabul edilir. Ardından, tarayıp tanımlanabilir bir ad ve veya sayı yla tazyikkaydedin ve ardından sıfır etiketini etiket.Zaman içinde Dendra2 bozulmasını izlemek için, ilgili nematod nöronun times sıfır görüntü açın. Aynı görüntü ayarını kullanarak, kırmızı kanalda canlı tarama yapmaya başlayın ve dönüştürülmüş kırmızı nöronu odak haline getirin. Ardından, herhangi bir edinme parametrelerini değiştirmeden, ilk görüntüyle aynı hızda anlık görüntü elde edin.Dendra2'yi verimli ve yeterli bir şekilde dönüştürmek ve farklı zaman dilimleri boyunca aynı edinme parametrelerini korumak için dönüşüm ayarınızı dikkatle tanımladığınızdan emin olun. Dönüştürülmüş Dendra2 görüntülerini analiz etmek için Fiji'deki sıfır ve ikinci nokta görüntülerini açın ve Analiz et ve Ölçümleri Ayarla'yı açın. Alan ve Tümleşik Yoğunluk işlevlerini seçin ve kırmızı kanalla elde edilen görüntüyü seçin.Çokgen Seçim Aracı'nı kullanarak, sıfırın dönüştürülmüş nöron etrafında bir ilgi alanı çizin. Nöronun hatlarını düzgün bir şekilde tanımlamak için yoğunluk eşiklerini vurgulamak için Görüntü, Ayarla ve Eşik'i seçin. Seçim tanımlandıktan sonra Çözümle ve Ölç'i tıklatın.Seçilen ilgi alanı için alan, tümleşik yoğunluk ve ham tümleşik yoğunluk değerleri de dahil olmak üzere bir açılır sonuç penceresi görüntülenir. İkinci zaman noktasından görüntü için aynı seçim ve ölçüm işlemini gerçekleştirin. Ardından, değerleri elektronik tabloya kopyalayın.Dönüştürmeden önceki bu temsili analizde, örnek kırmızı kanalda heyecanlandığında kırmızı sinyal görünmüyordu. Işınlama üzerine, yeşil sinyal HTT-D2 dönüştürüldü ve daha sonra kırmızı bir sinyal ortaya çıktı azaldı. HTT-D2 ekspresyonu zamanla bozulmuş, kırmızı HTT-D2 sinyal düzeylerinde azalma ve daha fazla füzyon proteini yeni sentezlendikçe yeşil HTT-D2 sinyalinin olası bir artışına neden oldu.Özellikle, kuyruk bölgesinin nöronlar baş ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha aktif olduğu tespit edildi. Ayrıca, kontrol HTTQ25-D2 24 saat dönüşümden sonra, daha sonra baş ve kuyruk nöronlar hem de iki saat sonra önemli ölçüde daha fazla bozulma oldu. Bu fark patojenik HTTQ97-D2'de gözlenmemiş, ancak proteostaz ağının sinir sistemi boyunca daha uzun glutamin uzantıları içeren HTT-D2'yi çıkaramadığını düşündürmektedir.HTTQ97-D2 çok eski nematodlarda HTTQ25-D2 kadar verimli bir şekilde bozulmadı ve proteostaz ağının yaşlı hayvanlarda toplu ve muhtemelen zehirli Huntingtin türlerini ortadan kaldıramadığını vurguladı. Daha da önemlisi, kuyruk nöronlar genç nematodlarda toksik HTTQ97-D2 ile başa çıkabildiler, bu da htt-D2'yi çıkarmak için çeşitli eşlik eden proteostaz ağ mekanizmalarının iş başında olabileceğini düşündürmektedir. Dönüşümden hemen sonra her örnek için aşırı pozlanmış ve doymamış görüntü elde edin ve doymamış görüntü elde edin ve bu örnek için aynı ayarı zaman içinde yeniden kullanın.Bu protokol ile, bir proteostatis ağındaki değişiklikleri test etmek ve ayrıca, süper çözünürlüklü mikroskopi yardımıyla, hastalıkla ilişkili proteinlerin yayılmasını izlemek mümkündür.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

Işıksal Çözülmüş İki foton Mikroskop kullanarak G Protein Coupled Reseptör Etkileşmeleri in vivo Niceleme

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

Yaşayan Hücreler ubikitin-proteozom Faaliyet Monitoring Degron (DGN)-destabilize Yeşil floresan proteini (GFP) tabanlı Muhabir Protein Kullanımı

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Antikor boyamasında<em&gt; C. Elegans</em&gt; &quot;Freeze-Cracking kullanma&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Yöntemleri ile Caenorhabditis elegans çağda doğal Protein toplama çalışma değişikliklere

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans RAN Peptid Toksisitesi Ölçme

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...