Name: generation of hipsc-derived intestinal organoids for developmental and disease modelling applications
Uploaded: 2024-03-08T12:30:00
Duration: 6 min 34 s
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NHはMRC(MR/S009930/1)とウェルカム・トラスト(204267/Z/16/Z)から資金提供を受け、PDはMRC PhD DTPから資金提供を受け、KLFはBBSRC iCASEから資金提供を受けています。

注:以下に詳述するすべての組織培養作業は、クラスII層流フードで行う必要があります。
1. ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の後腸内胚葉への分化
<ol li=""><li>細胞培養フラスコに細胞外マトリックスをコーティングするには、まず必要なマトリックスの量を計算します。これは、マトリゲルでコーティングされた12ウェルプレートの例です。12ウェルプレートをコーティングするために必要な細胞外マトリックスの量を計算します。次の式を使用します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61199/61199equ01.jpg"> 注:細胞培養皿に細胞外マトリックスをコーティングします。マトリゲルを使用する場合は、播種前の濃度0.035 mg/cm2 24時間で分化してください。製品シート上の細胞外マトリックスのバッチ濃度を確認し、メーカーの指示に従って実験の前に少量のアリコートを調製します。</li>
	<li>p1000ピペットを使用して、必要な量の細胞外マトリックスを冷たいDMEM培地で希釈します。</li>
	<li>5 mLのストリペットを使用してよく混合します。</li>
	<li>500 μLの希釈マトリックスを各ウェルプレートに加えます。プレートを静かに振とうして希釈した細胞外マトリックスを均一に分散させ、37°Cで最低12時間インキュベートします。</li>
	<li>細胞をプレートに播種する前に、各ウェルを500 μLのPBSで洗浄し、余分な細胞外マトリックスを除去します。これにより、分化中の細胞の剥離が防止されます。</li>
	<li>細胞外マトリックスの乾燥を防ぐために、播種する準備ができるまで、最後の洗浄をウェルに残します。</li>
	<li>ヒトiPS細胞を最終的内胚葉(DE)または後腸(HG)に分化させるには、選択した維持培地(例:必須8培地)で培養したiPS細胞のフラスコを採取し、培地を吸引します。(ここでは、25,000細胞/cm2で細胞を播種します)。 注:播種密度は分化を成功させるために重要であり、個々のiPS細胞株ごとに最適化する必要があります。</li>
	<li>フラスコ内の細胞を5 mLのPBSで洗浄します。PBSを吸引します。</li>
	<li>2.5 mLの細胞解離溶液(TrypLEなど)を加え、室温で4分間放置します。細胞解離溶液を吸引し、フラスコを軽くたたいて細胞を剥離します。</li>
	<li>37°Cに温めた5 mLのDMEM培地でフラスコを洗浄し、すべての細胞を15 mLのチューブに集めます。</li>
	<li>再懸濁した細胞溶液10 μLを採取し、血球計算盤で細胞密度を測定します。</li>
	<li>1.05 x 106 個の細胞を採取するのに十分な量の細胞懸濁液を採取し、15 mLチューブに入れます。</li>
	<li>160 x g で3分間回転させます。細胞を遠心分離している間に、細胞外マトリックスでコーティングした12ウェルプレートからPBSを吸引します。</li>
	<li>遠心分離後、上清を吸引し、ROCK阻害剤(10 μM)を含む12 mLの維持培地に細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>p1000ピペットを使用して、12ウェルプレートの各ウェルに1 mLの細胞懸濁液を加えます。細胞ウェルを再懸濁して、ウェル間に均等に分布するようにします。</li>
	<li>プレートを静かに振って、プレートのウェル内に細胞を分散させますが、ウェルの中央に細胞が濃縮されるため、培地の渦巻きを避けてください。</li>
	<li>37°C、5%CO2 インキュベーターに入れます。</li>
	<li>シード後24時間で培地をメンテナンス培地(エッセンシャル8培地など)のみ(ROCK阻害剤なし)に変更します。</li>
	<li>DEへの分化を開始するには、 表1に従って内胚葉基礎培地を調製する。 注:分化の開始時に、細胞は60〜80%のコンフルエントにある必要があります。</li>
	<li>アクチビンA(100 ng/mL)およびWnt3(50 ng/mL)を内胚葉基底培地に添加して、12 mLのDE培地を調製します。</li>
	<li>培地を37°Cにウォームアップします。</li>
	<li>組織培養プレートまたはフラスコの各ウェルから培地を吸引する。</li>
	<li>12ウェルプレートの各ウェルに1 mLのDE培地を添加して、DEの分化を開始します。</li>
	<li>DE分化開始から24時間後(D1 DE)、新しいDE培地を調製し、培地交換を行います。</li>
	<li>ステップ 1.24 を 48 時間(D2 DE)で繰り返します。この段階で細胞死が多く見られる場合は、培地交換前にすべてのウェルを500 μLのPBSで洗浄してください。 注:内胚葉の分化が成功したことを確認するには、フローサイトメトリーを実施してSOX17の発現を評価します。通常、D3 DEまでに>80%の細胞がSOX17陽性になると予想されます。SOX17の発現が最適でない場合は、細胞播種密度とAct-Aの濃度を最適化する必要があります。</li>
	<li>この時点でHG分化を開始します、つまりDE分化の開始から72時間後。CHIR99021(3 μM)およびRA(1 μM)を内胚葉基底培地に添加して、12 mLのHG培地を調製します(表1)。 注:D3 DEでは、セルは均一な単層を形成しているはずです。最適なDE分化は、分化の次の段階にとって重要です。</li>
	<li>DE培地を吸引します。</li>
	<li>12ウェルプレートの各ウェルに1 mLのHG培地を添加して、HGの分化を開始します。</li>
	<li>毎日の培地交換で4日間分化を続けます。 注:DE事後処理の成功を判断するには、フローサイトメトリーを実施してCDX2の発現を評価します。HG分化のD4までに、通常、細胞の>80%がCDX2陽性であると予想されます。事後処理が最適でない場合は、CHIR99021の濃度を最適化する必要があります。</li>
	<li>RNA抽出用のサンプルを採取するには、分化培地を吸引し、500μLのPBSでウェルを洗浄します。</li>
	<li>PBSを吸引し、RNA抽出キットから適量の細胞溶解バッファーを添加します。</li>
	<li>p1000ピペットを使用して、ウェルの底をこすり、すべての細胞が確実に溶解するようにします。</li>
	<li>細胞ライセートを吸引し、清潔なチューブに入れます。</li>
	<li>RNA抽出に進むか、RNA抽出の準備ができるまでライセートを-20°Cで凍結します。</li>
	<li>免疫染色には、分化培地を吸引し、500 μLのPBSでウェルを洗浄します。</li>
	<li>PBSを吸引し、500 μLの4% PFAを加えます。 注:PFAは有毒です。適切なPPEを使用し、PFAの廃棄については地域の検査手順に従ってください。</li>
	<li>4°Cで20分間インキュベートします。</li>
	<li>PFAを除去し、500 μLのPBSでウェルを3回洗浄します。</li>
	<li>免疫染色の準備が整うまで、細胞に最後のPBS洗浄を放置します。</li>
</ol>2. 腸管オルガノイドの継代
<ol><li>表2に従って腸の基礎培地を調製する。</li>
	<li>2D細胞培養から3D細胞培養に移行するには、6ウェルプレートを使用して、ヒトiPS細胞からDE細胞を作製します。5 mLのストリペットを使用して、6セルプレートを形成する細胞の単層を剥離します。</li>
	<li>細胞を15 mLの遠心チューブに集めた後、400 x g で1分間遠心分離して細胞ペレットを作製します。</li>
	<li>細胞ペレットを、成長因子を含む腸内増殖培地に再懸濁します:SB202190(10 μM)、A83-01(500 nM)、ガストリン(10 nM)、ノギン(100 ng/μL)、EGF(500 ng/μL)、R-Spondin1(100 ng/mL)、CHIR99021(6 μM)、ROCK阻害剤(10 μM)。</li>
	<li>播種するウェルの数に応じて、適切な量の細胞外マトリックスを添加します。これは、以下の式を使用して計算できます。 [1] 細胞外マトリックス/培地の総容量 (μL) = 30 μL * 48 ウェルプレートのウェル数 [2] 細胞外マトリックスの必要量(μL)=[1]×2/3からの回答 [3] 必要培地量(μL)=[1]からの回答 * 1/3</li>
	<li>30 μLの細胞懸濁液を48ウェルプレートの各ウェルの中央に添加します。</li>
	<li>プレートを37°Cのインキュベーターで最低5分間インキュベートし、細胞外マトリックスを固化させます。</li>
	<li>細胞外マトリックスドームが固まったら、すべての成長因子を含む300 μLの腸内増殖培地を各ウェルに加えます。</li>
	<li>プレートを 5% CO2 を含む 37 °C のインキュベーターに戻します。 注:48時間後にオルガノイドが観察されない場合、および/または有意な細胞死がある場合は、ROCKiおよびNOGGIN濃度を最適化する必要があります。</li>
	<li>オルガノイドを継代するには、光学顕微鏡で細胞を観察し、オルガノイドの密度とサイズを評価し、継代が必要かどうかを判断します。</li>
	<li>細胞培養培地を氷冷PBSに置き換えてください。 注:オルガノイド培養物は、約5〜7日ごとに分割する必要があります。腸管内腔内に明らかな細胞破片の蓄積と周囲の腸内増殖培地の黄変がある場合は、腸管内培養物の継代が必要です。</li>
	<li>オルガノイドと細胞外マトリックス球体を、5 mLのストリペットで掻き取る動作でプレートから機械的に剥離します。</li>
	<li>オルガノイドを各ウェルから15 mLの遠心チューブに集めます。</li>
	<li>オルガノイド懸濁液を400 x g で1分間遠心分離し、オルガノイドをペレット化します。細胞ペレットの頂上に達するまで上清を吸引し、目に見える細胞外マトリックス層に到達したら注意する。</li>
	<li>ペレットを氷冷したPBS15 mLに再懸濁します。 注:このステップは、最初のスピンで除去されなかった残りの細胞外マトリックスを洗浄するのに役立ちます。</li>
	<li>400 x g で1分間遠心分離します。オルガノイドを含むペレットまで培地を吸引します。</li>
	<li>氷冷したPBS1 mLに再懸濁します。p200ピペットを使用して、ピペッティングを数回行うことで、インタクトオルガノイドを手動で破壊します。 注:光学顕微鏡を使用してオルガノイドのサイズを観察し、さらに解離する必要があるかどうかを判断します。</li>
	<li>成長因子を含まない培地9 mLを添加します。</li>
	<li>400 x g で1分間遠心分離します。オルガノイドペレットになるまで上清を吸引します。</li>
	<li>以下の式を使用して、必要な細胞外マトリックスと培地の量を計算します。 [1] 細胞外マトリックス/培地の総容量 (μL) = 30 μL * 48 ウェルプレートのウェル数 [2] 細胞外マトリックスの必要量(μL)=[1]×2/3からの回答 [3] 必要培地量(μL)=[1]からの回答 * 1/3</li>
	<li>オルガノイドペレットを、成長因子(NogginおよびROCK阻害剤を含む)を含む計算された量の腸内培地に再懸濁します。</li>
	<li>この細胞懸濁液に必要量の細胞外マトリックスを添加し、オルガノイドが均一に分布するように再懸濁します。</li>
	<li>この懸濁液30μLを48ウェルプレートの各ウェルの中央にピペットで移します(できれば37°Cのインキュベーターで予熱します)。</li>
	<li>細胞外マトリックスが固まるまで、プレートを37°Cのインキュベーターに5分間戻します。</li>
	<li>成長因子(+ ROCK阻害剤)を含む腸内培地を調製します(48ウェルプレートあたり約17 mL)。</li>
	<li>各ウェルに300μLを添加します。</li>
	<li>37°C、5% CO2でインキュベートします。</li>
	<li>継代後、腸オルガノイドの培地を吸引し、2〜4日ごとに成長因子(NogginおよびROCK阻害剤なし)を含む新鮮な腸培地と交換します。 注:48時間後にオルガノイドが観察されない場合、および/または有意な細胞死がある場合は、ROCKiおよびNOGGIN濃度を最適化する必要があります。 注:腸オルガノイドは、in vivoでさまざまな炎症性メディエーターに反応します。TNFαは、いくつかの炎症過程に関与する細胞シグナル伝達タンパク質です。</li>
	<li>腸オルガノイドで炎症反応を引き起こすには、基礎培地のみで40 ng/mLの濃度でTNFαを調製します。</li>
	<li>48ウェルプレートから培地を吸引します。</li>
	<li>40 ng/mL の TNFα を含む調製した基礎培地 300 μL を添加します。</li>
	<li>プレートを37°Cで48時間インキュベートし、炎症誘発性環境を再現します。 注:腸オルガノイドは、in vivoでさまざまな炎症性メディエーターに反応します。TNFαは、いくつかの炎症過程に関与する細胞シグナル伝達タンパク質です。</li>
	<li>残った細胞は、5%トリジーンを含む真空トラップに吸引して廃棄します。</li>
</ol>

<ol>
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著者は何も開示していません。

ここでは、ヒト多能性細胞をヒト腸オルガノイドに微分するためのプロトコルについて説明します。炎症を研究するための使用を実証します。しかし、これは様々な状況に適用することができ、あらゆる遺伝的背景において、CRISPR/Cas9遺伝子編集アプローチ14と組み合わせることができる。一旦分化されると、決定的な内胚葉、後腸内胚葉、そして腸上皮の自然な発生分化シーケンスに従って、得られたオルガノイドは12ヶ月以上連続的に培養され、継代することができます。
このプロトコルの重大な面はendodermの微分の前に未分化の幹細胞の最初のめっき密度である。これが十分に最適化されていないと、最初のDE分化ステップで細胞が死滅したり(細胞が疎すぎる場合)、DE分化の効率が低下したり(細胞の密度が高すぎる場合)する可能性があります。正しい開始密度は、使用する細胞株に合わせて最適化する必要があり、正しい密度はDE D3の終わりまでに単層を生成する必要があります。フローサイトメトリーはDE仕様の効率を決定するために使用すべきであり、通常、SOX17および/またはCXCR4に対して陽性の細胞の>80%が見られます。SOX17陽性細胞の数が60%未満の場合、HGパターニングの効率が影響を受け、細胞外マトリックスに移行したときに形成されるオルガノイドが少なくなります。これにより、最終的に得られたオルガノイド培養が失敗します。DEからHGへのパターニングが成功したかどうかを判断するために、フローサイトメトリーでCDX2陽性細胞の数を評価したところ、通常、>80%の陽性細胞が見られると予想されます。繰り返しになりますが、CDX2陽性細胞の数が50%を下回ると、3D細胞外マトリックス培養に移されたときに生成される腸管オルガノイドの数に悪影響を及ぼします。
2D単分子膜を3D培養物に転写した後、転写後24〜48時間で小さなコンパクトな球体が現れるはずです。死細胞の大きなシートは、使用する細胞株の分化効率に応じて現れることがあります。これらの破片を除去するために培養物をすぐに継代する代わりに、オルガノイドが完全に形成され、より複雑で折り畳まれた構造を発達させます。最初の通過を試みる前に7〜10日待つことで、多くの新しい腸オルガノイドを生成するのに十分な分裂細胞が存在することが保証されます。培養中にまだ存在する破片は、継代プロセス中に、解離したオルガノイド/破片混合物をチューブ内でゆっくりと回転させ、オルガノイドをペレット化するのに十分な速度で、細胞のシートを培地に浮遊させることで簡単に除去できます。その後、培地と細胞の破片を吸引して、オルガノイドのペレットのみが残るようにすることができます。
このアプローチの限界は、iPS細胞由来の細胞型は、遺伝子発現や機能プロファイルの点で完全に成熟していないことが多いことです。iPS細胞由来の腸組織が特定の用途に適しているかどうかを判断するには、オルガノイドを腸細胞(VIL)、腸内分泌細胞(neurog3)、杯細胞(MUC2)、一過性増幅細胞(CD133)、パネート細胞(FZD5)、LGR5+ 幹細胞(LGR5)など、さまざまな細胞タイプで特性評価し、オルガノイドの細胞組成を決定する必要があります。
全体として、他の多くのオルガノイド微分プロトコルに対するこのプロトコルの主な利点は、この培養プラットフォームがいくつかの組換えタンパク質と調整された培地調製物を低分子に置き換えることで非常に費用対効果が高いことです15,16。HGへの分化は非常に簡単かつ迅速で、ヒト胚性幹細胞と人工多能性幹細胞の両方に適用でき、結果は同じです。厳密に追跡し、使用されている細胞株に最適化すると、間葉系細胞を汚染しない比較的単純なモデルプラットフォームを提供し、炎症、宿主病原体相互作用を含むさまざまな状況で腸上皮を研究するために適用できます7。腸線維化モデリングは、線維化促進刺激を与え、QPCR、ウェスタンブロット、ELISAによってコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質の発現を評価することで調査できます。分化前に未分化幹細胞株にCRISPR/Cas9遺伝子編集技術を用いることで、疾患特異的オルガノイドやより複雑な疾患モデルの作成に使用できる遺伝子ノックアウトオルガノイドやタンパク質過剰発現オルガノイドの作成が可能になります14,17,18。

多能性幹細胞(PSC)の自己複製や人体のあらゆる細胞型に分化する能力などの特性は、発生、疾患病理学、薬物検査の研究において貴重なツールとなっています1。ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、患者由来の疾患表現型の原因となるゲノムを直接捕捉できるため、疾患モデリング研究に特に有用です2,3。このようなiPS細胞は、遺伝的欠陥の影響を受けた細胞型に分化させることができ、疾患の分子メカニズムを注意深く調べることができます4。
ヒトPSCの分化プロトコルは、系統のコミットメントと仕様を支配する特定のシグナル伝達経路の活性化または阻害により、主要な発生段階を介して細胞の分化を指示することを目的としています。ヒトiPS細胞を多能性状態で維持するには、中程度のアクチビンA(Act-A)シグナル伝達が必要であり、Act-Aを3日間大量に投与すると、ヒトiPS細胞は決定的な内胚葉(DE)の運命をたどることになります5,6。Act-A経路とWnt経路は、DEの前部-後部の同一性を指示します。Act-Aによるシグナル伝達は、HHEX、HNF4α、GATA4などの前腸(FG)マーカーを誘導し、CDX2などの後腸(HG)遺伝子の発現を阻害します。Wntシグナル伝達はDEの事後化を誘導し、DEはHG遺伝子発現プロファイルを採用する7,8。HG細胞の同一性が確立されると、分化を2Dから3Dに移行し、腸オルガノイドの形成に向けることができます。
腸管オルガノイドは、典型的には、ラミニン、IVコラーゲンおよびエンタクチンから構成され、EGF、FGF、PDGF、およびIGF-1などの成長因子を豊富に含み、支持体の生存および増殖に寄与する3D細胞外マトリックス(例えば、マトリゲルまたは他の適合性ECM)ベースの培養システム9で培養される。オルガノイドは、ガストリン、ノギン、CHIRを含む特定の培地で培養され、長期培養中の腸幹細胞の成長と増殖を刺激およびサポートします。
腸管上皮細胞が細胞外マトリックスに埋め込まれた後、腸陰窩が形成され、拡大し始め、最終的にスフェロイドを形成します。これらは、腸上皮の生理学的機能を模倣するオルガノイド構造に成熟します。オルガノイドは通常、機能および遺伝子発現プロファイルを有意に損なうことなく、1年以上培養することができます。継代は、オルガノイドを酵素でより小さな断片に消化し、自己再構成して完全なオルガノイドにすることで、毎週行う必要があります。
確立されたオルガノイド株は、クローン病、潰瘍性大腸炎、結腸直腸がんなど、腸に関連する多くの疾患の信頼できるモデルとして使用できます10,11,12,13。これは、動物細胞がこれらの疾患に関連するヒト遺伝子を発現し、in vivoでヒト組織で発生するものにより近い外部刺激に応答するため、動物細胞よりも好ましいモデルです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12 (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12654-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1046-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor reduced Matrigel</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer solution (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9713.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt 3a</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of hipsc-derived intestinal organoids for developmental and disease modelling applications

ヒトiPS細胞由来の腸管オルガノイドは、分化した細胞から複雑な3次元構造に自己組織化する上皮構造で、ヒトの腸管上皮に代表され、陰窩や絨毛のような構造を呈します。ここでは、ヒトiPS細胞由来の腸管オルガノイドを段階的に分化させて最終内胚葉とし、後方化して後腸上皮を形成した後、3次元培養条件に移行する方法を紹介します。3D培養環境は、細胞外マトリックス(ECM)(マトリゲルやその他の適合性のあるECMなど)に、SB202190、A83-01、ガストリン、ノギン、EGF、R-スポンジン-1、CHIR99021を添加したものです。オルガノイドは7日ごとに継代を受け、そこで機械的に破壊されてから新鮮な細胞外マトリックスに移行し、増殖させます。QPCRと免疫細胞化学により、ヒトiPS細胞由来の腸管オルガノイドには、杯細胞、パネート細胞、腸細胞などの成熟した腸管上皮細胞が含まれていることが確認されています。さらに、オルガノイドは、上皮細胞の頂端表面に局在するビリンの発現による分極の証拠を示します。
得られたオルガノイドは、ヒトの腸の発達だけでなく、炎症性腸疾患を含む多数のヒトの腸疾患のモデル化にも使用できます。腸の炎症をモデル化するために、オルガノイドをTNF-α、TGF-β、細菌性LPSなどの炎症性メディエーターに曝露することができます。炎症性サイトカインに曝露されたオルガノイドは、応答して炎症性および線維性表現型を示します。IBD患者由来の健康なPS細胞とiPS細胞のペアリングは、IBDを引き起こすメカニズムを理解する上で有用である可能性があります。これにより、疾患の早期診断に役立つ新しい治療標的や新しいバイオマーカーが明らかになるかもしれません。

微分プロトコルの概略図を 図1Aに示します。プロトコルの1日目には、iPS細胞はコンパクトで、総コンフルエンスが約50〜60%の小さなコロニーを形成する必要があります。DE細胞への分化誘導から24時間後、幹細胞コロニーから離れて移動し始め、細胞の単層を形成します。これは次の3日間にわたって続き、DE分化のD3上に完全な単分子膜を形成するはずです(図1)。遺伝子発現は、D0で高発現し、DE分化中に急速にダウンレギュレーションされる多能性マーカー(OCT4、NANOG、SOX2)を使用して、分化の過程で監視する必要があります。DE分化中、T発現はD1でピークに達し、続いてD2でEOMESおよびMIXLがピークに達します。D2では、DE遺伝子(SOX17、FOXA2、GATA4、CXCR4)が発現し始め、D3でピークに達します(図2 および 図3)。細胞はDE D3によって単層である必要があり、その後、後腸内胚葉に後方化することができます。事後化イベントでは、早ければD2から3次元構造が形成され始めます。ただし、D4でのみ表示され始める場合もあれば、まったく表示されない場合もあります。これは、細胞が進行して腸管オルガノイドを形成するかどうかを必ずしも示しているわけではありません(図1)。HGの仕様では、CDX2およびHNF4aの発現が誘導され、時間の経過とともに増加します(図3)。
細胞の2Dシートを細胞外マトリックスに転写した後、2D細胞の塊が最初の24時間観察されます。48時間後、細胞のシートは、最初は小さい(図4A)が、その後、7〜10日間の培養で徐々にサイズと複雑さを増していく、より圧縮された3Dスフェロイド構造に自動組織化し始めるはずです(図4B および 図4C)。オルガノイドは、内腔がオルガノイド/スフェロイドの中心を向いた明らかな上皮を伴う明確なオルガノイド/スフェロイド形態を達成するまで継代しないでください(図4D)。この段階では、免疫細胞化学を使用して、ビリンやCDX2などの腸マーカーの発現を確認できます(図5)。2D細胞の塊のすべてがオルガノイドに成長するわけではなく、細胞外マトリックス内に汚染死細胞があります。これらの細胞の死骸は、生き残った細胞が大きなオルガノイドを形成し、継代の準備が整うまで無視する必要があります。
炎症をモデル化するために、TNFαを組織培養培地に24〜48時間添加することができます。炎症性分子とのインキュベーション後、オルガノイドは単離および継代に用いられるのと同じ技術を用いて回収され、QPCRやウェスタンブロッティングなどの細胞バッファー互換アプリケーションを用いて溶解されます。より短い曝露が必要な場合は、まずオルガノイドを細胞外マトリックスから除去し、1.5 mLチューブを使用して懸濁液中のTNFαに曝露する必要があります。腸オルガノイドをTNFαで48時間処理すると、通常、炎症誘発性マーカー(TNFα、IL1B、IL8、IL23)の発現が誘導され、腸管上皮マーカー(LGR5、VIL)の発現に悪影響を及ぼします(図6)。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">内胚葉基底培地</td>
			<td>50 mLの</td>
		</tr><tr><td colspan="2">RPMIの1640</td>
			<td>48.5 mLの</td>
		</tr><tr><td colspan="2">B27サプリメント</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1%NEAAの</td>
			<td>0.5 mLの</td>
		</tr></tbody></table>表1:内胚葉分化のための内胚葉基礎培地の組成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">腸基底培地</td>
			<td>50 mLの</td>
		</tr><tr><td colspan="2">高度なDMEM/F12</td>
			<td>46.5 mLの</td>
		</tr><tr><td colspan="2">HEPESバッファー</td>
			<td>0.5 mLの</td>
		</tr><tr><td colspan="2">GlutaMAXの</td>
			<td>0.5 mLの</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ニコチンアミド</td>
			<td>0.5 mLの</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2サプリメント</td>
			<td>0.5 mLの</td>
		</tr><tr><td colspan="2">B27サプリメント</td>
			<td>1.0 mLの</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ペン/連鎖球菌</td>
			<td>0.5 mLの</td>
		</tr></tbody></table>表2:腸管オルガノイド培養のための腸基礎培地の組成
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig01.jpg"> 図1:最終内胚葉を介したiPS細胞から後腸系統への分化中の形態学的変化。 (A)腸分化プロトコルの概略図。このヒトiPS細胞株は、核と細胞質の比率が高い小さな細胞の緩いコロニーを形成します。分化が進むにつれて、細胞は上皮から間葉系表現型への移行と一致する変化を受け、DE D3によって均一な単層を形成します。適切なシグナルが送達されると、DE細胞は伸長し、HD D3とすぐに3Dスフェロイドが出現する、より高密度に充填された単層を形成しますが、これは使用する細胞株に依存し、3D培養への移行の要件ではありません(B)。スケールバー:100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig02.jpg"> 図2:ヒトiPS細胞からHG内胚葉への分化は、内胚葉遺伝子の発現を誘導する。 最終内胚葉に分化したヒトiPS細胞の免疫染色は、タンパク質レベルでのTFの発現変化を示します。多能性マーカー(NANOGおよびOCT4)は、DE D3(A)によってダウンレギュレーションされます。中胚葉マーカーBRA(T)の発現はプロトコルのD1に存在し(B)、DE特異的TFであるSOX17およびFOXA2はD2(BおよびC)に現れる。スケールバー:200mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig03v2.jpg"> 図3:iPS細胞から後腸内胚葉(HG)への分化中のqPCRによる遺伝子発現の変化。 多能性に関連する遺伝子はダウンレギュレーションされ(OCT4、NANOG、SOX2)、続いて中胚葉遺伝子(T、EOMES、MIXL1)の一過性発現、最後にDE遺伝子(SOX17、FOXA2、CXCR4)および後腸遺伝子(CDX2、GATA4、HNF4a)の発現が続きます。データは平均±SDで表されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig03largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig04.jpg"> 図4:HG内胚葉は自己組織化して、3D細胞外マトリックス培養で3D腸オルガノイドを形成します。 HG内胚葉は、適切な3D細胞外マトリックス培養物に移され、最初に細胞の小さな固体塊を形成します(A)。HG内胚葉の塊は、7〜10日間の培養で拡大し(B)、その後非対称になり、より複雑な上皮を形成し始め(C)、最終的には明確な上皮形態とオルガノイドの中心に向き合った管腔表面を持つオルガノイド(D)を生じます。スケールバー = 50 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig05.jpg"> 図5:確立されたiPS細胞由来の腸管オルガノイドは、腸管マーカーを発現します。 CDX2とVillinの発現を示す免疫細胞化学。スケールバー = 100 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig06v2.jpg"> 図6:健康な腸オルガノイドの炎症プロファイルと腸細胞発現に対するTNFαの影響。 TNFα (40 ng/mL) による 48 時間治療後の健康な結腸オルガノイドの炎症プロファイル。炎症誘発性マーカー(TNFα、IL-8、IL-23)の発現は、TNFαへの曝露後に増加し、同時に腸管上皮マーカー(LGR5、VIL)の発現がダウンレギュレーションされます。統計解析は、両側スチューデントのt検定によって行われました。データは、各グループの平均±SDとして表されます。*P < .01;**P < .001;P < .0001 です。(n=3)です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig06largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

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Generation of hiPSC-Derived Intestinal Organoids for Developmental and Disease Modelling Applications

このプロトコルは腸のオルガノイドに人間の多能性セルの微分を可能にする。プロトコルは決定的な内胚葉、hindgutの内胚葉および次に腸の上皮の人口にセルを分化することによって正常な人間の開発をまねる。これにより、このプロトコルは、腸の発達と疾患モデリングアプリケーションの両方の研究に適しています。

iPS細胞由来腸オルガノイドの作製による発生・疾患モデリングへの応用

hiPSC-derived intestinal organoids are epithelial structures that self-assemble from differentiated cells into complex 3D structures, representative of ...

この方法では、最終内胚葉、後腸上皮、そして最後に3D培養条件への移行に分化することにより、ヒト誘導多能性幹細胞由来腸オルガノイドを生成する方法を段階的に説明します。ヒト人工多能性幹細胞由来の腸管オルガノイドから得られた結果は、単細胞培養のデータよりも優れた翻訳可能性を示すと同時に、長期培養が困難な初代組織由来オルガノイドよりも実用的です。分化したiPS細胞からヒト腸細胞を作製したら、5 mmリットルの血清ピペットを使用して、6ウェルプレートの各ウェルから細胞単層を剥離します。そして、遠心分離のために細胞を15ミリリットルのチューブにプールします。成長因子を添加した腸内増殖培地にペレットを再懸濁します。そして、播種するウェルの数に応じて、適切な量の細胞外マトリックスを添加します。30マイクロリットルの細胞懸濁液を、48ウェルプレートの適切な数のウェルの中央に加えます。ECMをウェルの中央に配置することは、そのサンプルの長期的な安定性にとって非常に重要です。ECMがウェルの壁に接触すると、ウェルが崩壊し、サンプルが失われる可能性があります。プレートを細胞培養インキュベーターに少なくとも5分間置きます。細胞外マトリックスが固まったら、成長因子を添加した300マイクロリットルの新鮮な腸内増殖培地を各ウェルに加え、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。48時間後、光学顕微鏡を使用して、オルガノイド形成についてウェルをチェックします。7日間の培養後、培地を吸引し、氷冷したDPBSと交換します。5ミリリットルの血清ピペットを使用して、オルガノイドと細胞外マトリックス球体をプレートから機械的に剥離します。次に、オルガノイドを1本の15ミリリットルの遠心チューブにプールします。遠心分離によりオルガノイドを回収し、上清を目に見えるECM層の上部まで吸引します。ペレットを15ミリリットルの氷冷DPBSに再懸濁し、細胞を再度遠心分離します。上記のように上清を吸引した後、ペレットを1ミリリットルの氷冷PBSに再懸濁し、P200ピペットを使用して無傷のオルガノイドを手動で破砕します。オルガノイドの完全な解離を確認します。解離したオルガノイドをスピンし、必要な量の細胞外マトリックスに再懸濁してから、新しい48ウェルプレートに播種します。次に、プレートをインキュベーターに5分間戻します。5分後、プレートをインキュベーターから取り出し、成長因子とROCK阻害剤を含む腸の基礎培地を追加します。2〜4日ごとにメディアを交換してください。腸オルガノイドで炎症反応を引き起こすには、オルガノイド培養の各ウェルの上清を、300マイクロリットルの新しく調製した基礎培地に40ナノグラム/ミリリットルのTNFアルファを添加したものに置き換えます。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに48時間戻し、炎症誘発性環境を再現します。遺伝子発現は、0日目に高発現し、決定的な内胚葉分化の過程で急速にダウンレギュレーションされる多能性マーカーを使用して、ヒトIPSC分化の過程でモニターできます。分化の2日目に、決定的な内胚葉遺伝子が発現し始め、発現は3日目にピークに達するはずです。後腸の指定中に、CDX2およびHNF4αの発現が誘導され、時間の経過とともに増加する必要があります。2D細胞シートの転写から48時間後、細胞シートは、最初は小さいが、次の7〜10日間の培養で徐々にサイズと複雑さが増す、より圧縮された3Dスフェロイド構造に自動組織化し始めるはずです。オルガノイドは、明らかな上皮と内腔が構造の中心を向いた明確なオルガノイドスフェロイド形態を達成するまで継代しないでください。構造がこの段階に達すると、免疫細胞化学を行って、ビリンやCDX2などの腸マーカーの発現を確認できます。炎症をモデル化するために、TNFアルファを組織培養培地に24〜48時間添加することができ、その結果、通常、腸上皮マーカーのダウンレギュレーションと連動して炎症誘発性マーカーが発現します。ヒト人工多能性幹細胞由来腸オルガノイドは、創薬、疾患モデリング、遺伝子編集、腫瘍微小環境の研究、トランスクリプトームおよびプロテオミクス、およびあらゆる疾患のエピジェネティックプロファイルに使用できます。この方法は、多くの研究室が腸管オルガノイドをモデルシステムとして確立するのに役立ち、研究のための新たな方法を提供します。

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