Name: generation of hipsc-derived intestinal organoids for developmental and disease modelling applications
Uploaded: 2024-03-08T12:30:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of hiPSC-Derived Intestinal Organoids for Developmental and Disease Modelling Applications at JoVE.com

NH финансируется MRC (MR/S009930/1) и Wellcome Trust (204267/Z/16/Z), PD финансируется MRC PhD DTP, KLF финансируется BBSRC iCASE.

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Rashid, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+metabolic+disorders+of+the+liver+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 3127-3136 (2010).</li><li>Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin/Nodal+and+FGF+pathways+cooperate+to+maintain+pluripotency+of+human+embryonic+stem+cells.">Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 4495-4509 (2005).</li><li>Jaremko, K. L., Marikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+developmental+competence+and+commitment+towards+the+definitive+endoderm+lineage+in+human+embryonic+stem+cells.">Regulation of developmental competence and commitment towards the definitive endoderm lineage in human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 10, 489-502 (2013).</li><li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+with+Intestinal+Organoids+Derived+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Interaction of Salmonella enterica Serovar Typhimurium with Intestinal Organoids Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Infection and Immunity. 83, 2926-2934 (2015).</li><li>Hannan, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multipotent+foregut+stem+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of multipotent foregut stem cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 1, 293-306 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>de Souza, H. S., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathogenesis+of+IBD:+current+state+of+the+art.">Immunopathogenesis of IBD: current state of the art.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13, 13-27 (2016).</li><li>Tripathi, K., Feuerstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+ulcerative+colitis:+latest+evidence+on+management,+treatment,+and+maintenance.">New developments in ulcerative colitis: latest evidence on management, treatment, and maintenance.</a> Drugs in Context. 8, 212572 (2019).</li><li>Ganesh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rectal+cancer+organoid+platform+to+study+individual+responses+to+chemoradiation.">A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation.</a> Nature Medicine. 25, 1607-1614 (2019).</li><li>Fair, K. L., Colquhoun, J., Hannan, N. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+for+modelling+intestinal+development+and+disease.">Intestinal organoids for modelling intestinal development and disease.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373, (2018).</li><li>Cuevas-Oca&#241;a, S., Yang, J. Y., Aushev, M., Schlossmacher, G., Bear, C. E., Hannan, N. R. F., Perkins, N. D., Rossant, J., Wong, A. P., Gray, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cell-+Based+Optimised+Approach+for+Rapid+and+Efficient+Gene+Editing+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">A Cell- Based Optimised Approach for Rapid and Efficient Gene Editing of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Int. J. Mol. Sci. 24, 10266 (2023).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Expansion+of+Epithelial+Organoids+From+Human+Colon,+Adenoma,+Adenocarcinoma,+and+Barrett's+Epithelium.">Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Giacalone, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-Based+Genome+Editing+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">CRISPR-Cas9-Based Genome Editing of Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 44, 1-22 (2018).</li><li>Bruntraeger, M., Byrne, M., Long, K., Bassett, A. R., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CRISPR Gene Editing: Methods and Protocols. , 153-183 (2019).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Здесь мы опишем протокол дифференцировки плюрипотентных клеток человека в органоиды кишечника человека. Мы демонстрируем их использование для изучения воспаления; тем не менее, это может быть применено к различным контекстам и в сочетании с подходами редактирования генов CRISPR/Cas914 на любом генетическом фоне. После дифференцировки, следуя естественной последовательности развития дефинитивной энтодермы, энтодермы задней кишки, а затем кишечного эпителия, полученные органоиды можно непрерывно культивировать и пассировать в течение более 12 месяцев.
Критическим аспектом этого протокола является начальная плотность покрытия недифференцированных стволовых клеток до дифференцировки энтодермы. Если это не оптимизировано в достаточной степени, клетки, скорее всего, погибнут на начальном этапе дифференцировки ДЭ (если клетки слишком разрежены) или снизят эффективность дифференцировки ДЭ (если клетки слишком плотные). Правильная начальная плотность должна быть оптимизирована для используемой клеточной линии, и правильная плотность должна привести к образованию монослоя к концу DE D3. Для определения эффективности спецификации ДЭ следует использовать проточную цитометрию, и мы обычно видим, что >80% клеток положительны на SOX17 и/или CXCR4. Когда количество SOX17-положительных клеток составляет менее 60%, это влияет на эффективность паттерна HG, что приводит к образованию меньшего количества органоидов при переносе во внеклеточный матрикс. Это, в конечном счете, приведет к тому, что полученные органоидные культуры выйдут из строя. Чтобы определить, было ли успешное паттернирование ДЭ в ГГ, мы оцениваем количество CDX2-положительных клеток с помощью проточной цитометрии и, как правило, ожидаем увидеть >80% положительных клеток. Опять же, если количество CDX2-положительных клеток упадет ниже 50%, это окажет неблагоприятное влияние на количество кишечных органоидов, которые образуются при переносе в культуру 3D внеклеточного матрикса.
После переноса 2D монослоев в 3D культуру через 24-48 ч после переноса должны появиться небольшие компактные сферы. Большие листы мертвых клеток могут появляться в зависимости от эффективности дифференцировки используемой клеточной линии. Вместо того, чтобы сразу же пропускать культуры для удаления этих обломков, мы позволяем органоидам полностью сформироваться и развить свою более сложную, складчатую структуру. Ожидание 7-10 дней перед попыткой первого прохождения гарантирует, что в кишечнике присутствует достаточное количество делящихся клеток для образования большого количества новых кишечных органоидов. Любой мусор, который все еще присутствует в культуре, может быть легко удален в процессе пассажа путем медленного вращения диссоциированных смесей органоидов и мусора в пробирке с достаточной скоростью, чтобы гранулировать органоиды, но оставить слой клеток плавающим в среде. Затем среду и клеточный мусор можно отсасывать таким образом, чтобы оставалась только гранула органоидов.
Недостаток этого подхода заключается в том, что типы клеток, полученных из ИПСК, часто не являются полностью зрелыми с точки зрения экспрессии генов и функциональных профилей. Чтобы определить, подходит ли ткань кишечника, полученная из ИПСК, для конкретных применений, органоиды должны быть охарактеризованы для различных типов клеток, включая энтероциты (VIL), энтероэндокринные клетки (neurog3), бокаловидные клетки (MUC2), транзиторные амплифицирующие клетки (CD133), клетки Paneth (FZD5) и стволовые клетки LGR5+ (LGR5) для определения клеточного состава органоидов.
В целом, основное преимущество этого протокола перед многими другими протоколами дифференцировки органоидов заключается в том, что эта культуральная платформа очень экономична за счет замены нескольких рекомбинантных белков и препаратов кондиционированных сред малыми молекулами15,16. Дифференцировка в HG очень проста и быстра и может быть применена как к эмбриональным, так и к индуцированным плюрипотентным стволовым клеткам человека с идентичными результатами. При строгом соблюдении и оптимизации для используемых клеточных линий он обеспечивает относительно простую модельную платформу, свободную от контаминирующих мезенхимальных клеток, которая затем может быть применена для изучения кишечного эпителия в различных контекстах, включая воспаление, взаимодействиепатогенов с хозяином. Моделирование фиброза кишечника может быть исследовано путем предоставления профиброзных стимулов, а затем оценки экспрессии белков внеклеточного матрикса, таких как коллаген, ламинин и фибронектин, с помощью QPCR, вестерн-блоттинга и ИФА. Использование методов редактирования генов CRISPR/Cas9 на недифференцированных линиях стволовых клеток до дифференцировки позволяет создавать органоиды с нокаутом генов или гиперэкспрессией белка, которые могут быть использованы для создания специфических для заболеваний органоидов и более сложных моделей заболеваний 14,17,18.

Свойства плюрипотентных стволовых клеток (ПСК), такие как самообновление и способность дифференцироваться в любой тип клеток человеческого организма, делают их ценными инструментами при изучении развития, патологии заболеванийи тестировании лекарственных препаратов. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) особенно полезны для моделирования заболеваний, поскольку они могут быть получены от пациентов, непосредственно захватывая геном, ответственный за фенотип заболевания 2,3. Такие ИПСК могут быть дифференцированы в тип клеток, пораженных генетическим дефектом, что позволяет тщательно изучить молекулярный механизм заболевания4.
Протоколы дифференцировки ПСК человека направлены на прямую дифференцировку клеток через основные стадии развития путем активации или ингибирования специфических сигнальных путей, определяющих приверженность и спецификацию линии. Поддержание ИПСК в плюрипотентном состоянии требует умеренных уровней передачи сигналов активина А (Акт-А), в то время как высокая доза Акта-А в течение 3 дней обрекает ИПСК на окончательную судьбу энтодермы (ДЭ) 5,6. Пути Act-A и Wnt определяют переднюю-заднюю идентичность ДЭ. Передача сигналов с помощью Act-A индуцирует маркеры передней кишки (FG), такие как HHEX, HNF4α и GATA4, блокируя экспрессию генов задней кишки (HG), таких как CDX2. Передача сигналов Wnt индуцирует постериоризацию DE, которая затем принимает профиль экспрессии гена HG 7,8. После того, как идентичность клеток HG установлена, дифференцировка может быть переведена из 2D в 3D и направлена на формирование кишечных органоидов.
Кишечные органоиды, как правило, культивируются в трехмерном внеклеточном матриксе (например, Matrigel или другие совместимые ECM) на основе системы культивирования9, состоящей из ламинина, коллагена IV и энтактина и обогащенной факторами роста, такими как EGF, FGF, PDGF и IGF-1, чтобы способствовать выживанию и пролиферации. Органоиды культивируются в определенной среде, содержащей гастрин, ноггин и CHIR, для стимуляции и поддержки роста и пролиферации стволовых клеток кишечника во время длительного культивирования.
После того, как эпителиальные клетки кишечника встраиваются во внеклеточный матрикс, кишечные крипты начинают формироваться и расширяться, в конечном итоге образуя сфероиды. Они созревают в органоидные структуры, которые имитируют физиологическое функционирование кишечного эпителия. Органоиды, как правило, могут культивироваться более 1 года без существенной потери функциональных профилей и профилей экспрессии генов. Еженедельно требуется пассаж с использованием ферментативного разложения органоидов на более мелкие фрагменты, которые затем самособираются в полноценные органоиды.
Установленные органоидные линии могут быть использованы в качестве надежной модели многочисленных заболеваний, связанных с кишечником, включая болезнь Крона, язвенный колит и колоректальный рак 10,11,12,13. Эта модель предпочтительна по сравнению с клетками животных, поскольку они экспрессируют человеческие гены, связанные с этими расстройствами, и реагируют на внешние раздражители, более похожие на те, которые происходят в тканях человека in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12 (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12654-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1046-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor reduced Matrigel</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer solution (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9713.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt 3a</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of hipsc-derived intestinal organoids for developmental and disease modelling applications

Кишечные органоиды, полученные из ИПСК, представляют собой эпителиальные структуры, которые самоорганизуются из дифференцированных клеток в сложные 3D-структуры, представляющие кишечный эпителий человека, в которых они демонстрируют криптические/ворсинчатые структуры. В данной работе мы описываем генерацию ИПСК-интестинальных органоидов путем ступенчатой дифференцировки ИПСК в дефинитивную энтодерму, которая затем апостериоризируется с образованием эпителия задней кишки перед переносом в условия 3D-культивирования. Среда для 3D-культивирования состоит из внеклеточного матрикса (ВКМ) (например, Matrigel или другого совместимого ВКМ), дополненного SB202190, A83-01, Gastrin, Noggin, EGF, R-spondin-1 и CHIR99021. Органоиды проходят пассирование каждые 7 дней, где они механически разрушаются перед переносом в свежий внеклеточный матрикс и позволяют им расширяться. КПЦР и иммуноцитохимия подтверждают, что кишечные органоиды, полученные из ИПСК, содержат зрелые типы эпителиальных клеток кишечника, включая бокаловидные клетки, клетки Панета и энтероциты. Кроме того, органоиды демонстрируют признаки поляризации за счет экспрессии ворсинок, локализованных на апикальной поверхности эпителиальных клеток.
Полученные органоиды могут быть использованы для моделирования развития кишечника человека, а также многочисленных кишечных заболеваний человека, включая воспалительные заболевания кишечника. Для моделирования воспаления кишечника органоиды могут подвергаться воздействию медиаторов воспаления, таких как TNF-α, TGF-β и бактериальный LPS. Органоиды, подвергшиеся воздействию провоспалительных цитокинов, демонстрируют воспалительный и фиброзный фенотип в ответ. Сочетание здоровых и ИПСК, полученных от пациентов с ВЗК, может быть полезным для понимания механизмов, вызывающих ВЗК. Это может выявить новые терапевтические мишени и новые биомаркеры, которые помогут в ранней диагностике заболевания.

Схема протокола дифференциации показана на рисунке 1А. В 1-й день протокола ИПСК должны быть компактными и образовывать небольшие колонии с общим слиянием примерно 50-60%. Через 24 часа после индукции дифференцировки в сторону ДЭ клетки начинают мигрировать из колоний стволовых клеток, образуя монослой клеток. Это продолжается в течение последующих 3 дней и должно сформировать полный монослой на D3 дифференцировки ДЭ (рис. 1). Экспрессию генов следует контролировать в ходе дифференцировки с помощью маркеров плюрипотентности (OCT4, NANOG, SOX2), которые высоко экспрессируются на D0 и быстро снижаются во время дифференцировки ДЭ. Во время дифференцировки DE экспрессия T должна достигать максимума на D1, за ней следуют EOMES и MIXL на D2. На D2 гены DE (SOX17, FOXA2, GATA4, CXCR4) должны начать экспрессироваться и достигать пика на D3 (рис. 2 и рис. 3). Клетки должны быть монослоем по DE D3 и затем могут быть апостериоризированы в энтодерму задней кишки. Во время апостериоризации 3D-структуры начнут формироваться уже в D2. Однако иногда они начинают появляться только на D4 или не появляются вовсе; Это не всегда указывает на то, будут ли клетки развиваться и образовывать органоиды кишечника (рис. 1). Во время спецификации HG экспрессия CDX2 и HNF4a должна индуцироваться и увеличиваться с течением времени (рис. 3).
После переноса 2D-листов клеток во внеклеточный матрикс в течение первых 24 ч будут наблюдаться скопления 2D-клеток. Через 48 ч листы клеток должны начать самоорганизовываться в более компактные 3D-сфероидные структуры, которые изначально небольшие (Рисунок 4A), а затем постепенно увеличиваются в размерах и сложности в течение 7-10 дней культивирования (Рисунок 4B и Рисунок 4C). Органоиды не следует пассировать до тех пор, пока они не достигнут четкой морфологии органоида/сфероида с явным эпителием с просветом, обращенным к центру органоида/сфероида (рис. 4D). На этом этапе иммуноцитохимия может быть использована для подтверждения экспрессии кишечных маркеров, таких как ворсинка и CDX2 (рис. 5). Не все скопления 2D-клеток разовьются в органоиды, и во внеклеточном матриксе будут находиться загрязняющие мертвые клетки. Эти мертвые листы клеток следует игнорировать до тех пор, пока выжившие клетки не сформируют крупные органоиды и не будут готовы к прохождению.
Для моделирования воспаления ФНОα можно добавлять в питательную среду тканей на 24-48 ч. После инкубации с провоспалительными молекулами органоиды собирают с использованием той же техники, которая использовалась для их выделения и пассажа, а затем лизируют с помощью совместимого с клеточным буфером приложения, такого как QPCR или вестерн-блоттинг. Если требуется более короткая экспозиция, органоиды следует сначала удалить из внеклеточного матрикса и подвергнуть воздействию TNFα в суспензии с помощью пробирки объемом 1,5 мл. Лечение кишечных органоидов TNFα в течение 48 ч обычно индуцирует экспрессию провоспалительных маркеров (TNFα, IL1B, IL8, IL23), в то же время отрицательно влияя на экспрессию эпителиальных маркеров кишечника (LGR5, VIL) (рис. 6).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Базальная среда энтодермы</td>
			<td>50 мл</td>
		</tr><tr><td colspan="2">РПМИ 1640</td>
			<td>48,5 мл</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Добавка B27</td>
			<td>1 мл</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1% NEAA</td>
			<td>0,5 мл</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 1: Состав энтодермальных базальных сред для дифференцировки энтодермы.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Базальная среда кишечника</td>
			<td>50 мл</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Расширенный DMEM/F12</td>
			<td>46,5 мл</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Буфер HEPES</td>
			<td>0,5 мл</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ГлютаМАКС</td>
			<td>0,5 мл</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Никотинамид</td>
			<td>0,5 мл</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Дополнение N2</td>
			<td>0,5 мл</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Добавка B27</td>
			<td>1,0 мл</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Ручка/стрептококк</td>
			<td>0,5 мл</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 2: Состав кишечных базальных сред для культивирования органоидов кишечника
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig01.jpg"> Рисунок 1: Морфологические изменения при дифференцировке ИПСК через дефинитивную энтодерму в заднюю кишку. (А) Схематический обзор протокола дифференцировки кишечника. Эта клеточная линия ИПСК образует свободные колонии мелких клеток с высоким отношением ядра к цитоплазме. По мере дифференцировки клетки претерпевают изменения, соответствующие переходу от эпителиального к мезенхимальному фенотипу, и к DE D3 образуют однородный монослой. После того, как соответствующие сигналы поступают, клетки ДЭ удлиняются и образуют более плотно упакованный монослой с 3D-сфероидами, появляющимися сразу после HD D3, но это зависит от используемой клеточной линии и не является обязательным требованием для перехода к 3D-культуре (B). Масштабная линейка: 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig02.jpg"> Рисунок 2: Дифференцировка ИПСК в энтодерму HG индуцирует экспрессию генов энтодермы. Иммуноокрашивание ИПСК, дифференцирующееся в дефинитивную энтодерму, показывает изменения экспрессии ТФ на белковом уровне. Маркеры плюрипотентности (NANOG и OCT4) подавляются DE D3 (A). Экспрессия маркера мезендодермы BRA(T) присутствует в D1 протокола (B), а специфические для DE TF SOX17 и FOXA2 появляются на D2 (B и C). Масштабная линейка: 200 мм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig03v2.jpg"> Рисунок 3: Изменения экспрессии генов методом кПЦР при дифференцировке ИПСК в энтодерму задней кишки (ГГ). Гены, связанные с плюрипотентностью, подавляются (OCT4, NANOG, SOX2), за которыми следует транзиторная экспрессия генов мезендодермы (T, EOMES, MIXL1) и, наконец, экспрессия генов DE (SOX17, FOXA2, CXCR4) и генов задней кишки (CDX2, GATA4, HNF4a). Данные представлены в виде среднего значения ±SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig03largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig04.jpg"> Рисунок 4: Энтодерма HG самоорганизуется, образуя 3D кишечные органоиды в 3D культуре внеклеточного матрикса. Энтодерма HG переносится в подходящую культуру 3D внеклеточного матрикса и первоначально образует небольшие твердые скопления клеток (А). Скопления энтодермы HG расширяются в течение 7-10 дней культивирования (B), а затем становятся асимметричными и начинают образовывать более сложный эпителий (C), в конечном итоге давая начало органоидам с четкой морфологией эпителия и просветной поверхностью, обращенной к центру органоида (D). Масштабные линейки = 50 мкм <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig05.jpg"> Рисунок 5: Установленные кишечные органоиды, полученные из ИПСК, экспрессируют кишечные маркеры. Иммуноцитохимия, показывающая экспрессию CDX2 и Виллина. Масштабные линейки = 100 мкм <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig06v2.jpg"> Рисунок 6: Влияние ФНОα на воспалительный профиль и экспрессию здоровых кишечных органоидов в клетках кишечника. Воспалительный профиль здоровых органоидов толстой кишки после 48-часового лечения ФНОα (40 нг/мл). Экспрессия провоспалительных маркеров (ФНОα, ИЛ-8 и ИЛ-23) увеличивается после воздействия ФНОα, в то время как экспрессия маркеров кишечного эпителия (LGR5, VIL) снижается. Статистический анализ проводили с помощью двустороннего t-критерия Стьюдента. Данные выражаются в виде среднего ± SD каждой группы. *P < .01; **P < .001; С. < .0001. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig06largev2.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of hiPSC-Derived Intestinal Organoids for Developmental and Disease Modelling Applications at JoVE.com

Generation of hiPSC-Derived Intestinal Organoids for Developmental and Disease Modelling Applications

Этот протокол позволяет дифференцировать плюрипотентные клетки человека в органоиды кишечника. Протокол имитирует нормальное развитие человека путем дифференцировки клеток в популяцию окончательной энтодермы, энтодермы задней кишки, а затем эпителия кишечника. Это делает протокол подходящим как для изучения развития кишечника, так и для моделирования заболеваний.

Генерация кишечных органоидов, полученных из ИПСК, для моделирования развития и заболеваний

hiPSC-derived intestinal organoids are epithelial structures that self-assemble from differentiated cells into complex 3D structures, representative of ...

Этот метод предоставляет пошаговые инструкции о том, как получить индуцированные человеком плюрипотентные органоиды кишечника путем дифференцировки в дефинитивную энтодерму, затем эпителий задней кишки и, наконец, перенос в условия 3D-культивирования. Результаты, полученные с помощью индуцированных человеком плюрипотентных органоидов кишечника, полученных из стволовых клеток, демонстрируют большую переводимость, чем данные из одноклеточных культур, а также являются более практичными, чем первичные органоиды тканевого происхождения, которые может быть трудно хранить в культуре в течение длительного времени. После получения клеток кишечника человека из дифференцированных ИПСК используйте серологическую пипетку объемом 5 миллилитров, чтобы отделить клеточный монослой от каждой лунки 6-луночного планшета.И объедините клетки в одну пробирку объемом 15 миллилитров для центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в питательной среде кишечника, добавив факторы роста. И добавьте соответствующий объем внеклеточного матрикса в соответствии с количеством лунок, которые покрываются.Добавьте 30 микролитров клеточной суспензии в центр соответствующего количества лунок 48-луночной пластины. Обеспечение того, чтобы ECM был размещен в центре лунки, очень важно для долгосрочной стабильности этого образца. Если ECM коснется стенки скважины, она может разрушиться и образцы могут быть потеряны.Поместите планшет в инкубатор клеточных культур минимум на 5 минут. Когда внеклеточный матрикс схватится, добавьте в каждую лунку по 300 микролитров свежей кишечной питательной среды, дополненной факторами роста, и верните планшет в инкубатор клеточной культуры. Через 48 часов с помощью светового микроскопа проверьте лунки на наличие органоидов.После 7 дней культивирования аспирируйте питательную среду и замените ее ледяной DPBS. Используйте серологическую пипетку объемом 5 миллилитров, чтобы механически отделить органоиды и сферу внеклеточного матрикса от планшета. Затем соберите органоиды в одну центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.Соберите органоиды центрифугированием и аспирируйте надосадочную жидкость до верхней части видимого слоя ECM. Повторно суспендируйте гранулу в 15 миллилитрах ледяного DPBS и снова центрифугируйте ячейки. После аспирации надосадочной жидкости, как показано на рисунке, повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре ледяного PBS и используйте пипетку P200 для ручного разрушения неповрежденных органоидов.Подтверждают полную диссоциацию органоидов. Раскрутите диссоциированные органоиды и повторно суспендируйте в необходимом объеме внеклеточного матрикса перед нанесением на новую 48-луночную пластину, как показано на рисунке. Затем верните тарелку в инкубатор на 5 минут.Через 5 минут извлеките планшет из инкубатора и добавьте в кишечник базальную среду с факторами роста и ингибитором ROCK. Меняйте носитель каждые 2-4 дня. Чтобы вызвать воспалительную реакцию в органоидах кишечника, замените надосадочную жидкость в каждой лунке органоидной культуры 300 микролитрами свежеприготовленной базальной среды с добавлением 40 нанограммов на миллилитр TNF альфа.Затем верните планшет в инкубатор клеточных культур на 48 часов, чтобы воспроизвести провоспалительную среду. Экспрессию генов можно отслеживать в ходе дифференцировки IPSC человека с помощью маркеров плюрипотентности, которые высоко экспрессируются на 0-й день и быстро снижаются в процессе окончательной дифференцировки энтодермы. На 2-й день дифференцировки должны начать экспрессироваться дефинитивные гены энтодермы, а пик экспрессии должен быть достигнут на 3-й день.Во время спецификации заднего кишечника экспрессия CDX2 и HNF4alpha должна индуцироваться и увеличиваться с течением времени. Через 48 часов после переноса 2D-листов клеток листы клеток должны начать самоорганизовываться в более компактные 3D-сфероидные структуры, которые изначально небольшие, но постепенно увеличиваются в размерах и сложности в течение следующих 7-10 дней культивирования. Органоиды не следует пассировать до тех пор, пока они не достигнут четкой морфологии сфероида органоида с явным эпителием и просветом, обращенным к центру структуры.Когда структуры достигают этой стадии, может быть проведена иммуноцитохимия для подтверждения экспрессии кишечных маркеров, таких как виллин и CDX2. Для моделирования воспаления TNF альфа может быть добавлен в культуральную среду тканей в течение 24-48 часов, что обычно приводит к экспрессии провоспалительных маркеров в сочетании с подавлением эпителиальных маркеров кишечника. Индуцированные человеком плюрипотентные органоиды кишечника, полученные из стволовых клеток, могут быть использованы для разработки лекарств, моделирования заболеваний, редактирования генов, изучения микроокружения опухоли, а также транскриптомного, протеомного и эпигенетического профиля любого интересующего заболевания.Этот метод может помочь многим лабораториям установить кишечные органоиды в качестве модельной системы, предоставляя им дополнительный метод для их исследований.

Without Section

Research

JoVE Journal

Biology

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

Windowing куриные яйца целях развития исследований

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Absolute Quantum Yield Measurement of Powder Samples

Абсолютный квантовый выход Измерение порошковых проб

Measurement of fluorescence quantum yield has become an important tool in the search for new solutions in the development, evaluation, quality control and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Протокол Lentiviral трансдукции и вниз по течению анализа заболеваемости кишечными органоиды

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Мыши модель частичной непроходимостью кишечника

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Fabrication of Amyloid-ÃƒÅ½Ã‚Â²-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

Изготовление амилоидных микробусов для использования в моделировании болезни Альцгеймера

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Мукоцилиальные эпителиальные органоиды из эмбриональных клеток Ксенопы: Поколение, Культура и живая визуализация высокого разрешения

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D Культивирование органоидов из эпителия ворсинок кишечника, подвергающихся дедифференциации

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

Генерация мышиных первичных эпителиальных монослоев толстой кишки из кишечных крипт

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Количественный анализ скорости роста Aspergillus nidulans с использованием живой микроскопии и программного обеспечения с открытым исходным кодом

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...