Name: generation of hipsc-derived intestinal organoids for developmental and disease modelling applications
Uploaded: 2024-03-08T12:30:00
Duration: 6 min 34 s
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NH está financiado por el MRC (MR/S009930/1) y el Wellcome Trust (204267/Z/16/Z), el PD está financiado por el MRC PhD DTP, el KLF está financiado por el BBSRC iCASE.

NOTA: Todos los trabajos de cultivo de tejidos que se detallan a continuación deben realizarse en una campana de flujo laminar de Clase II.
1. Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) en el endodermo del intestino posterior
<ol li=""><li>Para recubrir un matraz de cultivo celular con matriz extracelular, primero calcule la cantidad de matriz necesaria. Aquí hay un ejemplo de una placa de 12 pocillos recubierta con Matrigel. Calcule la cantidad requerida de matriz extracelular para recubrir una placa de 12 pocillos. Utilice la siguiente fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61199/61199equ01.jpg"> NOTA: Cubra las placas de cultivo celular con la matriz extracelular de su elección. Si usa Matrigel, use una concentración de 0,035 mg/cm2 24 h antes de la siembra para la diferenciación. Verifique la concentración del lote de matriz extracelular en la hoja del producto y prepare alícuotas más pequeñas antes de los experimentos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Diluir la cantidad requerida de matriz extracelular en medios DMEM fríos utilizando una pipeta p1000.</li>
	<li>Mezcle bien con una tira de 5 ml.</li>
	<li>Agregue 500 μL de matriz diluida a cada placa de pocillos. Agitar suavemente la placa para distribuir uniformemente la matriz extracelular diluida e incubar durante un mínimo de 12 h a 37 °C.</li>
	<li>Antes de sembrar las células en la placa, lave cada pocillo con 500 μL de PBS para eliminar el exceso de matriz extracelular. Esto evitará el desprendimiento celular durante la diferenciación.</li>
	<li>Dejar el último lavado en los pocillos hasta que esté listo para sembrar para evitar que se seque la matriz extracelular.</li>
	<li>Para sembrar la diferenciación de las hiPSC hacia el endodermo definitivo (DE) o el intestino posterior (HG), se toma un matraz de hiPSCs cultivadas en un medio de mantenimiento de elección (p. ej., 8 medios esenciales) y se aspira el medio. (Aquí, sembramos células a 25.000 células/cm2). NOTA: La densidad de siembra es crucial para una diferenciación exitosa y debe optimizarse para cada línea celular hiPSC individual.</li>
	<li>Lavar las células del matraz con 5 ml de PBS. Aspire el PBS.</li>
	<li>Añadir 2,5 ml de solución de disociación celular (p. ej., TrypLE) y dejar actuar a temperatura media durante 4 min. Aspire la solución de disociación celular y golpee suavemente el matraz para separar las células.</li>
	<li>Lave el matraz con 5 ml de medios DMEM calentados a 37 °C y recoja todas las células en un tubo de 15 ml.</li>
	<li>Tome 10 μL de solución celular resuspendida y mida la densidad celular con un hemocitómetro.</li>
	<li>Tome suficiente suspensión celular para recolectar 1.05 x 106 células y colóquelas en un tubo de 15 ml.</li>
	<li>Girar a 160 x g durante 3 min. Mientras se centrifugan las células, aspire PBS de la placa de 12 pocillos recubierta de matriz extracelular.</li>
	<li>Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspender el gránulo celular en 12 ml de medio de mantenimiento con inhibidor de ROCK (10 μM).</li>
	<li>Con una pipeta p1000, agregue 1 ml de suspensión celular a cada pocillo de la placa de 12 pocillos. Vuelva a suspender las células para asegurar una distribución equitativa entre los pocillos.</li>
	<li>Agite la placa suavemente para distribuir las células dentro de los pocillos de la placa, pero evite que el medio se arremoline, ya que concentrará las células en el medio de los pocillos.</li>
	<li>Colocar en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 .</li>
	<li>Cambie los medios a medios de mantenimiento (p. ej., 8 medios esenciales) solo (sin inhibidor de ROCK) 24 h después de la siembra.</li>
	<li>Para comenzar la diferenciación a DE, prepare el endodermo basal medio de acuerdo con la Tabla 1. NOTA: Al inicio de la diferenciación, las células deben estar entre el 60-80% de confluencia.</li>
	<li>Prepare 12 mL de medio DE agregando Activina A (100 ng/mL) y Wnt3 (50 ng/mL) al medio basal del endodermo.</li>
	<li>Calentar el medio a 37 °C.</li>
	<li>Aspire los medios de cada pocillo de la placa o matraz de cultivo de tejidos.</li>
	<li>Comience la diferenciación de DE agregando 1 ml de medio DE a cada pocillo de la placa de 12 pocillos.</li>
	<li>A las 24 h después de iniciar la diferenciación de DE (D1 DE), prepare nuevos medios de DE y realice el cambio de medios.</li>
	<li>Repita el paso 1.24 a las 48 h (D2 DE). Si hay mucha muerte celular en esta etapa, lave todos los pocillos con 500 μL de PBS antes de cambiar el medio. NOTA: Para confirmar la diferenciación exitosa del endodermo, realice una citometría de flujo para evaluar la expresión de SOX17. Normalmente esperamos que el >80% de las células sean positivas para SOX17 en D3 DE. Si la expresión de SOX17 no es óptima, se debe optimizar la densidad de siembra celular, así como las concentraciones de Act-A.</li>
	<li>Inicie la diferenciación HG en este punto, es decir, 72 h después del inicio de la diferenciación DE. Prepare 12 mL de medio HG agregando CHIR99021 (3 μM) y AR (1 μM) al medio basal del endodermo (Tabla 1). NOTA: En D3 DE, la célula debería haber formado una monocapa uniforme. La diferenciación óptima de la DE es crucial para las etapas posteriores de la diferenciación.</li>
	<li>Aspirar medios DE.</li>
	<li>Comience la diferenciación de HG agregando 1 ml de medio HG a cada pocillo de la placa de 12 pocillos.</li>
	<li>Continúe la diferenciación durante 4 días con cambios diarios de medios. NOTA: Para determinar el éxito de la posteriorización de DE, realice una citometría de flujo para evaluar la expresión de CDX2. Para la diferenciación D4 de HG, normalmente esperamos que el >80% de las células sean positivas para CDX2. Si la posteriorización no es óptima, se debe optimizar la concentración de CHIR99021.</li>
	<li>Para recolectar una muestra para la extracción de ARN, aspire el medio de diferenciación y lave el pocillo con 500 ul de PBS.</li>
	<li>Aspire PBS y agregue un volumen adecuado de tampón de lisis celular de un kit de extracción de ARN.</li>
	<li>Con una pipeta p1000, raspe el fondo del pocillo para asegurar la lisis de todas las células.</li>
	<li>Aspire el lisado celular y colóquelo en un tubo limpio.</li>
	<li>Proceda a la extracción de ARN o congele el lisado a -20 °C hasta que esté listo para la extracción de ARN.</li>
	<li>Para la inmunotinción, aspire los medios de diferenciación y lave los pocillos con 500 μL de PBS.</li>
	<li>Aspirar el PBS y añadir 500 μL de PFA al 4%. NOTA: El PFA es tóxico. Use el equipo de protección personal adecuado y siga los procedimientos de laboratorio locales para la eliminación de PFA.</li>
	<li>Incubar a 4 °C durante 20 min.</li>
	<li>Retire el PFA y lave los pocillos con 500 μL de PBS tres veces.</li>
	<li>Deje el último lavado de PBS en las células hasta que esté listo para realizar la inmunotinción.</li>
</ol>2. Pasaje de organoides intestinales
<ol><li>Preparar los medios basales intestinales de acuerdo con la Tabla 2.</li>
	<li>Para transferir de un cultivo celular 2D a uno 3D, utilice una placa de 6 pocillos para generar células DE a partir de hiPSCS. Separe la monocapa de células de la placa de 6 células con una tira de 5 ml.</li>
	<li>Recoja las células en un tubo de centrífuga de 15 ml, antes de centrifugar a 400 x g durante 1 minuto para producir un gránulo de celdas.</li>
	<li>Resuspender el gránulo celular en medios de crecimiento intestinal que contengan factores de crecimiento: SB202190 (10 μM), A83-01 (500 nM), Gastrin (10 nM), Noggin (100 ng/μL), EGF (500 ng/μL), R-Spondin1 (100 ng/mL), CHIR99021 (6 μM), inhibidor de ROCK (10 μM).</li>
	<li>Agregue el volumen apropiado de matriz extracelular dependiendo del número de pocillos en los que se siembra. Esto se puede calcular utilizando las siguientes ecuaciones. [1] Volumen total de matriz/medio extracelular (μL) = 30 μL * número de pocillos de placa de 48 pocillos [2] Volumen requerido de matriz extracelular (μL) = Respuesta de [1] * 2/3 [3] Volumen requerido de medios (μL) = Respuesta de [1] * 1/3</li>
	<li>Agregue 30 μL de suspensión celular al centro de cada pocillo de una placa de 48 pocillos.</li>
	<li>Incubar la placa en una incubadora a 37 °C durante un mínimo de 5 minutos para permitir que la matriz extracelular se asiente.</li>
	<li>Una vez que las cúpulas de la matriz extracelular se hayan fraguado, agregue 300 μL de medio de crecimiento intestinal que contenga todos los factores de crecimiento a cada pocillo.</li>
	<li>Regrese la placa a una incubadora a 37 °C con 5% de CO2. NOTA: Si después de 48 h no se pueden observar organoides y/o hay muerte celular significativa, es posible que sea necesario optimizar las concentraciones de ROCKi y NOGGIN.</li>
	<li>Para pasar los organoides, observe las células bajo un microscopio óptico para evaluar la densidad y el tamaño de los organoides y determinar si necesitan paso.</li>
	<li>Reemplace los medios de cultivo celular con PBS helado. NOTA: Los cultivos de organoides deberán dividirse aproximadamente cada 5-7 días. El paso de los cultivos de organoides intestinales es necesario una vez que hay una acumulación de restos celulares evidentes dentro de la luz del organoide y un color amarillento del medio de crecimiento intestinal circundante.</li>
	<li>Separe mecánicamente los organoides y la esfera de la matriz extracelular de la placa mediante un movimiento de raspado con una tira de 5 ml.</li>
	<li>Recoja los organoides de cada pocillo en un tubo de centrífuga de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión de organoides a 400 x g durante 1 min para granular los organoides. Aspirar el sobrenadante hasta llegar a la parte superior del gránulo celular, teniendo cuidado al haber alcanzado la capa visible de la matriz extracelular.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en 15 ml de PBS helado. NOTA: Este paso sirve para lavar cualquier matriz extracelular restante que no se haya eliminado en el centrifugado inicial.</li>
	<li>Centrifugar a 400 x g durante 1 min. Aspire el medio hasta el gránulo que contiene los organoides.</li>
	<li>Vuelva a suspender en 1 ml de PBS helado. Con una pipeta p200, interrumpa manualmente los organoides intactos pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. NOTA: Observe el tamaño de los organoides con un microscopio óptico para determinar si es necesario disociarlos aún más.</li>
	<li>Agregue 9 ml de medio sin factores de crecimiento.</li>
	<li>Centrifugar a 400 x g durante 1 min. Aspirar el sobrenadante hasta que los organoides se desboleen.</li>
	<li>Calcule la cantidad requerida de matriz extracelular y medios utilizando las siguientes ecuaciones: [1] Volumen total de matriz/medio extracelular (μL) = 30 μL * número de pocillos de placa de 48 pocillos [2] Volumen requerido de matriz extracelular (μL) = Respuesta de [1] * 2/3 [3] Volumen requerido de medios (μL) = Respuesta de [1] * 1/3</li>
	<li>Vuelva a suspender el gránulo de organoide en el volumen calculado de medios intestinales con factores de crecimiento (incluidos los inhibidores de Noggin y ROCK).</li>
	<li>Agregue el volumen requerido de matriz extracelular a esta suspensión celular y vuelva a suspender para asegurar una distribución uniforme de los organoides.</li>
	<li>Pipetear 30 μL de esta suspensión en el centro de cada pocillo de una placa de 48 pocillos (preferiblemente precalentada en una incubadora a 37 °C).</li>
	<li>Regrese la placa a una incubadora a 37 °C durante 5 minutos hasta que la matriz extracelular se haya endurecido.</li>
	<li>Prepare medios intestinales con factores de crecimiento (+ inhibidor de ROCK) (aproximadamente 17 ml por placa de 48 pocillos).</li>
	<li>Agregue 300 μL a cada pocillo.</li>
	<li>Incubar a 37 °C con 5% de CO2.</li>
	<li>Después del paso, aspire el medio para los organoides intestinales y reemplácelo con un medio intestinal fresco con factores de crecimiento (sin inhibidor de Noggin y ROCK) cada 2-4 días. NOTA: Si después de 48 horas no se pueden observar organoides y/o hay muerte celular significativa, es posible que sea necesario optimizar las concentraciones de ROCKi y NOGGIN. NOTA: Los organoides intestinales responden a una serie de mediadores inflamatorios in vivo. El TNFα es una proteína de señalización celular implicada en varios procesos inflamatorios.</li>
	<li>Para desencadenar una respuesta inflamatoria en los organoides intestinales, prepare TNFα a una concentración de 40 ng/ml solo en medios basales.</li>
	<li>Aspire medios de placa de 48 pocillos.</li>
	<li>Añadir 300 μL de medio basal preparado que contenga 40 ng/mL de TNFα.</li>
	<li>Incubar la placa a 37 °C durante 48 horas para replicar un entorno proinflamatorio. NOTA: Los organoides intestinales responden a una serie de mediadores inflamatorios in vivo. El TNFα es una proteína de señalización celular implicada en varios procesos inflamatorios.</li>
	<li>Deseche las células restantes por aspiración en una trampa de vacío que contenga Trigene al 5%.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, describimos un protocolo para la diferenciación de células pluripotentes humanas en organoides intestinales humanos. Demostramos su uso para estudiar la inflamación; sin embargo, esto se puede aplicar a varios contextos y, junto con los enfoques de edición genética CRISPR/Cas914, en cualquier contexto genético. Una vez diferenciados, siguiendo la secuencia natural de diferenciación del desarrollo del endodermo definitivo, el endodermo del intestino posterior y luego el epitelio intestinal, los organoides resultantes pueden cultivarse y transitarse continuamente durante más de 12 meses.
Un aspecto crítico de este protocolo es la densidad inicial de siembra de células madre indiferenciadas antes de la diferenciación del endodermo. Si esto no se optimiza lo suficiente, es probable que las células mueran durante el paso inicial de diferenciación de DE (si las células son demasiado escasas) o reduzcan la eficiencia de la diferenciación de DE (si las células son demasiado densas). La densidad inicial correcta debe optimizarse para la línea celular que se está utilizando, y la densidad correcta debe generar una monocapa al final de DE D3. La citometría de flujo debe utilizarse para determinar la eficiencia de la especificación de DE y, por lo general, vemos que el >80% de las células son positivas para SOX17 y/o CXCR4. Cuando el número de células positivas para SOX17 es inferior al 60%, la eficiencia del patrón de HG se ve afectada, lo que da como resultado que se formen menos organoides cuando se transfieren a la matriz extracelular. En última instancia, esto hará que los cultivos de organoides resultantes fallen. Para determinar si el patrón de DE a HG ha sido exitoso, evaluamos el número de células positivas para CDX2 mediante citometría de flujo y, por lo general, esperamos ver >80% de células positivas. De nuevo, si el número de células positivas para CDX2 cae por debajo del 50%, esto tendrá un efecto adverso en el número de organoides intestinales que se generan cuando se transfieren al cultivo de matriz extracelular en 3D.
Después de la transferencia de monocapas 2D al cultivo 3D, deberían aparecer pequeñas esferas compactas 24-48 h después de la transferencia. Pueden aparecer grandes láminas de células muertas dependiendo de la eficiencia de diferenciación de la línea celular utilizada. En lugar de pasar inmediatamente los cultivos para eliminar estos desechos, permitimos que los organoides se formen y desarrollen completamente su estructura más compleja y plegada. Esperar de 7 a 10 días antes de intentar el primer paso asegura que haya suficientes células en división para generar muchos organoides intestinales nuevos. Cualquier residuo que aún esté presente en el cultivo se puede eliminar fácilmente durante el proceso de paso haciendo girar lentamente las mezclas disociadas de organoides/desechos en un tubo con la velocidad suficiente para granular los organoides pero dejar una lámina de células flotando en el medio. A continuación, se pueden aspirar los medios y los residuos celulares para que solo quede la bolita de organoides.
La limitación de este enfoque es que los tipos de células derivadas de hiPSC a menudo no están completamente maduros en términos de expresión génica y perfiles funcionales. Para determinar si el tejido intestinal derivado de hiPSC es adecuado para aplicaciones específicas, los organoides deben caracterizarse para diferentes tipos de células, incluidos enterocitos (VIL), células enteroendocrinas (neurog3), células caliciformes (MUC2), células amplificadoras transitorias (CD133), células de paneth (FZD5) y células madre LGR5+ (LGR5) para determinar la composición celular del organoide.
En general, la principal ventaja de este protocolo sobre muchos otros protocolos de diferenciación de organoides es que esta plataforma de cultivo es muy rentable debido a la sustitución de varias proteínas recombinantes y preparaciones de medios acondicionados por moléculas pequeñas15,16. La diferenciación en HG es muy simple y rápida y se puede aplicar tanto a células madre embrionarias humanas como a células madre pluripotentes inducidas con resultados idénticos. Cuando se sigue rigurosamente y se optimiza para las líneas celulares que se utilizan, proporciona una plataforma modelo relativamente simple, libre de células mesenquimales contaminantes que luego se puede aplicar para estudiar el epitelio intestinal en una variedad de contextos, incluida la inflamación, las interacciones huésped-patógeno 7. El modelado de la fibrosis intestinal podría investigarse proporcionando estímulos profibróticos y luego evaluando la expresión de proteínas de la matriz extracelular como el colágeno, la laminina y la fibronectina mediante QPCR, Western blot y ELISA. El uso de técnicas de edición génica CRISPR/Cas9 en líneas de células madre indiferenciadas antes de la diferenciación permite la creación de organoides de knockout génico o sobreexpresión de proteínas que podrían usarse para crear organoides específicos de enfermedades y modelos de enfermedades más complejos 14,17,18.

Las propiedades de las células madre pluripotentes (PSC), como la autorrenovación y la capacidad de diferenciarse a cualquier tipo de célula del cuerpo humano, las convierten en herramientas valiosas en el estudio del desarrollo, la patología de la enfermedad y las pruebas de fármacos1. Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) son particularmente útiles para los estudios de modelización de enfermedades, ya que pueden derivarse de pacientes, capturando directamente el genoma responsable del fenotipo de la enfermedad 2,3. Tales hiPSCs pueden ser diferenciadas al tipo de célula afectada por el defecto genético, lo que permite un examen cuidadoso del mecanismo molecular de la enfermedad4.
Los protocolos de diferenciación para las PSC humanas tienen como objetivo dirigir la diferenciación de las células a través de las principales etapas de desarrollo mediante la activación o inhibición de vías de señalización específicas que gobiernan el compromiso y la especificación del linaje. El mantenimiento de la hiPSC en un estado pluripotente requiere niveles moderados de señalización de la activina A (Act-A), mientras que una dosis alta de Act-A durante 3 días compromete a la hiPSC a un destino definitivo del endodermo (DE) 5,6. Las vías Act-A y Wnt dirigen la identidad antero-posterior de la DE. La señalización por Act-A induce marcadores del intestino anterior (FG) como HHEX, HNF4α y GATA4, al tiempo que bloquea la expresión de genes del intestino posterior (HG) como CDX2. La señalización Wnt induce la posteriorización de la DE, que luego adopta un perfil de expresión génica HG 7,8. Una vez que se establece la identidad de la célula HG, la diferenciación puede pasar de 2D a 3D y dirigirse hacia la formación de organoides intestinales.
Los organoides intestinales se cultivan típicamente en un sistema de cultivo basado en matriz extracelular 3D (p. ej., Matrigel u otras MEC compatibles)9, compuesto de laminina, colágeno IV y entactina y enriquecido con factores de crecimiento como EGF, FGF, PDGF e IGF-1 para contribuir al apoyo de la supervivencia y la proliferación. Los organoides se cultivan en un medio definido que contiene gastrina, noggin y CHIR para estimular y apoyar el crecimiento y la proliferación de células madre intestinales durante el cultivo a largo plazo.
Después de que las células epiteliales intestinales se incrustan en la matriz extracelular, las criptas intestinales comienzan a formarse y expandirse y finalmente forman esferoides. Estos maduran en estructuras organoides que imitan el funcionamiento fisiológico del epitelio intestinal. Por lo general, los organoides se pueden cultivar durante más de 1 año sin pérdida significativa de perfiles funcionales y de expresión génica. El paso es necesario semanalmente mediante la digestión enzimática de los organoides en fragmentos más pequeños que luego se vuelven a ensamblar en organoides completos.
Las líneas de organoides establecidas se pueden utilizar como un modelo confiable de numerosos trastornos relacionados con el intestino, incluida la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa y los cánceres colorrectales 10,11,12,13. Este es un modelo preferido a las células animales, ya que expresan genes humanos relacionados con estos trastornos y responden a estímulos externos más parecidos a los que se producen en el tejido humano in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12 (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12654-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1046-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor reduced Matrigel</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer solution (1M)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6057-NG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9713.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLe Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt 3a</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of hipsc-derived intestinal organoids for developmental and disease modelling applications

Los organoides intestinales derivados de hiPSC son estructuras epiteliales que se autoensamblan a partir de células diferenciadas en estructuras 3D complejas, representativas del epitelio intestinal humano, en las que exhiben estructuras similares a criptas/vellosidades. Aquí, describimos la generación de organoides intestinales derivados de hiPSC mediante la diferenciación escalonada de hiPSC en endodermo definitivo, que luego se posterioriza para formar epitelio del intestino posterior antes de ser transferido a condiciones de cultivo 3D. El entorno de cultivo 3D consiste en matriz extracelular (MEC) (por ejemplo, Matrigel u otra MEC compatible) suplementada con SB202190, A83-01, Gastrina, Noggin, EGF, R-espondina-1 y CHIR99021. Los organoides se someten a un pase cada 7 días, donde se interrumpen mecánicamente antes de transferirlos a una matriz extracelular fresca y se les permite expandirse. La QPCR y la inmunocitoquímica confirman que los organoides intestinales derivados de hiPSC contienen tipos de células epiteliales intestinales maduras, incluidas las células caliciformes, las células de Paneth y los enterocitos. Además, los organoides muestran evidencia de polarización por expresión de vellosidades localizadas en la superficie apical de las células epiteliales.
Los organoides resultantes se pueden utilizar para modelar el desarrollo intestinal humano, así como numerosas enfermedades intestinales humanas, incluida la enfermedad inflamatoria intestinal. Para modelar la inflamación intestinal, los organoides pueden exponerse a mediadores inflamatorios como el TNF-α, el TGF-β y el LPS bacteriano. Los organoides expuestos a citoquinas proinflamatorias muestran un fenotipo inflamatorio y fibrótico en respuesta. El emparejamiento de las células sanas frente a las hiPSC derivadas de pacientes con EII puede ser útil para comprender los mecanismos que impulsan la EII. Esto puede revelar nuevas dianas terapéuticas y nuevos biomarcadores para ayudar en el diagnóstico precoz de la enfermedad.

En la Figura 1A se muestra un esquema del protocolo de diferenciación. En el día 1 del protocolo, las hiPSC deben estar compactas y formando pequeñas colonias con una confluencia total de aproximadamente el 50-60%. 24 horas después de la inducción de la diferenciación hacia la DE, las células comienzan a migrar lejos de las colonias de células madre para formar una monocapa de células. Esto continúa durante los siguientes 3 días y debería formar una monocapa completa en D3 de diferenciación de DE (Figura 1). La expresión génica debe monitorizarse a lo largo de la diferenciación con marcadores de pluripotencia (OCT4, NANOG, SOX2) altamente expresados en D0 y rápidamente regulados a la baja durante la diferenciación de DE. Durante la diferenciación DE, la expresión de T debe alcanzar su punto máximo en D1, seguido de EOMES y MIXL en D2. En D2 los genes DE (SOX17, FOXA2, GATA4, CXCR4) deberían comenzar a expresarse y alcanzar su punto máximo en D3 (Figura 2 y Figura 3). Las células deben ser una monocapa por DE D3 y luego pueden ser posteriorizadas en el endodermo del intestino posterior. Durante el evento de posteriorización, las estructuras 3D comenzarán a formarse ya en D2. Sin embargo, a veces solo comenzarán a aparecer en D4 o no aparecerán en absoluto; esto no siempre es indicativo de si las células procederán o no a formar organoides intestinales (Figura 1). Durante la especificación de HG, se debe inducir la expresión de CDX2 y HNF4a y aumentar con el tiempo (Figura 3).
Después de la transferencia de láminas 2D de células a la matriz extracelular, se observarán grupos de células 2D durante las primeras 24 h. Después de 48 h, las hojas de células deben comenzar a autoorganizarse en estructuras esferoides 3D más compactas que inicialmente son pequeñas (Figura 4A) y luego aumentar gradualmente en tamaño y complejidad durante 7-10 días de cultivo (Figura 4B y Figura 4C). Los organoides no deben ser transitados hasta que hayan alcanzado una morfología clara de organoide/esferoide con epitelio obvio con la luz orientada hacia el centro del organoide/esferoide (Figura 4D). En esta etapa, la inmunocitoquímica se puede utilizar para confirmar la expresión de marcadores intestinales como la villina y CDX2 (Figura 5). No todos los grupos de células 2D se convertirán en organoides y habrá algunas células muertas contaminantes dentro de la matriz extracelular. Estas láminas muertas de células deben ignorarse hasta que las células supervivientes hayan formado grandes organoides y estén listas para el paso.
Para modelar la inflamación, se puede añadir TNFα al medio de cultivo de tejidos durante 24-48 h. Tras la incubación con moléculas proinflamatorias, los organoides se cosechan utilizando la misma técnica utilizada para su aislamiento y paso y luego se lisan utilizando una aplicación compatible con tampón celular como QPCR o Western blot. Si se requieren exposiciones más cortas, primero se deben extraer organoides de la matriz extracelular y exponerlos al TNFα en suspensión utilizando un tubo de 1,5 ml. El tratamiento de organoides intestinales con TNFα durante 48 h suele inducir la expresión de marcadores proinflamatorios (TNFα, IL1B, IL8, IL23) mientras que afecta negativamente a la expresión de marcadores epiteliales intestinales (LGR5, VIL) (Figura 6).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Endodermo medio basal</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="2">RPMI 1640</td>
			<td>48.5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Suplemento B27</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">1% NEAA</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Composición de los medios basales endodérmicos para la diferenciación endodérmica.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Medios basales intestinales</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="2">DMEM/F12 avanzado</td>
			<td>46.5 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Búfer HEPES</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">GlutaMAX</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Nicotinamida</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Suplemento de N2</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Suplemento B27</td>
			<td>1.0 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Pluma/Estreptococo</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Composición de los medios basales intestinales para el cultivo de organoides intestinales
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig01.jpg"> Figura 1: Cambios morfológicos durante la diferenciación de hiPSC a través del endodermo definitivo al linaje del intestino posterior. (A) Resumen esquemático del protocolo de diferenciación intestinal. Esta línea celular de hiPSC forma colonias sueltas de células pequeñas con una alta proporción de núcleo a citoplasma. A medida que avanza la diferenciación, las células sufren cambios consistentes con la transición del fenotipo epitelial al mesenquimal y por DE D3 forman una monocapa uniforme. Una vez que se entregan las señales adecuadas, las células DE se alargan y forman una monocapa más densamente empaquetada con esferoides 3D que aparecen tan pronto como HD D3, pero esto depende de la línea celular utilizada y no es un requisito para la transición al cultivo 3D (B). Barra de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig02.jpg"> Figura 2: La diferenciación de las hiPSC en el endodermo HG induce la expresión de genes endodérmicos. La inmunotinción de hiPSC que se diferencia al endodermo definitivo muestra cambios en la expresión de TFs a nivel proteico. Los marcadores de pluripotencia (NANOG y OCT4) están regulados a la baja por DE D3 (A). La expresión del marcador de mesendodermo BRA(T) está presente en D1 del protocolo (B) y los TFs específicos de DE SOX17 y FOXA2 aparecen en D2 (B y C). Barra de escala: 200 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig03v2.jpg"> Figura 3: Cambios en la expresión génica por qPCR durante la diferenciación de hiPSC en el endodermo del intestino posterior (HG). Los genes asociados con la pluripotencia están regulados a la baja (OCT4, NANOG, SOX2) seguidos de la expresión transitoria de los genes del mesendodermo (T, EOMES, MIXL1) y, finalmente, la expresión de los genes DE (SOX17, FOXA2, CXCR4) y los genes del intestino posterior (CDX2, GATA4, HNF4a). Los datos se presentan como media ±DE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig03largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig04.jpg"> Figura 4: El endodermo HG se autoensambla para formar organoides intestinales en 3D en cultivo de matriz extracelular en 3D. El endodermo HG se transfiere a un cultivo de matriz extracelular 3D adecuado e inicialmente forma pequeños grupos sólidos de células (A). Los grupos de endodermo HG se expanden a lo largo de 7-10 días de cultivo (B) y luego se vuelven asimétricos y comienzan a formar un epitelio más complejo (C), dando lugar finalmente a organoides con una clara morfología epitelial y una superficie luminal orientada hacia el centro del organoide (D). Barras de escala = 50 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig05.jpg"> Figura 5: Los organoides intestinales derivados de hiPSC establecidos expresan marcadores intestinales. Inmunocitoquímica que muestra la expresión de CDX2 y Villin. Barras de escala = 100 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61199/61199fig06v2.jpg"> Figura 6: Efecto del TNFα en el perfil inflamatorio y la expresión celular intestinal de organoides intestinales sanos. Perfil inflamatorio de organoides colónicos sanos tras 48 horas de tratamiento con TNFα (40 ng/mL). La expresión de marcadores proinflamatorios (TNFα, IL-8 e IL-23) aumenta tras la exposición al TNFα, mientras que al mismo tiempo la expresión de marcadores epiteliales intestinales (LGR5, VIL) se regula a la baja. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student bilateral. Los datos se expresan como media ± DE de cada grupo. *P < .01; **P < .001; P < 0,0001. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61199/61199fig06largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Generation of hiPSC-Derived Intestinal Organoids for Developmental and Disease Modelling Applications

Este protocolo permite la diferenciación de células pluripotentes humanas en organoides intestinales. El protocolo imita el desarrollo humano normal mediante la diferenciación de células en una población de endodermo definitivo, endodermo del intestino posterior y luego epitelio intestinal. Esto hace que el protocolo sea adecuado para estudiar tanto el desarrollo intestinal como las aplicaciones de modelización de enfermedades.

Generación de organoides intestinales derivados de hiPSC para aplicaciones de modelización del desarrollo y de enfermedades

hiPSC-derived intestinal organoids are epithelial structures that self-assemble from differentiated cells into complex 3D structures, representative of ...

Este método proporciona instrucciones paso a paso sobre cómo generar organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos mediante la diferenciación en endodermo definitivo, luego en epitelio intestinal posterior y, finalmente, la transferencia a condiciones de cultivo 3D. Los resultados obtenidos a partir de organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos demuestran una mayor traducibilidad que los datos de cultivos monocelulares, a la vez que son más prácticos que los organoides derivados de tejidos primarios, que pueden ser difíciles de mantener en cultivo a largo plazo. Tras la generación de células intestinales humanas a partir de iPSC diferenciadas, utilice una pipeta serológica de 5 mililitros para separar la monocapa celular de cada pocillo de la placa de 6 pocillos.Y agrupar las células en un solo tubo de 15 mililitros para la centrifugación. Vuelva a suspender el gránulo en un medio de crecimiento intestinal suplementado con factores de crecimiento. Y agregue el volumen apropiado de matriz extracelular de acuerdo con el número de pocillos que se están sembrando.Agregue 30 microlitros de la suspensión celular al centro del número apropiado de pocillos de una placa de 48 pocillos. Asegurarse de que el ECM se coloque en el centro del pocillo es muy importante para la estabilidad a largo plazo de esa muestra. Si el ECM toca la pared del pocillo, puede colapsar y las muestras pueden perderse.Coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares durante al menos 5 minutos. Cuando la matriz extracelular se haya endurecido, agregue 300 microlitros de medio de crecimiento intestinal fresco suplementado con factores de crecimiento a cada pocillo y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular. Después de 48 horas, use un microscopio óptico para verificar la formación de organoides en los pocillos.Después de 7 días de cultivo, aspire el medio de cultivo y reemplácelo con DPBS helado. Utilice una pipeta serológica de 5 mililitros para separar mecánicamente los organoides y la esfera de la matriz extracelular de la placa. Luego, agrupe los organoides en un solo tubo de centrífuga de 15 mililitros.Recoja los organoides por centrifugación y aspire el sobrenadante hasta la parte superior de la capa visible de ECM. Vuelva a suspender el gránulo en 15 mililitros de DPBS helado y vuelva a centrifugar las células. Después de aspirar el sobrenadante como se ha demostrado, vuelva a suspender el gránulo en 1 mililitro de PBS helado y use una pipeta P200 para interrumpir manualmente los organoides intactos.Confirme una disociación completa de los organoides. Centrifugar los organoides disociados y volver a suspenderlos en el volumen requerido de la matriz extracelular antes de colocarlos en una placa fresca de 48 pocillos, como se ha demostrado. Luego, regrese la placa a la incubadora durante 5 minutos.Después de 5 minutos, retire la placa de la incubadora y agregue medios basales intestinales con factores de crecimiento e inhibidor de ROCK. Cambie los medios cada 2-4 días. Para desencadenar una respuesta inflamatoria en los organoides intestinales, reemplace el sobrenadante en cada pocillo del cultivo de organoides con 300 microlitros de medio basal recién preparado suplementado con 40 nanogramos por mililitro de TNF alfa.Luego, regrese la placa a la incubadora de cultivos celulares durante 48 horas para replicar un entorno proinflamatorio. La expresión génica se puede monitorizar a lo largo de la diferenciación de IPSC humana utilizando marcadores de pluripotencia que se expresan en gran medida en el día 0 y se regulan rápidamente a la baja durante el proceso de diferenciación definitiva del endodermo. En el día 2 de diferenciación, los genes definitivos del endodermo deben comenzar a expresarse, y la expresión debe alcanzar su punto máximo en el día 3.Durante la especificación del intestino posterior, la expresión de CDX2 y HNF4alfa debe inducirse y aumentar con el tiempo. 48 horas después de la transferencia de la lámina celular 2D, las láminas de células deben comenzar a autoorganizarse en estructuras esferoides 3D más compactadas que inicialmente son pequeñas, pero que aumentan gradualmente en tamaño y complejidad durante los próximos 7-10 días de cultivo. Los organoides no deben ser transitados hasta que hayan alcanzado una morfología esferoide organoide clara con epitelio evidente y con el lumen orientado hacia el centro de la estructura.Cuando las estructuras alcanzan esta etapa, se puede realizar inmunocitoquímica para confirmar la expresión de marcadores intestinales, como la vellosidad y el CDX2. Para modelar la inflamación, se puede añadir TNF alfa al medio de cultivo de tejidos durante 24-48 horas, lo que suele dar lugar a la expresión de marcadores proinflamatorios junto con la regulación a la baja de los marcadores epiteliales intestinales. Los organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos se pueden utilizar para el descubrimiento de fármacos, el modelado de enfermedades, la edición de genes, el estudio del microambiente tumoral y el perfil transcriptómico, proteómico y epigenético de cualquier enfermedad de interés.Este método puede ayudar a muchos laboratorios a establecer organoides intestinales como un sistema modelo, proporcionándoles un método adicional para su investigación.

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