Name: an air-liquid interface bronchial epithelial model for realistic, repeated inhalation exposure to airborne particles for toxicity testing
Uploaded: 2020-05-13T14:00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing at JoVE.com

Dit werk wordt gefinancierd door EU-project PATROLS (Fysiologisch Verankerde Tools voor Realistische nanomateriaalrisico's) en het Ministerie van Volksgezondheid, Welzijn en Sport (project V/050012). We willen dr. Yvonne Staal en dr. Jan van Benthem bedanken voor het kritisch beoordelen van het manuscript.

1. Celkweekmedium voorbereiden (CCM)
<ol><li>Bereid een fles van 500 ml minimaal essentieel medium (MEM) aangevuld met glutamine.</li>
	<li>Voeg 5 ml penicilline-streptomycine toe (d.w.z. 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine).</li>
	<li>Voeg 5 ml niet-essentiële aminozuren (NEAA) oplossing toe.</li>
	<li>Voeg 10 ml amfotericine B toe (optioneel).</li>
	<li>Voeg 50 ml FBS toe (warmte geïnactiveerd, volg het ATCC-protocol voor warmte-inactivering; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Gidsen/AnimCellCulture_Guide.ashx, pagina 19)).</li>
</ol>2. Subculturing van Calu-3 cellen
OPMERKING: Calu-3-cellen worden gekweekt in T75- of T175-celkweekkolven bij 37 °C en 5% CO2. Cellen worden elke 7 dagen bij 60-80% samenvloeiing gepasseerd met CCM-vernieuwing om de 2-3 dagen. CCM wordt afgegoten en verse CCM (T25 = 5 ml, T75 = 15 ml en T175 = 25 ml) wordt in de kolf gepijpt en de kolf wordt terug in de incubator geplaatst. Cellen moeten ten minste 2x na ontdooien, vóór gebruik in experimenten of vóór het invriezen worden doorlopen en mogen in totaal niet meer dan 25x worden doorlopen.
<ol><li>Controleer of de kolf 60-80% samenvloeit door te controleren onder een lichtmicroscoop.</li>
	<li>Giet de CCM uit de kolf.</li>
	<li>Was de cellen 2x met 5 ml 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) zonder calcium en zonder magnesium. Gooi de HBSS na elke wasbeurt weg. HBSS verwijdert serum, dat trypsine remt.</li>
	<li>Voeg 3 ml trypsine-EDTA toe voor een T75 (4 ml voor een T175) en plaats de kolf terug in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 10-15 minuten. Controleer na 10 minuten of de cellen los zijn geraakt van het kolfoppervlak. In het geval dat de cellen worden gekweekt tot >80% samenvloeiing, zullen ze niet losraken met behulp van trypsine 0,05% en trypsine 0,25% kan worden gebruikt.</li>
	<li>Voeg 6 ml (d.w.z. het dubbele van het oorspronkelijk toegevoegde trypsine-EDTA-volume) CCM toe aan de kolf en schommel de kolven voorzichtig om een goede menging te garanderen. Dit om ervoor te zorgen dat de trypsine is geneutraliseerd door de FBS in de CCM en zijn activiteit op de cellen gestopt. Als trypsine te lang in contact mag blijven met de cellen, zullen ze niet opnieuw worden bevestigd wanneer ze in een nieuwe celkweekkolf worden geplaatst.</li>
	<li>Giet de volledige inhoud van de kolf in een centrifugebuis van 50 ml.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 130 x g, zodat de centrifuge correct in evenwicht is.</li>
	<li>Breng de flacon met de cellen terug naar aseptische omstandigheden en verwijder het supernatant voorzichtig, zonder de pellet te storen. Het supernatant kan worden afgegoten en de rest kan worden afgetappeld, zodat de pellet niet wordt verstoord.</li>
	<li>Resuspend de celkorrel in 1 ml CCM door op en neer te pipetten totdat alle cellen zijn opgehangen (d.w.z. er worden geen pellets of celagglomeraten waargenomen). Extra CCM kan worden toegevoegd om de celsuspensie te verdunnen.</li>
	<li>Tel de cellen, zowel dood als levend, in 1 ml CCM met behulp van een hemocytometer. Indien nodig voor een goede telling, verdun de cellen in 3 of 4 ml.</li>
	<li>Hang de cellen in het vereiste CCM-volume en voeg de celsuspensie toe aan elke kolf. Om ongeveer 80% gelijktijdigheid in een week te bereiken, zaait u 2 x 106 cellen in een T75 of 6 x 106 cellen in een T175.</li>
	<li>Schommel de kolf voorzichtig en plaats deze vervolgens terug in de incubator bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Vervang elke 2-3 dagen door verse CCM en subcultuur wanneer de cellen 60-80% samenvloeiing bereiken.</li>
</ol>3. Calu-3 cellen zaaien op kweekinzetstukken
OPMERKING: Wisselplaten zijn verkrijgbaar met verschillende poriematen. Kleine poriegroottes (bijv. 0,4 μm) hebben als voordeel dat de cellen gemakkelijker groeien en al na 5 dagen een goede barrière kunnen bereiken onder ondergedompelde omstandigheden, zoals gemeten door Trans Epithelial Electrical Resistance (TEER). Wanneer u echter geïnteresseerd bent in deeltjestranslocatie, zijn deze poriën te klein en zullen ze de deeltjes vangen. Daarom worden meestal grotere poriematen (bijv. 3 μm) gekozen om deeltjes te testen. Bij gebruik van een grotere poriegrootte hebben de cellen langere perioden nodig (bijv. 7-10 dagen cultiveren onder ondergedompelde omstandigheden) om een goede TEER te bereiken.
<ol><li>Bereid celsuspensie met bekende concentratie voor volgens stap 2.1–2.10.</li>
	<li>Verdun cellen tot een concentratie van 5 x 105 cellen/ml in voorverwarmde CCM voor 6 putinzetstukken of 2,5 x 105 cellen/ml voor 12 putinzetstukken.</li>
	<li>Neem een celkweekplaat met inzetstukken en plaats deze onder aseptische omstandigheden.</li>
	<li>Vul de basolaterale zijde met 2 ml voorgewarmde CCM voor 6 putinzetstukken, of 1 ml voor 12 putinzetstukken. Terwijl u het cultuurmedium toevoegt, haalt u het inzetstuk eruit met een pincet.</li>
	<li>Meng de celophanging voorzichtig door op en neer te spuiten. Pipet 1,0 ml voor 6 putinzetstukken en 500 μL voor 12 putten (overeenkomend met 100.000 cellen/cm2)op de bovenkant vanhet membraan in de celkweekinzet met 0,4 μm poriën. Voor poriën van 3,0 μm verhoogt u de celdichtheid tot 128.000 cel/cm2.</li>
	<li>Bedek de celkweekplaat en incubeer bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Wijzig de CCM elke 2-3 dagen.</li>
	<li>Laat de cellen 7 dagen samenvloeien onder ondergedompelde omstandigheden voordat u doorgaat met cultuur in de ALI.</li>
	<li>Teer meten.<ol>
<li>Neem een Epitheel Voltohmmeter aangevuld met Chopstick Electrode Set en laad het batterijsysteem 's nachts op.</li>
		<li>Koppel de Voltohmmeter los van de lader en sluit de eetstokelektrode aan.</li>
		<li>Reinig de elektrode met 70% ethanol.</li>
		<li>Plaats de elektrode in de CCM door de langere elektrode in de externe kweekmedia te plaatsen totdat deze de bodem van de schaal raakt en de kortere elektrode in het medium plaatst zonder het membraan aan te raken.</li>
		<li>Begin met een lege insert zonder cellen. Wacht tot de meting stabiliseert en noteer de weerstand in Ohm. Deze meting is de weerstand van het wisselplaatmembraan zonder cellen (d.w.z. lege weerstand).</li>
		<li>Herhaal de meting voor elke wisselplaat en trek de lege weerstand af om de ware weerstand te verkrijgen.</li>
		<li>Vermenigvuldig voor gegevensanalyse de weerstandswaarden met het oppervlak van de insert in Ω x cm2. Voor een inzetstuk van 6 putten is het oppervlak 4,67 cm2. Dus als een weerstand van 600 Ohm wordt gemeten en de achtergrond 120 Ohm is, is de weerstand 480 Ohm, die vervolgens wordt vermenigvuldigd met het oppervlak van 4,67 cm2 voor een totaal van 2.241,6 Ohm x cm2. De TEER moet >1.000 Ω x cm2 zijn om door te gaan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder de CCM van de apicale kant van de inzetstukken.</li>
	<li>Voeg 2 ml voorverwarmde CCM toe voor 6 put en 1 ml voor 12 putinzetstukken aan de basolaterale kant van de put (d.w.z. onder de celkweekinzet). De CCM moet het membraan vanaf de onderkant aanraken, maar niet op de bovenkant van het inzetstuk lekken.</li>
	<li>Op dit punt worden cellen apicaal blootgesteld aan lucht, wat wordt aangeduid als culturing bij de ALI.</li>
	<li>Kweekcellen in de ALI in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 7 dagen voorafgaand aan blootstelling.</li>
	<li>Vervang de basolaterale CCM elke 2-3 dagen. De cellen kunnen 6 weken bij de ALI worden gebruikt.</li>
</ol>4. Voorbereiding van de belichtingsinstelling
OPMERKING: In de paragrafen 5 tot en met 7 worden preparaten voor deeltjesblootstelling beschreven met behulp van een geautomatiseerd blootstellingsstation (AES, zie tabel met materialen). De opstelling voor deeltjesverneveling en karakterisering is ook compatibel met andere ALI-blootstellingssystemen van andere fabrikanten. Als voorbeeld wordt de blootstelling aan deeltjes hieronder beschreven. Dergelijke systemen kunnen ook worden gebruikt voor andere blootstellingen, zoals sensibilisatoren, sigarettenrook en dieseluitlaat. Figuur 1 toont de AES en een belichtingsmodule. Figuur 2 toont een schematische weergave van de belichtingsopstelling inclusief alle andere instrumenten.
<ol><li>Voordat u een blootstelling start met behulp van de AES, sluit u het systeem aan op verschillende instrumenten om aerosolkenmerken te meten; deze worden gemeten in een zijstroom net voordat de aerosolen de kast binnenkomen. OPMERKING: Een stroomsplijter wordt gebruikt om de zijstroom aan te sluiten op de belichtingskarakteriseringsapparatuur. Over het algemeen wordt de volgende apparatuur gebruikt: scanning mobility particle sizer (SMPS), optical particle sizer (OPS), condensation particle counter (CPC), tapered element oscillating microbalance (TEOM). De SMPS- en OPS-metingen worden 1x per uur uitgevoerd en gebruiken dezelfde slang van de stroomsplitser. De CPC en TEOM voeren continue metingen uit en gegevens van beide worden geregistreerd op een Squirrel model 2020 datalogger. Bovendien wordt de gravimetrische massaconcentratie bepaald aan de hand van een microbalans in gecontroleerde relatieve vochtigheid (40-70%) temperatuur (21–23 °C) omstandigheden. Teflonfilters worden voor en na elke blootstelling gewogen om de blootstellingsconcentratie te bevestigen. Om de uitlaat vast te leggen, wordt een HEPA-filter gebruikt. De opstelling inclusief technische nanomateriaal (ENM) suspensies en vernevelaar zijn allemaal in een flowkast geplaatst om blootstelling aan mensen te voorkomen. De AES kan worden gebruikt voor het testen van veel verschillende soorten ENM's, waaronder metalen en metaaloxiden.</li>
	<li>Bereid kort voor blootstelling een nanomateriaalsuspensie voor. Meestal wordt een suspensie van 1% bereid als voorraadoplossing. Schortel bijvoorbeeld 100 mg nanomateriaal op in 10 ml zuiver water. OPMERKING: Voor blootstelling aan DQ12 wordt 300 mg gebruikt om ongeveer 2 μg/cm2te bereiken. Deze hoeveelheid kan worden gebruikt bij een enkele blootstelling of verdeeld over herhaalde blootstellingen (bijvoorbeeld, 300 mg wordt gesuspendeerd in 30 ml voor een enkele blootstelling of 21,5 mg wordt elke dag vers in 2,15 ml gesuspendeerd gedurende 3 weken herhaalde blootstelling). De suspensie wordt op elke blootstellingsdag vers bereid. De deeltjessuspensie wordt gedurende 16 minuten gesoniceerd met behulp van sondesonicatie. Het volume van de 1% voorraadoplossing wordt aangepast aan een totaal volume van 100 ml door toevoeging van zuiver water.</li>
	<li>Doe de ENM-suspensie in een klein flesje met een dop en een magneetroerder om bezinking van de deeltjes te voorkomen. Sluit de fles via een kleine buis aan op een peristaltische pomp en stel de stroom in op 25 ml/h.</li>
	<li>Sluit de peristaltische pomp aan op een spuitmond en pas de instellingen aan om continue aerosolisatie mogelijk te maken.</li>
	<li>Het spuitmondstuk is gemonteerd op een 60 cm lange aluminium buis (mengkamer, diameter 15 cm, verwarmd tot 60 °C). De opstelling wordt via een 1,5 meter lange koperen buis (diameter 15 cm) op de AES aangesloten. Bovenop de AES verwijdert een botsapparaat alle aerosolen groter dan 2,5 μm.</li>
	<li>Sluit het spuitmondstuk aan op 3 bar perslucht via twee massastroomregelaars (MFC) om verneveling van ophangingen mogelijk te maken. Een stroom van 14 L/min wordt gebruikt voor het spuitmondstuk, de andere MFC voor het mengen van de lucht in de buis.</li>
	<li>Schakel de dag voor het begin van de blootstelling de AES in om de kast een temperatuur van 37 °C te laten bereiken.</li>
	<li>Schakel de luchtstroom en de luchtvochtigheid in de kast 2 uur voor aanvang van de blootstelling in om een luchtvochtigheid van 85% te bereiken. Schakel de verwarming in van de belichtingskamers waarin de wisselplaten met de cellen worden geplaatst.</li>
	<li>Schakel de quartz microbalans (QCM) in en stel de beginwaarde in op 0 met behulp van de software. Begin met loggen. Om de 10 s wordt de massa gemeten en uitgedrukt als ng/cm2.</li>
	<li>Verwarm de celkweekmedia tot 37 °C in een waterbad (~20–30 min).</li>
</ol>5. Calu-3 cellen voorbereiden op blootstelling
OPMERKING: Voor een typische ALI-blootstelling met behulp van de AES zijn 15-20 inserts met een confluentcellaag nodig. Deze bestaan uit 3 clean air controls, 3 incubator controls die op dezelfde manier worden behandeld als de andere inserts zonder blootstelling in de AES, 6–8 inserts voor aerosol exposure (afhankelijk van het gebruik van 0, 1 of 2 microbalances), 1–3 inserts voor controlemetingen (zoals maximale LDH release) en 3 reserve inserts voor het geval de TEER van sommige inserts niet voldoende is. De cellen moeten een TEER van >1.000 Ω x cm2 hebben om door te gaan.
<ol><li>Was cellen op de eerste dag van blootstelling 1x met CCM, controleer de celmorfologie en meet de TEER van het celmodel met behulp van een Voltohmmeter. De cellen moeten een strakke monolaag vormen zonder openingen.</li>
	<li>Plaats 2 ml/1 ml HEPES gebufferde CCM zonder FCS aan de basolaterale kant van 6 put/12 putplaten en breng de kweekinzetstukken met cellen over naar de nieuwe platen. OPMERKING: Tijdens de blootstelling is er geen CO2 aanwezig in de AES. Daarom wordt HEPES gebufferd kweekmedium (25 mM HEPES) gebruikt tijdens transport en blootstelling. Dit medium wordt gebruikt voor zowel de blootgestelde cellen in de AES als de incubatorcontrolecellen.</li>
	<li>Als de tijd om de celculturen naar de AES te transporteren meer dan 5 minuten is, plaatst u de cellen tijdens het transport in een draagbare incubator van 37 °C.</li>
</ol>6. Omgaan met de AES tijdens een blootstelling
<ol><li>Vul bij de AES de blootstellingsmodules met HEPES-gebufferde CCM zonder foetaal kalfsserum (FCS). De hoeveelheid CCM is afhankelijk van de gebruikte eenheid en het type celcultuur-insert. Houd er rekening mee dat om cellen bij de ALI te houden, het medium de bodem van het membraan moet bereiken, maar niet bovenop het membraan mag lekken. Voeg bij gebruik van 6 putinzetstukken 6 ml HEPES-gebufferde CCM toe aan de belichtingsmodules.</li>
	<li>Breng de inzetstukken met cellen van de platen over naar de belichtingsmodules met een steriel pincet. Controleer of er geen luchtbellen aan de basolaterale kant van de cellen zijn en verwijder eventuele CCM aan de apicale kant van de inzetstukken. Als er wat luchtbellen aan de basolaterale kant zijn, draai dan voorzichtig de inzetstukken met behulp van het steriele pincet totdat ze zijn verwijderd. Bewaar de platen met CCM in een incubator voor overdracht na een blootstelling.</li>
	<li>Gebruik het aanraakscherm om belichtingsduur, luchtdebiet en elektrostatische depositieverbetering te kiezen. Het display kan ook worden gebruikt om de luchtvochtigheid en temperatuur te controleren. Meestal wordt gekozen voor een belichtingsduur van 4 uur, met een debiet van 50 ml/min op de wisselplaten bij 37 °C en 85% vochtigheid. OPMERKING: De modules in het eerste niveau (figuur 1) worden gebruikt voor blootstelling aan schone lucht; wisselplaten in dit niveau worden gebruikt als controles voor blootstelling aan schone lucht. De andere modules in het tweede en derde niveau kunnen worden gebruikt voor blootstelling aan aerosolen, waaronder twee modules voor kwartskristalmicrobalansen (QCM) om de afzetting online te meten.</li>
	<li>De lektest moet worden uitgevoerd voordat met de blootstelling wordt begonnen. De lekkage moet minder dan 5 ml/min zijn. Volg de instructies op het AES-display. Wanneer de lektest is voltooid, kan de blootstelling worden gestart. In geval van een lek moet de slang worden gecontroleerd.</li>
	<li>Open aan het einde van de blootstelling de deur van een AES-module, open de belichtingsmodules, plaats de celkweekinzetstukken terug naar de celkweekplaten en breng de platen over naar de draagbare incubator.</li>
	<li>Verzamel de media uit de modules (d.w.z. blootgestelde monsters) en uit de platen (d.w.z. incubatorcontroles) voor latere analyse, zoals lactaatdehydrogenase (LDH) meting.</li>
	<li>Terug in het celkweeklab, breng de celkweekinzetstukken over naar platen gevuld met verse standaard CCM. Plaats de celkweekplaten in de incubator tot de volgende blootstelling of tot de analyse.</li>
	<li>Na de laatste blootstellingsdag plaatst u de inzetstukken in de incubator tot de volgende dag.</li>
	<li>Voeg op de dag na de uiteindelijke blootstelling CCM toe aan de apicale kant om TEER te meten met behulp van een Voltohmmeter. Verzamel zowel de apicale als de basolaterale CCM afzonderlijk voor analyse van cytokinen.</li>
	<li>Verwijder alle CCM en voer een cel levensvatbaarheidstest uit door bijvoorbeeld een proliferatiereagens aan de apicale kant toe te voegen.</li>
</ol>7. Reiniging van de AES
<ol><li>Vul de belichtingsmodules met water, wacht 1 minuut en verwijder het water. Vul vervolgens de modules met 70% ethanol, laat het 10 minuten staan en verwijder de ethanol. Reinig de blootstellingstrompen ook met 70% ethanol.</li>
	<li>Stop de luchtvochtigheidsregeling van 85%, maar laat de temperatuur van de kast bij 37 °C voor het volgende experiment.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Geiser, M., Jeannet, N., Fierz, M., Burtscher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Adverse+Effects+of+Inhaled+Nanoparticles+by+Realistic+In+Vitro+Technology.">Evaluating Adverse Effects of Inhaled Nanoparticles by Realistic In Vitro Technology.</a> Nanomaterials (Basel). 7 (2), 49 (2017).</li><li>Herzog, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+exposures+to+acute+and+lifetime+concentrations+of+inhaled+silver+nanoparticles+by+two+different+in+vitro+approaches.">Mimicking exposures to acute and lifetime concentrations of inhaled silver nanoparticles by two different in vitro approaches.</a> The Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1357-1370 (2014).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-controlled+system+for+air-liquid+interface+cell+exposure+and+application+to+zinc+oxide+nanoparticles.">A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).</li><li>Paur, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+cell+exposure+studies+for+the+assessment+of+nanoparticle+toxicity+in+the+lung-A+dialog+between+aerosol+science+and+biology.">In-vitro cell exposure studies for the assessment of nanoparticle toxicity in the lung-A dialog between aerosol science and biology.</a> Journal of Aerosol Science. 42 (10), 668-692 (2011).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+Vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research:+Consensus+Workshop+and+Recommendations.">Air-Liquid Interface In Vitro Models for Respiratory Toxicology Research: Consensus Workshop and Recommendations.</a> Applied in vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Loret, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-liquid+interface+exposure+to+aerosols+of+poorly+soluble+nanomaterials+induces+different+biological+activation+levels+compared+to+exposure+to+suspensions.">Air-liquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions.</a> Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 58 (2016).</li><li>Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+airway+epithelial+cells+(calu-3):+a+model+of+human+respiratory+function,+structure,+and+inflammatory+responses.">Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses.</a> Critical Care Research and Practice. 2010, (2010).</li><li>Braakhuis, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+of+in+vitro+models+to+study+translocation+of+nanoparticles.">Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles.</a> Archives in Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).</li><li>Ren, H., Birch, N. P., Suresh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimised+Human+Cell+Culture+Model+for+Alveolar+Epithelial+Transport.">An Optimised Human Cell Culture Model for Alveolar Epithelial Transport.</a> PLoS One. 11 (10), 0165225 (2016).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Papazian, D., Wurtzen, P. A., Hansen, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Airway+Epithelial+Models+for+Immunological+Co-Culture+Studies.">Polarized Airway Epithelial Models for Immunological Co-Culture Studies.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 170 (1), 1-21 (2016).</li><li>Jeong, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+for+predicting+acute+inhalation+toxicity+by+using+a+Calu-3+epithelium+cytotoxicity+assay.">In vitro model for predicting acute inhalation toxicity by using a Calu-3 epithelium cytotoxicity assay.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 98, 106576 (2019).</li><li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier.">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmacology Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).</li><li>Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Calu-3+cell+line+as+a+model+of+in+vitro+respiratory+syncytial+virus+infection.">Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of Virological Methods. 174 (1-2), 144-149 (2011).</li><li>. Vitrocell&#174; Automated Exposure Station Available from: <a target="_blank" href="https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1">https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1</a> (2019)</li><li>M&#252;lhopt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+of+combustion+aerosols+at+the+air-liquid+interface+with+a+self-contained+and+easy-to-use+exposure+system.">Toxicity testing of combustion aerosols at the air-liquid interface with a self-contained and easy-to-use exposure system.</a> Journal of Aerosol Science. 96, 38-55 (2016).</li><li>. VITROCELL&#174; Cloud for the exposure to liquid aerosols Available from: <a target="_blank" href="https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system">https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system</a> (2019)</li><li>Endes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+testing+strategy+towards+mimicking+the+inhalation+of+high+aspect+ratio+nanoparticles.">An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 40 (2014).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+bioactive+delivery+of+aerosolized+drugs+to+human+pulmonary+epithelial+cells+cultured+in+air-liquid+interface+conditions.">Efficient bioactive delivery of aerosolized drugs to human pulmonary epithelial cells cultured in air-liquid interface conditions.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (4), 526-535 (2014).</li><li>Borm, P. J., Tran, L., Donaldson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carcinogenic+action+of+crystalline+silica:+a+review+of+the+evidence+supporting+secondary+inflammation-driven+genotoxicity+as+a+principal+mechanism.">The carcinogenic action of crystalline silica: a review of the evidence supporting secondary inflammation-driven genotoxicity as a principal mechanism.</a> Critical Reviews in Toxicology. 41 (9), 756-770 (2011).</li><li>Borm, P. J. A., Fowler, P., Kirkland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+review+of+the+genotoxicity+of+respirable+crystalline+silica.">An updated review of the genotoxicity of respirable crystalline silica.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+review+of+silica-induced+inhalation+toxicity.">A mechanistic review of silica-induced inhalation toxicity.</a> Inhalation Toxicology. 27 (8), 363-377 (2015).</li><li>Sayes, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+the+dose+metric+for+inhalation+toxicity+studies:+short-term+study+in+rats+with+engineered+aerosolized+amorphous+silica+nanoparticles.">Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles.</a> Inhalation Toxicology. 22 (4), 348-354 (2010).</li><li>Driscoll, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+response+to+inhaled+silica+or+titanium+dioxide.">Pulmonary response to inhaled silica or titanium dioxide.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 111 (2), 201-210 (1991).</li><li>Muhle, H., Kittel, B., Ernst, H., Mohr, U., Mermelstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+lung+lesions+in+rat+after+chronic+exposure+to+crystalline+silica.">Neoplastic lung lesions in rat after chronic exposure to crystalline silica.</a> Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. 21, 27-29 (1995).</li><li>Peeters, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silica-induced+NLRP3+inflammasome+activation+in+vitro+and+in+rat+lungs.">Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs.</a> Particle and Fibre Toxicology. 11, 58 (2014).</li><li>Reuzel, P. G., Bruijntjes, J. P., Feron, V. J., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subchronic+inhalation+toxicity+of+amorphous+silicas+and+quartz+dust+in+rats.">Subchronic inhalation toxicity of amorphous silicas and quartz dust in rats.</a> Food and Chemical Toxicology. 29 (5), 341-354 (1991).</li><li>Arts, J. H., Muijser, H., Duistermaat, E., Junker, K., Kuper, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-day+inhalation+toxicity+study+of+three+types+of+synthetic+amorphous+silicas+in+Wistar+rats+and+post-exposure+evaluations+for+up+to+3+months.">Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months.</a> Food and Chemical Toxicology. 45 (10), 1856-1867 (2007).</li><li>Cho, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+induced+by+intratracheal+instillation+of+ultrafine+amorphous+silica+particles.">Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles.</a> Toxicology Letters. 175 (1-3), 24-33 (2007).</li><li>Herzog, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+silver-nanoparticles+and+silver-ions+to+lung+cells+in+vitro+at+the+air-liquid+interface.">Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface.</a> Particle and Fibre Toxicology. 10 (1), 11 (2013).</li><li>M&#252;lhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+toxicity+determination+by+in+vitro+exposure+at+the+air+liquid+interface+with+an+integrated+online+dose+measurement.">Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement.</a> Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008 (2009).</li><li>van Ravenzwaay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+fate+and+effects+of+three+particles+of+different+surface+properties:+nano-TiO(2),+pigmentary+TiO(2)+and+quartz.">Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz.</a> Toxicology Letters. 186 (2), 152-159 (2009).</li><li>Henderson, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+inflammatory+response+of+the+lung+to+inhaled+versus+instilled+particles+in+F344+rats.">A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats.</a> Fundamental and Applied Toxicology. 24 (2), 183-197 (1995).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit artikel beschrijft een methode om menselijke bronchiale epitheelcellen onder ALI te cultiveren en dit bronchiale model bloot te stellen aan aerosolen of gassen. Het voordeel van het gebruik van Calu-3 cellen is dat ze nauwe verbindingen vormen, een monolaag blijven, de luchtstroom kunnen weerstaan en wekenlang kunnen worden gekweekt bij de ALI, in tegenstelling tot veel andere celtypen (bijv. 16HBE, H292 en BEAS-2B). Het gebruik van de VITROCELL® automated exposure station (AES) heeft als voordeel dat de cellen onder realistische en relevante omstandigheden kunnen worden blootgesteld, omdat lage concentraties kunnen worden toegepast met behulp van een continue luchtstroom.
Continue stroomsystemen, zoals de AES, hebben voordelen ten opzichte van het gebruik van cloudsystemen3,32, die één verneveling van een ophanging gebruiken. De continue stroom is realistischer en veel variabelen zoals debiet, vochtigheid en temperatuur worden geregeld. Bovendien kan de afzetting worden verbeterd met behulp van een elektrisch veld. Ten slotte worden aerosolkenmerken zoals grootte, getalconcentratie en massa online gecontroleerd. Een nadeel is dat continue flow systemen complexer zijn in vergelijking met cloudsystemen. Daarom is het belangrijk om voorbereidende experimenten uit te voeren die zich richten op de deeltjeskenmerken van de aerosol en de geleverde dosis op de insert. De initiële startconcentratie van de deeltjes en de AES-instellingen kunnen vervolgens worden aangepast om de gewenste dosis op de cellen te bereiken33. Afhankelijk van het type deeltjes dat wordt getest, kan de aerosolgeneratiemethode verschillen. Het gebruik van elektrostatische afzetting hangt af van het deeltjestype en werkt het beste voor metaaldeeltjes. Voor deeltjes met een positieve oppervlaktelading moet een negatief elektrostatisch veld worden aangebracht en vice versa.
Selectie van blootstellingsconcentraties kan moeilijk zijn voor elk experiment tussen lucht en vloeistof. Voor de DQ12-blootstellingen was het doel om na 3 weken blootstelling, 5 dagen per week, 4 uur per dag een totale cumulatieve dosis van 1 μg/cm2 te bereiken. Deze dosis is vergelijkbaar met doses die een effect veroorzaakten in vivo21,25,27,32,33. Bij het uitvoeren van de blootstellingen was er enige variatie tussen verschillende blootstellingsdagen. Hoewel de werkelijk afgezette dosis van 1,6 μg/cm2 hoger is dan de 1 μg/cm2 waarvoor was gestreefd, was de dosis mogelijk te laag om effecten in het Calu-3-model waar te nemen. Er werden slechts kleine verschillen in TEER, levensvatbaarheid en cytokinerespons waargenomen tussen de blootstelling aan schone lucht en de blootstelling aan DQ12, en deze verschillen waren niet statistisch significant. Een verklaring voor de constatering dat blootstelling aan DQ12 gedurende 3 weken geen significante effecten in de Calu-3-cellen heeft veroorzaakt, is dat macrofagen ontbraken in het Calu-3-model. Mogelijk produceren macrofagen na de opname van DQ12 pro-inflammatoire cytokinen die Calu-3-cellen kunnen beïnvloeden. Een andere verklaring is dat de DQ12-batch die voor de experimenten werd gebruikt, niet zo reactief was als verwacht. Bij gebruik van LPS als positieve controlestof vertoont Calu-3 wel een respons, gemeten aan de hand van een toename van de LDH-afgifte en een toename van de TNF-α afgifte. Dit geeft aan dat het model toxiciteit kan detecteren.
Het Calu-3 celmodel heeft veel voordelen, zoals besproken in de resultatensectie. Bovendien, wanneer gekweekt voor een langere tijd bij de ALI, de Calu-3 cellen kunnen groeien trilharen / cilia-achtige structuren13 en produceren slijm11,12,13. Ondanks deze voordelen heeft het model beperkingen met betrekking tot de fysiologische relevantie ervan. De Calu-3 cellijnen zijn afkomstig van een adenocarcinoom, terwijl 16HBE en BEAS-2B afkomstig zijn van gezond weefsel. Helaas zijn de laatste twee niet geschikt voor herhaalde ALI-blootstelling, omdat ze na verloop van tijd geen stabiele monolaag blijven. Een andere beperking van het Calu-3-model is dat het slechts één celtype vertegenwoordigt. In de menselijke long zijn meerdere celtypen aanwezig die op elkaar inwerken en anders reageren op blootstelling. Ingeademde deeltjes zullen zich in verschillende gebieden van de longen afzetten, afhankelijk van hun aerodynamische grootte. Dit is waar de deeltjes in contact komen met de epitheelcelbarrière, zoals nagebootst door het Calu-3-model. In de menselijke long worden alveolaire macrofagen aangetrokken tot de deeltjes, overspoelen ze en verwijderen ze uit de longen. Macrofagen spelen ook een essentiële rol in de ontstekingsrespons op blootstelling aan deeltjes. Daarom worden inspanningen geleverd om het Calu-3-model uit te breiden door primaire macrofagen toe te voegen om de longbarrière beter na te bootsen. Het nadeel van de macrofagen is dat ze slechts ongeveer 7 dagen levensvatbaar blijven wanneer ze bovenop Calu-3-cellen bij de ALI worden gekweekt. Daarom moeten macrofagen wekelijks worden gelezen om het huidige Calu-3-model om te zetten in een cocultuurmodel. De optimalisatie van het cocultuurprotocol is momenteel aan de gang.
Gezien het bovenstaande is het Calu-3 bronchiale model een geschikt model voor herhaalde blootstelling aan aerosolen van gedeeltelijk oplosbare stoffen zoals chemicaliën uit sigarettenrook en LPS. Deze oplosbare stoffen veroorzaken significante toenames van cytokinereacties in de Calu-3 cellen. Voor het testen van onoplosbare deeltjes zoals dieseluitlaat en DQ12 is een cocultuurmodel nodig, omdat de macrofagen een cruciale rol spelen bij de inductie van effecten door blootstelling aan deeltjes.
Voor de beschreven blootstellingen werden wisselplaten met 3,0 μm poriën gebruikt. De belangrijkste reden om voor dit type insert te kiezen, is dat het mogelijk is om de translocatie van nanomaterialen te testen. Bij gebruik van kleinere poriëngrootte van 0,4 μm kunnen deeltjesagglomeraten het wisselplaatmembraan niet passeren. Het nadeel van het gebruik van een grote poriegrootte is dat de cellen een langere tijd nodig hebben om samenvloeiend te groeien en dat het moeilijker is om de morfologie van de cellen te visualiseren met behulp van lichte microscopie. Om te controleren of de cellen een samenvloeiende monolaag vormen, moet de TEER >1.000 Ω x cm2 zijn voordat een blootstelling wordt gestart.
Samen genomen is het hier gepresenteerde Calu-3 bronchiale model geschikt voor herhaalde blootstelling aan aerosolen, ten minste tot 3 weken. Het model is bestand tegen gekweekt en blootgesteld worden via een continue luchtstroom en is in staat om toxiciteit voor het bronchiale epitheel te detecteren.

De longen zijn kwetsbaar voor inademingsblootstelling aan deeltjes in de lucht. Om de potentiële toxiciteit van deeltjes in de lucht te beoordelen, is vooruitgang geboekt bij de ontwikkeling van blootstellingssystemen voor lucht-vloeistofinterface (ALI)1,2,3,4,5. ALI-blootstellingssystemen maken relevantere en realistischere blootstellingsmodellen mogelijk in vergelijking met traditionele blootstelling onder water via een kweekmedium dat de kenmerken en kinetiek van de deeltjes verandert6. De ALI-blootstellingssystemen stellen specifieke eisen aan de celcultuurmodellen, omdat de modellen cultuurmedium en dus voedingsstoffen aan de apicale kant missen. Veel celmodellen worden negatief beïnvloed door gekweekt en blootgesteld te worden aan de lucht (bijv. uitdroging) en blijven slechts enkele dagen levensvatbaar. Dit beperkt de blootstellingsomstandigheden die in deze modellen kunnen worden gebruikt: meestal worden relatief hoge concentraties binnen korte tijd als een wolk toegepast (d.w.z. druppels die deeltjes bevatten, die zich snel vestigen). Dergelijke experimentele omstandigheden weerspiegelen geen realistische langdurige blootstelling aan lage concentraties deeltjes; de relevantie van de resultaten kan dus in twijfel worden getrokken. Om deze beperkingen te overwinnen, werd het kweek- en blootstellingsprotocol voor een bronchiaal model bestaande uit de menselijke bronchiale epitheelcellijn Calu-37 geoptimaliseerd.
De meeste in vitro longmodellen die worden gebruikt voor blootstelling aan ALI bevatten andere cellijnen zoals A549, BEAS-2B en 16HBE14o- (16HBE) of primaire cellen als basis8. Deze cellijnen hebben als nadeel dat ze slechts een paar dagen levensvatbaar blijven wanneer ze bij de ALI worden gekweekt. Bovendien overgroeien sommige van deze cellijnen wanneer ze langer dan 5 dagen worden gekweekt. Ten slotte missen A549-cellen functionele nauwe verbindingen en kunnen daarom geen strakke barrière vormen die nodig is om de longen na te bootsen9,10. Primaire epitheelcellen kunnen een goede optie zijn voor BLOOTSTELLING aan ALI, omdat ze wekenlang bij de ALI kunnen worden gekweekt. Primaire cellen verschillen echter van batch tot batch, zijn moeilijker te onderhouden en zijn duurder in vergelijking met cellijnen, waardoor ze minder geschikt zijn voor toxiciteitstests en screening. Bij het vergelijken van verschillende menselijke bronchiale epitheelcellijnen (16HBE, Calu-3, H292 en BEAS-2B), voldoen alleen de Calu-3-cellen aan alle criteria die nodig zijn voor realistische, herhaalde ALI-blootstelling: ze blijven weken levensvatbaar terwijl ze bij de ALI worden gekweekt, bieden een hoge barrière-integriteit, overgroeien niet en zijn gemakkelijk te cultureren en te onderhouden. Calu-3 cellen zijn afkomstig van een adenocarcinoom en kunnen slijm produceren11,12. Er zijn inconsistenties over de vraag of de cellen trilharen11,13kunnen ontwikkelen . Calu-3-cellen zijn ook een geschikt model om respiratoire syncytiele virusinfecties (RSV) te bestuderen die ciliated airway epitheelcellen infecteren14.
Naast het celmodel wordt een geautomatiseerd blootstellingssysteem (AES) gebruikt voor de lucht-vloeistofblootstelling aan aerosolen15,16. De AES heeft het voordeel dat het een continue luchtstroom gebruikt om het celmodel bloot te stellen aan aerosolen. Dit in tegenstelling tot andere lucht-vloeistofblootstellingssystemen die gewoonlijk binnen korte tijd relatief hoge concentraties gebruiken als wolk (d.w.z. druppels die deeltjes bevatten die zich snel vestigen)17,18,19. Deze cloudsystemen weerspiegelen geen realistische langdurige blootstelling aan lage concentraties deeltjes. Door een continue luchtstroom toe te passen met behulp van de AES, kan het celmodel gedurende een langere periode worden blootgesteld aan een lage concentratie deeltjes, wat realistische blootstellingsomstandigheden weerspiegelt. Een ander voordeel ten opzichte van cloudsystemen is dat de AES de mogelijkheid heeft om deeltjeskarakteriseringsinstrumenten aan te sluiten, waardoor deeltjesgrootte, getalconcentratie en massa in de loop van de tijd kunnen worden gemeten. Een beperking van de AES is dat het relatief hoge luchtstromen gebruikt tussen 10 ml/min en 100 ml/min.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01 M NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M (x10) PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;,7&#8217;-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab141525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated exposure station</td>
			<td>Vitrocell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell proliferation reagent WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity detection kit LDH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DQ12</td>
			<td>IOM</td>
			<td></td>
			<td>nanomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Ready-SET-Go</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>88-8086-86, 88-7399-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments Inc., FL, USA</td>
			<td>EVOM2-STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>758093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow splitter</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>model 3708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein diacetate (F-DA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>14175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>MFC, Bronkhorst, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (analytical grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Sartorius, Goettingen, Germany</td>
			<td>ME-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>41090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMPS</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray nozzle</td>
			<td>Schlick, Coburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon filters</td>
			<td>Pall</td>
			<td>R2PJ46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEOM</td>
			<td>Rupprecht &#38; Patashnick NY, USA</td>
			<td>series 1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>690175, 658175, 660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460, 3462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an air-liquid interface bronchial epithelial model for realistic, repeated inhalation exposure to airborne particles for toxicity testing

Voor toxiciteitstests van deeltjes in de lucht zijn blootstellingssystemen voor lucht-vloeistofinterface (ALI) ontwikkeld voor in vitro tests om realistische blootstellingsomstandigheden na te bootsen. Dit stelt specifieke eisen aan de celcultuurmodellen. Veel celtypen worden negatief beïnvloed door blootstelling aan lucht (bijv. uitdroging) en blijven slechts enkele dagen levensvatbaar. Dit beperkt de blootstellingsomstandigheden die in deze modellen kunnen worden gebruikt: meestal worden relatief hoge concentraties toegepast als een wolk (d.w.z. druppels die deeltjes bevatten, die zich snel vestigen) binnen een korte periode. Dergelijke experimentele omstandigheden weerspiegelen geen realistische langdurige blootstelling aan lage concentraties deeltjes. Om deze beperkingen te overwinnen, werd het gebruik van een menselijke bronchiale epitheelcellijn onderzocht. Deze cellen kunnen enkele weken onder ALI-omstandigheden worden gekweekt met behoud van een gezonde morfologie en een stabiele monolaag met nauwe verbindingen. Bovendien is dit bronchiale model geschikt voor het testen van de effecten van herhaalde blootstelling aan lage, realistische concentraties deeltjes in de lucht met behulp van een ALI-blootstellingssysteem. Dit systeem maakt gebruik van een continue luchtstroom in tegenstelling tot andere ALI-blootstellingssystemen die één verneveling gebruiken die een wolk produceert. Daarom is het continue stroomsysteem geschikt voor herhaalde en langdurige blootstelling aan deeltjes in de lucht, terwijl de deeltjeskenmerken, de blootstellingsconcentratie en de geleverde dosis voortdurend worden gecontroleerd. Samen is dit bronchiale model, in combinatie met het continue stroomblootstellingssysteem, in staat om realistische, herhaalde inhalatieblootstellingsomstandigheden na te bootsen die kunnen worden gebruikt voor toxiciteitstests.

Dit artikel biedt een methode voor het cultiveren en blootstellen van menselijke bronchiale epitheelcellen bij de ALI die realistische, herhaalde inhalatieblootstellingsomstandigheden nabootst die kunnen worden gebruikt voor toxiciteitstests. Kenmerken van zowel het celmodel als van het blootstellingssysteem zijn essentieel voor het bereiken van een realistisch inhalatieblootstellingsmodel dat kan worden gebruikt voor herhaalde blootstellingen. De resultaten van deze kenmerken worden hieronder weergegeven.
Vereisten en selectie van celmodel
Bij het kiezen van een geschikt celmodel moet rekening worden gehouden met de volgende kenmerken:
<ol><li>Het celmodel moet een samenvloeiende monolaag kunnen vormen met functionerende nauwe verbindingen om de longbarrière na te bootsen.</li>
<li>Het celmodel moet optimale prestaties vertonen wanneer het herhaaldelijk wordt blootgesteld aan geconditioneerde (temperatuur en vochtigheid) lucht.</li>
<li>Het celmodel moet reageren op een blootstelling.</li>
</ol>Deze studie begon met vier verschillende menselijke bronchiale epitheelcellijnen: 16HBE, Calu-3, H292 en BEAS-2B. Deze worden allemaal veel gebruikt voor toxiciteitstests van nanomaterialen en chemicaliën. Van de vier cellijnen voldeden alleen de Calu-3 cellen aan alle bovenstaande eisen. De cellen vormden een monolaag met nauwe verbindingen (figuur 3) die in de loop van de tijd een stabiele barrière bleef, zoals gemeten door TEER, terwijl de andere cellijnen ofwel geen barrière vormden of een daling van de barrièrefunctie vertoonden wanneer ze bij de ALI werden gekweekt (figuur 4). Bovendien neigden H292 en BEAS-2B om te overgroeien tot meerdere cellagen wanneer ze voor een langere periode werden gekweekt. Traditionele ondergedompelde celcultiuring en ALI-culturing verschilden sterk, omdat bij de ALI voedingsstoffen alleen beschikbaar waren aan de basolaterale kant en de cellen werden blootgesteld aan droge omstandigheden aan de apicale kant. Deze aandoeningen kunnen stress veroorzaken voor de celmodellen, die kunnen worden waargenomen door de levensvatbaarheid van de cel in de loop van de tijd te meten. Cellijnen 16HBE, H292 en BEAS-2B vertoonden allemaal een verhoogde LDH-afgifte bij kweek bij de ALI, terwijl Calu-3-cellen slechts een lichte LDH-afgifte vertoonden (figuur 5).
Vervolgens werd de reactie van het Calu-3 model op stoffen getest. Als positieve controlestof werd LPS via verneveling toegediend aan de apicale kant van het model. De afgezette dosis was 0,25 μg/cm2. De Calu-3-cellen vertoonden een reactie op lipopolysaccharide (LPS) door een toename van de LDH-afgifte en in de afgifte van tumornecrosefactor alfa (TNF-α) (figuur 6).
Ten slotte werd de Calu-3 monolaag blootgesteld aan kwartssilicium (DQ12) nanomaterialen (IOM, Edinburgh). Kristallijn silica kan silicose veroorzaken en kan ook longtumoren veroorzaken. Daarom heeft het Internationaal Agentschap voor kankeronderzoek (IARC) kristallijn silica geclassificeerd als kankerverwekkend voor de mens van groepI 20. Het werkingsmechanisme van kristallijn silica wordt verondersteld te zijn via de inductie van aanhoudende ontsteking veroorzaakt door het reactieve oppervlak21,22,23. Verschillende in vivo studies bij zowel ratten als muizen melden de inductie van ontstekings - en histopathologische veranderingen, waaronder tumoren en fibrose, na inademing blootstelling aan kristallijn silica24,25,26,27,28,29. Deze effecten worden allemaal waargenomen na herhaalde blootstelling en/of langdurige follow-up. Het Calu-3-model werd gebruikt om te onderzoeken of de waarnemingen uit de in vivo studies konden worden nagebootst met behulp van een in vitro model dat herhaaldelijk bij de ALI kon worden blootgesteld.
Calu-3 cellen werden gedurende 3 opeenvolgende weken, 5 dagen per week, 4 uur per dag blootgesteld aan DQ12. De gedeponeerde dosis werd gemeten met behulp van een QCM. De gemiddelde gedeponeerde dosis was 120 ng/cm2 per dag, met een cumulatieve dosis van 1,6 μg/cm2, vergelijkbaar met de doses die een effect in vivo induceren. Andere deeltjeskarakteristieken zijn weergegeven in tabel 1. Na 3 weken blootstelling veroorzaakte DQ12 geen significante effecten op de afgifte van TEER, cel levensvatbaarheid en monocyt chemoattractant eiwit 1 (MCP-1), vergeleken met de schone luchtregelaars (figuur 7). Naarmate meer toxiciteit van DQ12 werd verwacht op basis van de in vivo gegevens, werd de reactiviteit van de deeltjes gecontroleerd met behulp van een acellulaire test volgens het protocol dat was geoptimaliseerd binnen het EU-project GRACIOUS (deliverable 5.3). De reactiviteit van de DQ12-batch was lager dan verwacht (figuur 8), ordes van grootte lager in vergelijking met de positieve controledeeltjes koolstofzwart (CB). Dit gebrek aan reactiviteit kan de afwezigheid van een toxiciteitsreactie in het Calu-3-model verklaren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig01.jpg"> Figuur 1: Het geautomatiseerde blootstellingsstation (AES). De linker figuur toont de buitenkant van de kast met het aanraakscherm. De AES heeft drie niveaus met blootstellingsmodules: het hoogste niveau voor blootstelling aan schone lucht en het middelste en onderste niveau voor blootstelling aan aerosolen. De rechter figuur toont de belichtingsmodule waarin inserts met cellen worden geplaatst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig02.jpg"> Figuur 2: Schematische weergave van de belichtingsinstelling. Van links naar rechts: 1) de ENM-ophanging die via een peristaltische pomp op het spuitmondstuk is aangesloten; 2) Met behulp van perslucht vernevelt het spuitmondstuk de ENM-suspensie en via een mengkamer worden de aerosolen naar de AES geleid; 3) Vlak voor het betreden van de AES zijn aerosolkarakteriseringsinstrumenten verbonden: SMPS, OPS, CPC en TEOM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig03.jpg"> Figuur 3: Representatief beeld van Calu-3 cellen na 10 dagen cultiveren op de lucht-vloeistof interface (ALI). Fluorescentie microscopie afbeelding van Calu-3 cellen na culturing bij de ALI gedurende 10 dagen. Strak verbindingseiwit ZO-1 is groen gekleurd, kernen van de cellen zijn blauw gekleurd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig04.jpg"> Figuur 4: Transepithelial electrical resistance (TEER) van vier verschillende cellijnen gedurende een kweekperiode van 21 dagen. TEER-waarden van 16HBE, Calu-3, H292 en BEAS-2B wanneer ze gedurende 21 dagen worden gekweekt: de eerste 7 dagen ondergedompeld, gevolgd door 14 dagen bij de ALI. TEER-waarden werden gecorrigeerd voor de achtergrondweerstand van de wisselplaat en vermenigvuldigd met het oppervlak van de wisselplaat. De symbolen en foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde waarde en standaarddeviatie van zes inserts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig05.jpg"> Figuur 5: LDH-afgifte van vier verschillende cellijnen gedurende een kweekperiode van 21 dagen. LDH release van 16HBE, Calu-3, H292 en BEAS-2B wanneer gekweekt gedurende 21 dagen: 7 dagen ondergedompeld, gevolgd door 14 dagen in de ALI. De getoonde LDH-waarden zijn relatief ten opzichte van de maximale LDH-afgifte per celtype. De symbolen en foutbalken vertegenwoordigen de gemiddelde waarde en standaardafwijking van vijf inserts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig06.jpg"> Figuur 6: Cellulaire effecten in Calu-3 cellen blootgesteld aan LPS. Calu-3 cellen werden via cloudneveling blootgesteld aan 0,25 μg/cm2 LPS. (A) De WST-1 conversie. (B) LDH-release. (C) TNF-α release na lps-blootstelling. De symbolen en foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde waarden en standaardafwijkingen van drie wisselplaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig07.jpg"> Figuur 7: Cellulaire effecten in Calu-3 cellen blootgesteld aan DQ12 nanomaterialen. Calu-3 cellen werden gedurende 3 weken (4 uur per dag, 5 dagen per week) blootgesteld aan DQ12 nanomaterialen, ongeveer 120 ng/cm2 per dag, cumulatieve dosis van 1,6 μg/cm2. (A) TEER-waarden. (B) LDH-release. (C) MCP-1 release na blootstelling aan DQ12. Alle symbolen en foutbalken vertegenwoordigen gemiddelde waarden en standaardafwijkingen van drie wisselplaten voor de besturingselementen en zes wisselplaten voor de DQ12-belichting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig08.jpg"> Figuur 8: Acellulaire reactiviteit van DQ12. DQ12 werd geïncubeerd met een 2ʹ,7ʹ-Dichlorofluoresceïne Diacetaat (DCFH-DA) sonde om de oppervlaktereactiviteit te detecteren. Als positieve controle werden koolstofzwarte (CB) deeltjes opgenomen. In vergelijking met CB heeft DQ12 een zeer lage oppervlaktereactiviteit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61210/61210fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Deeltjesmassa (μg/m3)</td>
			<td>Deeltjesnummer (#/cm3)</td>
			<td>Mobiliteitsdeeltjegrootte (nm)</td>
			<td>Geometrische standaarddeviatie</td>
			<td>Optische deeltjesgrootte (μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2969 (418)</td>
			<td>83983 (10215)</td>
			<td>66.6</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1.1 (1.3)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: DQ12 blootstellingskenmerken. Waarden worden weergegeven als gemiddeld met standaarddeviatie tussen haakjes.

Watch this Scientific Journal Video about An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing at JoVE.com

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

Beschreven is de celkweek en blootstellingsmethode van een in vitro bronchiaal model voor realistische, herhaalde inhalatieblootstelling aan deeltjes voor toxiciteitstests.

Een lucht-vloeistof interface bronchiale epitheel model voor realistische, herhaalde inhalatie blootstelling aan deeltjes in de lucht voor toxiciteit testen

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Testen Nicotine Tolerantie in Bladluizen Met behulp van een kunstmatige dieet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Using an EEG-Based Brain-Computer Interface for Virtual Cursor Movement with BCI2000

Met behulp van een EEG-Based Brain-Computer Interface voor virtuele cursor Movement met BCI2000

A brain-computer interface (BCI) functions by translating a neural signal, such as the electroencephalogram (EEG), into a signal that can be used to ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inademing blootstellingen

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Kweken van Menselijke neus epitheelcellen op de Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Procedure Om de efficiëntie van Flocculanten Evalueer voor de opheffing van de gedispergeerde deeltjes van plantenextracten

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimale Lentivirus Productie en Cultuur van de Cel voorwaarden die nodig zijn om succesvol te transduceren primaire humane bronchiale epitheelcellen

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Experimentele Protocol voor het gebruik van Drosophila als een ongewervelde modelsysteem voor toxiciteitstests in het laboratorium

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

Protocollen voor het testen van de toxiciteit van roman insecticide chemicaliën aan muggen

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Glomerular Outgrowth als een Ex Vivo Assay om trajecten betrokken bij pariëtale epitheelcelactivering te analyseren

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...