Name: measuring the confluence of ipscs using an automated imaging system
Uploaded: 2020-06-10T13:30:00
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Lo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione Bambino Gesù e Ricerca Corrente a C.C.  Si ringraziano il Dott. Enrico Bertini (Dipartimento di Neuroscienze, Unità di Malattie Neuromuscolari e Neurodegenerative, Laboratorio di Medicina Molecolare, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù), la Dott.ssa Stefania Petrini (Centro di Microscopia Confocale, Laboratori di Ricerca, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù), Giulia Pericoli (Dipartimento di Oncoematologia, Terapia Genica e Cellulare, Ospedale di Ricerca Pediatrica Bambino Gesù) e Roberta Ferretti (Dipartimento di Oncoematologia, Terapia Genica e Cellulare, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù) per le discussioni scientifiche e l'assistenza tecnica. Maria Vinci è destinataria di una borsa di studio "Children with Cancer UK".

1. Rivestimento di 96 piastre di pozzetto
NOTA: Diversi rivestimenti sono stati testati nella stessa piastra ma pozzetti separati (vedere File supplementare).
<ol><li>Diluire il Matrigel 1:100 in DMEM. Aggiungere 100 μL per pozzetto alle piastre da 96 pozzetti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere la soluzione e lavare i pozzetti con 100 μL di DMEM due volte.</li>
	<li>Laminina diluita (20 μg/mL, LN-521) in PBS (con calcio e magnesio). Ag...

<ol>
	<li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aged+iPSCs+display+an+uncommon+mitochondrial+appearance+and+fail+to+undergo+in+vitro+neurogenesis.">Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis.</a> Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li><li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen,+laminin,+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma.">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195 (2014).</li><li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521+based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions.">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li><li>Laperle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-5+Laminin+Synthesized+by+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Promotes+Self-Renewal.">&#945;-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).</li><li>Albalushi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+521+stabilizes+the+pluripotency+expression+pattern+of+human+embryonic+stem+cells+initially+derived+on+feeder+cells.">Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells.</a> Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-derived+laminin-511+promotes+midbrain+dopaminergic+neuron+survival+and+differentiation+through+YAP.">Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP.</a> Science Signaling. 10 (493), (2017).</li><li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation,+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).</li><li>Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+slow+cooling+cryopreservation+for+human+pluripotent+stem+cells.">Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells.</a> Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).</li><li>Bergstr&#246;m, R., Str&#246;m, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Xeno-free culture of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vitronectin+is+a+functionally+defined+substrate+that+supports+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+via+alphavbeta5+integrin.">Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin.</a> Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+vitronectin+concentration+and+surface+properties+on+the+stable+propagation+of+human+embryonic+stem+cells.">Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells.</a> Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).</li><li>Prowse, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+on+recombinant+vitronectin+in+ascorbate+free+media.">Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media.</a> Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).</li><li>Rowland, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+integrins+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+growth+on+Matrigel+and+vitronectin.">Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin.</a> Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).</li><li>Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+on+amniotic+fluid+and+plasma+fibronectins.">Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins.</a> Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).</li><li>Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+activation+by+dithiothreitol+or+Mn2++induces+a+ligand-occupied+conformation+and+exposure+of+a+novel+NH2-terminal+regulatory+site+on+the+beta1+integrin+chain.">Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain.</a> Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).</li><li>Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+wound+healing+assay+in+an+epithelial-mesenchymal+co-culture+system.">Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system.</a> Wound Repair &amp; Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).</li><li>Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder+layer-and+serum-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).</li><li>Vaheri, A., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+molecular+weight,+cell+surface-associated+glyco-protein+(fibronectin)+lost+in+malignant+transformation.">High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).</li><li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+fibrillogenesis,+a+cell-mediated+matrix+assembly+process.">Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process.</a> Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).</li><li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states:+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits.">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).</li><li>Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fibrillogenesis:+fibronectin,+integrins,+and+minor+collagens+as+organizers+and+nucleators.">Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).</li><li>Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tightening+the+connections+between+cadherins+and+fibronectin+matrix.">Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix.</a> Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+The+evolution+of+human+pluripotent+stem+cell+culture:+from+feeder+cells+to+synthetic+coatings.">Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings.</a> Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Vigilante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Extrinsic+versus+Intrinsic+Drivers+of+Variation+in+Cell+Behavior+in+Human+iPSC+Lines+from+Healthy+Donors.">Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors.</a> Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).</li></ol>

L'utilizzo delle iPSC per la modellizzazione delle malattie e il futuro screening farmacologico insieme alla loro possibile applicazione in medicina di precisione la rende una tecnologia di grande rilevanza e per questo motivo riteniamo che sia necessario comprendere chiaramente la condizione di coltura in vitro che meglio assomiglia alla situazione fisiologica delle cellule staminali embrionali. In questo contesto, abbiamo testato diversi rivestimenti ECM utilizzando iPSC wild type al fine di comprendere le condizioni c...

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono ottenute da cellule somatiche e possono essere differenziate in diversi tipi di cellule. Sono spesso utilizzati come sistema per modellare la patogenesi della malattia o eseguire lo screening dei farmaci e offrono anche il potenziale per essere utilizzati nel contesto della medicina personalizzata. Poiché le iPSC hanno un grande potenziale, è importante caratterizzarle completamente per l'uso come sistema modello affidabile. In precedenza abbiamo dimostrato l'importanza della crescita di iPSC in un ambiente ipossico poiché queste cellule si basano sulla glicolisi e un ambiente aerobico può causare uno squilibrio redox1. Le iPSC sono anche vulnerabili ad altre condizioni di coltura, in particolare all'ambiente extracellulare. L'ottimizzazione delle condizioni colturali è una questione chiave per mantenerle sane e proliferanti. Una coltura iPSC sana porterà a cellule differenziate sane che generalmente sono l'endpoint del modello utilizzato per comprendere le caratteristiche molecolari, cellulari e funzionali di specifici disturbi umani o processi cellulari.
In questo studio, è stato utilizzato un semplice protocollo per testare la confluenza di iPSC utilizzando diverse condizioni di rivestimento in pozzetti separati. Le iPSC richiedono uno strato di alimentazione di fibroblasti embrionali murini (MEF) per attaccarsi correttamente, ma la coesistenza di iPSC e MEF rende difficile eseguire analisi come l'estrazione di RNA o proteine poiché sono presenti due popolazioni di cellule. Al fine di evitare lo strato di alimentazione, diverse proteine appartenenti alla matrice extracellulare (ECM) sono state utilizzate per ricreare la nicchia cellulare naturale e per avere una coltura di iPSC priva di alimentatore. In particolare, Matrigel è un preparato di membrana basale solubilizzato estratto dal sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), arricchito in proteine della matrice extracellulare (laminina, collagene IV, eparan solfato proteoglicani, entactin/nidogeno e fattori di crescita)2,3. Le altre condizioni di rivestimento utilizzate sono invece proteine purificate con rilevanza nota nella costruzione delle ECM: la laminina-521 è nota per essere secreta dalle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) nella massa cellulare interna dell'embrione ed è una delle laminine più comuni nell'organismo dopo la nascita 4,5,6,7,8,9, 10,11; la vitronectina è una matrice di coltura cellulare xeno-free nota per supportare la crescita e la differenziazione di hPSC 12,13,14,15,16; la fibronectina è una proteina ECM importante per lo sviluppo dei vertebrati e l'attaccamento e il mantenimento delle cellule staminali embrionali in uno stato pluripotente 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Poiché sono disponibili diverse condizioni di rivestimento, le confrontiamo in termini di effetto sulla confluenza delle iPSC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1124px;" width="1123">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:589px;">10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile</td>
			<td style="width:281px;">Corning</td>
			<td style="width:77px;">4488</td>
			<td style="width:176px;">Tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td>Tool</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">1x PBS (With Ca2+; Mg2+)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14040133</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">1x PBS (without Ca2+; Mg2+)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487</td>
			<td>Tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655090</td>
			<td>Support</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture plate, 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Support</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium- high glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED4SS-500g</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A15960</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FAST - READ 102</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>BVS100</td>
			<td>Tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>FC010</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">H2O</td>
			<td></td>
			<td>MILLIQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33342</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin 521</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>77003</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS25030081</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>354277</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:589px;">Mouse embryonic fibroblasts (MEF)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A24903</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTESR1 Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTESR1 Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vitronectin</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7180</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the confluence of ipscs using an automated imaging system

Questo studio si concentra sulla comprensione di come la crescita di iPSC su diversi substrati di rivestimento ECM può influenzare la confluenza cellulare. È stato stabilito un protocollo per valutare la confluenza di iPSC in tempo reale senza la necessità di contare le cellule in sospensione monocellulare per evitare qualsiasi perturbazione della crescita. Un sistema di analisi delle immagini ad alto contenuto è stato utilizzato per valutare la confluenza di iPCS su 4 diversi ECM nel tempo in modo automatizzato. Sono state utilizzate diverse impostazioni di analisi per valutare la confluenza cellulare di iPSC aderenti e solo una leggera differenza (a 24 e 48 ore con laminina) è stata osservata se è stata applicata una maschera al 60, 80 o 100%. Mostriamo anche che la laminina porta alla migliore confluenza rispetto a Matrigel, vitronectin e fibronectina.

In questo studio, abbiamo studiato la confluenza delle iPSC quando coltivate in diverse condizioni di rivestimento. Utilizzando un citometro, siamo stati in grado di ottenere risultati prontamente informativi in triplice copia in 5 giorni. Poiché le iPSC difficilmente si attaccano ai vasi di plastica ed è necessario un rivestimento per supportare la loro proliferazione, abbiamo deciso di monitorare la confluenza delle iPSC umane in quanto è indicativa della salute della coltura cellulare e potrebbe riflettersi sul lor...

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Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

L'obiettivo del protocollo è confrontare diverse condizioni di rivestimento della matrice extracellulare (ECM) per valutare in che modo il rivestimento differenziale influisce sul tasso di crescita delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). In particolare, miriamo a creare le condizioni per ottenere una crescita ottimale delle colture iPSC.

Misurazione della confluenza di iPSC utilizzando un sistema di imaging automatizzato.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

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Un metodo semplice per l&#39;imaging Arabidopsis Foglie Utilizzando Perfluorodecalin come Media Imaging infiltrativa

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Misurare gli effetti dei batteri su<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento utilizzando un saggio di ritenzione dell&#39;uovo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studiando la proteina del sistema di controllo di qualità di<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso Cellulare Imaging a temperatura controllata

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Un rapido protocollo automatizzato per Fibra muscolare Analisi Popolazione nel ratto muscolari sezioni trasversali utilizzando una catena pesante della miosina immunoistochimica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder ALLIGATOR

Misura flessibile dei reporter bioluminescenti utilizzando un automatizzato Luciferase longitudinale Imaging ottimizzato di Gas e temperatura registratore (ALLIGATOR)