Name: measuring the confluence of ipscs using an automated imaging system
Uploaded: 2020-06-10T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System at JoVE.com

Çalışma, Fondazione Bambino Gesù ve Ricerca Corrente'den (İtalya Sağlık Bakanlığı) C.C.'ye yapılan hibelerle desteklendi.  Dr. Enrico Bertini'ye (Nörobilim Dalı, Nöromüsküler ve Nörodejeneratif Hastalıklar Birimi, Moleküler Tıp Laboratuvarı, Bambino Gesù Çocuk Araştırma Hastanesi), Dr. Stefania Petrini'ye (Konfokal Mikroskopi Çekirdek Tesisi, Araştırma Laboratuvarları, Bambino Gesù Çocuk Araştırma Hastanesi), Giulia Pericoli'ye (Onko-hematoloji, Gen ve Hücre Terapisi Bölümü, Çocuk Araştırma Hastanesi Bambino Gesù) teşekkür ederiz. ve Roberta Ferretti (Onko-hematoloji, Gen ve Hücre Terapisi Bölümü, Çocuk Araştırma Hastanesi Bambino Gesù) bilimsel tartışmalar ve teknik yardım için. Maria Vinci, "Kanserli Çocuklar İngiltere bursu" sahibidir.

1. 96 kuyu plakalarının kaplanması
NOT: Farklı kaplamalar aynı plakada ancak ayrı kuyucuklarda test edilmiştir ( Ek Dosyaya bakınız).
<ol><li>DMEM'de Matrigel 1:100'ü seyreltin. 96 kuyucuk plakasına kuyu başına 100 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Bunu takiben, çözeltiyi çıkarın ve kuyucukları iki kez 100 μL DMEM ile yıkayın.</li>
	<li>PBS'de laminini (20 μg / mL, LN-521) seyreltin (kalsiyum ve magnezyum ile). Kuyuya 100...

<ol>
	<li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aged+iPSCs+display+an+uncommon+mitochondrial+appearance+and+fail+to+undergo+in+vitro+neurogenesis.">Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis.</a> Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li><li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen,+laminin,+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma.">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521/E-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment.">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195 (2014).</li><li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521+based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions.">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li><li>Laperle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-5+Laminin+Synthesized+by+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Promotes+Self-Renewal.">&#945;-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).</li><li>Albalushi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+521+stabilizes+the+pluripotency+expression+pattern+of+human+embryonic+stem+cells+initially+derived+on+feeder+cells.">Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells.</a> Stem Cell International. 2018, 7127042 (2018).</li><li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Niche-derived+laminin-511+promotes+midbrain+dopaminergic+neuron+survival+and+differentiation+through+YAP.">Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP.</a> Science Signaling. 10 (493), (2017).</li><li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation,+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).</li><li>Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+slow+cooling+cryopreservation+for+human+pluripotent+stem+cells.">Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells.</a> Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).</li><li>Bergstr&#246;m, R., Str&#246;m, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+culture+of+human+pluripotent+stem+cells.">Xeno-free culture of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).</li><li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+vitronectin+is+a+functionally+defined+substrate+that+supports+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+via+alphavbeta5+integrin.">Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin.</a> Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+vitronectin+concentration+and+surface+properties+on+the+stable+propagation+of+human+embryonic+stem+cells.">Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells.</a> Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).</li><li>Prowse, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+on+recombinant+vitronectin+in+ascorbate+free+media.">Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media.</a> Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).</li><li>Rowland, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+integrins+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+growth+on+Matrigel+and+vitronectin.">Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin.</a> Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).</li><li>Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+on+amniotic+fluid+and+plasma+fibronectins.">Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins.</a> Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).</li><li>Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+activation+by+dithiothreitol+or+Mn2++induces+a+ligand-occupied+conformation+and+exposure+of+a+novel+NH2-terminal+regulatory+site+on+the+beta1+integrin+chain.">Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain.</a> Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).</li><li>Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+wound+healing+assay+in+an+epithelial-mesenchymal+co-culture+system.">Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system.</a> Wound Repair &amp; Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).</li><li>Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder+layer-and+serum-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells.">Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).</li><li>Vaheri, A., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+molecular+weight,+cell+surface-associated+glyco-protein+(fibronectin)+lost+in+malignant+transformation.">High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).</li><li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+fibrillogenesis,+a+cell-mediated+matrix+assembly+process.">Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process.</a> Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).</li><li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states:+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits.">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).</li><li>Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fibrillogenesis:+fibronectin,+integrins,+and+minor+collagens+as+organizers+and+nucleators.">Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).</li><li>Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tightening+the+connections+between+cadherins+and+fibronectin+matrix.">Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix.</a> Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).</li><li>Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+The+evolution+of+human+pluripotent+stem+cell+culture:+from+feeder+cells+to+synthetic+coatings.">Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings.</a> Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Vigilante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Extrinsic+versus+Intrinsic+Drivers+of+Variation+in+Cell+Behavior+in+Human+iPSC+Lines+from+Healthy+Donors.">Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors.</a> Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).</li></ol>

Hastalık modelleme ve gelecekteki ilaç taraması için iPSC'lerin kullanımı, hassas tıpta olası uygulamaları ile birlikte onu büyük önem taşıyan bir teknoloji haline getirmektedir ve bu nedenle embriyonik kök hücrelerin fizyolojik durumuna daha iyi benzeyen in vitro kültürleme durumunu açıkça anlamanın gerekli olduğuna inanıyoruz. Bu bağlamda, hücrelerin sağlıklı ve farklılaşmamış bir durumda kalmasına izin veren koşulları anlamak için vahşi tip iPSC'ler kullanarak farklı ECM kaplamal...

İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) somatik hücrelerden elde edilir ve farklı hücre tiplerine ayrılabilir. Genellikle hastalık patogenezini modellemek veya ilaç taraması yapmak için bir sistem olarak kullanılırlar ve ayrıca kişiselleştirilmiş tıp bağlamında kullanılma potansiyeli sunarlar. iPSC'ler büyük bir potansiyele sahip olduklarından, güvenilir bir model sistemi olarak kullanılmak üzere onları tam olarak karakterize etmek önemlidir. Daha önce hipoksik bir ortamda iPSC'lerin yetiştirilmesinin önemini göstermiştik, çünkü bu hücreler glikolize dayanır ve aerobik bir ortam redoks dengesizliğine neden olabilir1. iPSC'ler ayrıca diğer kültür koşullarına, özellikle de hücre dışı ortama karşı savunmasızdır. Kültür koşullarının optimizasyonu, onları sağlıklı ve çoğalır tutmak için kilit bir konudur. Sağlıklı bir iPSC kültürü, genellikle belirli insan bozukluklarının veya hücresel süreçlerin moleküler, hücresel ve fonksiyonel özelliklerini anlamak için kullanılan modelin son noktası olan sağlıklı farklılaşmış hücrelere yol açacaktır.
Bu çalışmada, ayrı kuyucuklarda farklı kaplama koşulları kullanarak iPSC'lerin birleşmesini test etmek için basit bir protokol kullanılmıştır. iPSC'ler, düzgün bir şekilde bağlanması için bir murin embriyonik fibroblast (MEF) besleyici tabakasına ihtiyaç duyar, ancak iPSC'lerin ve MEF'in bir arada bulunması, iki hücre popülasyonu bulunduğundan RNA veya protein ekstraksiyonu gibi analizlerin yapılmasını zorlaştırır. Besleyici tabakadan kaçınmak için, doğal hücre nişini yeniden oluşturmak ve besleyicisiz iPSC kültürüne sahip olmak için hücre dışı matrise (ECM) ait farklı proteinler kullanılmıştır. Özellikle, Matrigel, hücre dışı matriks proteinleri (yani laminin, kollajen IV, heparan sülfat proteoglikanlar, entactin / nidogen ve büyüme faktörleri) ile zenginleştirilmiş Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkomundan ekstrakte edilen çözünür bir bazal membran preparatıdır 2,3. Kullanılan diğer kaplama koşulları, ECM'lerin yapımında bilinen alakası olan saflaştırılmış proteinlerdir: laminin-521'in, embriyonun iç hücre kütlesindeki insan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) tarafından salgılandığı bilinmektedir ve doğumdan sonra vücuttaki en yaygın lamininlerden biridir 4,5,6,7,8,9, 10,11; vitronektin, hPSC 12,13,14,15,16'nın büyümesini ve farklılaşmasını desteklediği bilinen kseno içermeyen bir hücre kültürü matrisidir; fibronektin, omurgalı gelişimi ve embriyonik kök hücrelerin pluripotent bir durumda bağlanması ve bakımı için önemli bir ECM proteinidir 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Farklı kaplama koşulları mevcut olduğundan, bunları iPSC'lerin birleşmesi üzerindeki etkileri açısından karşılaştırıyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1124px;" width="1123">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:589px;">10 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile</td>
			<td style="width:281px;">Corning</td>
			<td style="width:77px;">4488</td>
			<td style="width:176px;">Tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td>Tool</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">1x PBS (With Ca2+; Mg2+)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14040133</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">1x PBS (without Ca2+; Mg2+)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Stripette Serological Pipets, Polystyrene, Individually Paper/Plastic Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4487</td>
			<td>Tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture microplate, 96 WELL, PS, F-Bottom</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655090</td>
			<td>Support</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture plate, 6 well</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>Support</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium- high glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5671</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED4SS-500g</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A15960</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FAST - READ 102</td>
			<td>Biosigma</td>
			<td>BVS100</td>
			<td>Tool</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fibronectin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>FC010</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">H2O</td>
			<td></td>
			<td>MILLIQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>33342</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin 521</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>77003</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>LS25030081</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>354277</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:589px;">Mouse embryonic fibroblasts (MEF)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A24903</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTESR1 Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85851</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTESR1 Supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85852</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phalloidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vitronectin</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7180</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the confluence of ipscs using an automated imaging system

Bu çalışma, farklı ECM kaplama substratları üzerinde büyüyen iPSC'lerin hücre birleşmesini nasıl etkileyebileceğini anlamaya odaklanmaktadır. Herhangi bir büyüme bozulmasını önlemek için tek hücre süspansiyonundaki hücreleri saymaya gerek kalmadan iPSC birleşmesini gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için bir protokol oluşturulmuştur. Zaman içinde 4 farklı ECM'de iPCS birleşimini otomatik bir şekilde değerlendirmek için yüksek içerikli bir görüntü analiz sistemi kullanılmıştır. Yapışkan iPSC'lerin hücre birleşimini değerlendirmek için farklı analiz ayarları kullanılmış ve %60, 80 veya 100 maske uygulanıp uygulanmadığına dair sadece küçük bir fark (laminin ile 24 ve 48 saatte) gözlenmiştir. Ayrıca lamininin Matrigel, vitronektin ve fibronektin ile karşılaştırıldığında en iyi birleşmeye yol açtığını gösteriyoruz.

Bu çalışmada, iPSC'lerin farklı kaplama koşullarında yetiştirildiğinde birleşimini araştırdık. Bir sitometre kullanarak, 5 gün içinde üçlü olarak kolayca bilgilendirici sonuçlar elde edebildik. iPSC'ler plastik kaplara neredeyse hiç yapışmadığından ve çoğalmalarını desteklemek için bir kaplama gerektiğinden, hücre kültürünün sağlığının bir göstergesi olduğu ve farklılaşma potansiyellerini yansıtabileceği için insan iPSC'lerinin birleşmesini izlemeye karar verdik. İn vitro ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System at JoVE.com

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

Protokolün amacı, diferansiyel kaplamanın indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) büyüme hızını nasıl etkilediğini değerlendirmek için farklı hücre dışı matris (ECM) kaplama koşullarını karşılaştırmaktır. Özellikle, iPSC kültürlerinin optimum büyümesini sağlamak için koşullar oluşturmayı amaçlıyoruz.

Otomatik Görüntüleme Sistemi kullanarak iPSC'lerin Birleşme Noktasının Ölçülmesi.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Research

JoVE Journal

Biology

Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

Ampüteler Osseointegrasyon Akıllı İmplant Tasarım Sistemi Biyoelektrik Analizleri

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

Optik Tuzak kullanarak Bakteriyel Hücre Bükme Rijitlik Ölçüm

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

Görselleştirme Caenorhabditis Elegans Tırnak Yapıları Lipofilik Vital Boya, DII

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Üzerinde Bakterilerin Etkilerinin Ölçme<em&gt; C. Elegans</emBir Yumurta Tutma Testi Kullanma&gt; Davranış

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Protein Kalite Kontrol Sistemi incelenmesi<em&gt; D. diskodeyum</em&gt; Sıcaklık kontrollü Canlı Hücre Görüntüleme kullanarak

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)