Name: y-27632 enriches the yield of human melanocytes from adult skin tissues
Uploaded: 2020-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFA0104604)، والبرنامج العام للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81772093)، ومشروع البحوث اللوجستية العسكرية (AWS17J005)، والبرنامج الرئيسي لمؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة شاندونغ (ZR2019ZD36) ) وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي لمقاطعة شاندونغ (2019GSF108107) إلى مؤسسة X.W. Guangdong الأساسية والتطبيقية للأبحاث الأساسية (2019A151510833) وصناديق البحوث الأساسية لجامعة شاندونغ (2019GN043) إلى J.M.

وقد وافقت لجنة أخلاقيات البحوث البشرية على استخدام أنسجة قلفة البالغين في هذا البروتوكول (رقم 2015120401، التاريخ: 12 مايو 2015).
ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات التالية في بيئة معقمة لمنع تلوث الخلايا والثقافات.
1- الأعمال التحضيرية
<ol><li>جمع أنسجة قلفة الكبار الطازجة م...

<ol>
	<li>Costin, G. E., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+pigmentation:+melanocytes+modulate+skin+color+in+response+to+stress.">Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress.</a> FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).</li><li>Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosinase+gene+expression+in+human+tissues.">Tyrosinase gene expression in human tissues.</a> Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).</li><li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi.">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li><li>Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanocytes+in+tissue+culture.">Human melanocytes in tissue culture.</a> Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).</li><li>Eisinger, M., Marko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+proliferation+of+normal+human+melanocytes+in+vitro+in+the+presence+of+phorbol+ester+and+cholera+toxin.">Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).</li><li>Hirobe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+keratinocyte-derived+factors+involved+in+regulating+the+proliferation+and+differentiation+of+mammalian+epidermal+melanocytes.">Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).</li><li>Halaban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+from+human+keratinocytes+is+a+natural+mitogen+for+melanocytes.">Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).</li><li>Kunisada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+expression+of+transgenic+hepatocyte+growth+factor+affects+melanocyte+development,+leading+to+dermal+melanocytosis.">Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis.</a> Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).</li><li>Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+human+melanocytes+is+regulated+by+endothelin-1+and+stem+cell+factor+in+synergy+with+cyclic+AMP+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue.">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).</li><li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632.">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li><li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfollicular+epidermal+stem+cells:+boosting+and+rescuing+from+adult+skin.">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin.</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li><li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem/progenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity.">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li><li>Yokoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+suppression+of+MITF+expression+via+HDAC+inhibitors+in+the+melanocyte+lineage.">Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).</li><li>Mi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+promotes+keratinocyte+survival+and+paracrine+secretion,+enhancing+establishment+of+primary+human+melanocytes+and+melanocyte-keratinocyte+co-cultures.">A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).</li></ol>

واستند البروتوكول الموصوف هنا إلى منشور صدر مؤخراً16. وينبغي إيلاء بعض الاهتمام للخطوات الحاسمة التالية لتحقيق أفضل النتائج باستخدام الأسلوب الجديد. أولاً، الفصل الناجح بين البشرة والأدمة أمر بالغ الأهمية. قطع أنسجة قلفة الكبار إلى شرائط واسعة 3-4 مم باستخدام شفرة مشرط لجعل ا?...

كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير بروتوكول بسيط وفعال لعزل الخلايا الصباغية عن البشرة من الجلد للبالغين للأبحاث البيولوجية والتطبيقات السريرية. الصباغيات، التي تقع في البشرة القاعدية من الجلد وفي بصيلات الشعر، تلعب دورا هاما في تصبغ الجلد والشعر من خلال إنتاج الميلانين1. إن تصبغ الجلد الناتج من الخلايا الصباغية الجلدية يعمل كمصفاة للأشعة فوق البنفسجية التي تقلل / تمنع تلف الحمض النووي للخلايا الكامنة في الجلد2. انتشار غير طبيعي من الخلايا الصباغية في الجلد أمر شائع جدا، كما هو الحال في تشكيل نيفي حميدة (الشامات) التي الخلايا الصباغية يحتمل أن تتحول إلى نمو oncogenic تليها الشيخوخة الخلوية3.
منذ عام 1957، كانت العزلة والثقافة اللاحقة للميلانوسيات الأولية البشرية ممكنة4، ولكن فقط منذ عام 1982 كان هناك طريقة فعالة يمكن أن تنشئ ثقافات الخلايا الميلانوسية البشرية من البشرة5. الطريقة التقليدية لعزل الخلايا الصباغية الأولية من البشرة ينطوي على هضم الأنزيمية على خطوتين. باختصار ، يتم هضم الجلد في البداية مع عدم السيك مع فصل البشرة عن الأدمة ، وبعد ذلك يتم هضم البشرة مع التربسين لإنتاج تعليق يحتوي على الخلايا الصباغية والكيرتينوسيات ، والتي يمكن بعد ذلك أن تزرع بشكل انتقائي في وسائل الإعلام المختلفة. حاليا، والثقافة الأولية عادة ما يستغرق حوالي 3 إلى 4 أسابيع للميلانوسيات للوصول إلى التقاء باستخدام الطريقة التقليدية، والتي من المرجح أن يرجع ذلك إلى انخفاض كفاءة عزلتهم. لذلك، فإن زيادة الإنتاج الأولي للميلانوسيات من أنسجة الجلد البالغة تكون مفيدة جداً لكل من البحوث المختبرية والتطبيقات السريرية.
العديد من عوامل النمو, وقد ثبت أن معظمها تفرز بواسطة keratinocytes (على سبيل المثال, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF و SCF)5-8-8, تنظيم تمايز وانتشار الميلانوسيات الثدييات. في غياب طبقات التغذية، وعدم وجود تلك العوامل النمو يؤدي إلى انخفاض انتشار الخلايا الصباغية وزيادة المبرمج9. يمكن أن تؤدي الثقافة المشتركة للكيراتينوسيات كخلايا مغذيات والخلايا الصباغية إلى انتشار الصباغي المتسارع وتقليل المبرمج. ومع ذلك، فإن طريقة الثقافة المشتركة لا تتطلب فقط المزيد من أنسجة الجلد لإعداد الكيراتينوسيات، وهو أمر غير عملي، ولكن أيضا لا يمكن أن تعمل بكفاءة لأن ظروف الثقافة المطلوبة من قبل الخلايا الصباغية لا تفضل نمو الكيراتينوسيت، والعكس بالعكس.
وقد ذكرت الدراسات السابقة أن إضافة Y-27632، وهو المانع روك، في وسط النمو يمكن أن تعزز من العائد من خلايا البشرة الأولية البشرية من أنسجة الجلد10-14-14. ولذلك، سيكون من المثير للاهتمام لاختبار ما إذا كان عزل الخلايا الصباغية الأولية البشرية سوف تستفيد من وجود Y-27632. في الواقع، إضافة Y-27632 في التفا المتوسطة15، الذي يحتوي على TPA، IBMX،نا 3VO4 و dbcAMP، زادت بشكل كبير من العائد من الخلايا الصباغية الأولية المعزولة من أنسجة الدبلين في الثقافات الأولية16. بالمقارنة مع البروتوكول التقليدي، هذا البروتوكول الجديد هو أكثر كفاءة في زيادة العائد من الخلايا الصباغية16. لذلك، يصف هذا البروتوكول الطريقة الجديدة بالتفصيل باستخدام أنسجة الجلد للبالغين على أساس دراسة سابقة16 من أجل تعزيز تطبيقها في البحوث البيولوجية الأساسية والتطبيقية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37119</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>431792</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026333</td>
			<td>For cell incubating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Shaker</td>
			<td>Shanghai Boxun</td>
			<td>150036</td>
			<td>For water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>For melanocyte isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C11995500</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1AC5</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5E44316</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-15371</td>
			<td>Induce pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5C42258</td>
			<td>For cell microscopic observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human MITF</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab12039</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>melanocytes culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-dibutyryladeno-sine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate (dbcAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA&#65289;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79346</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-human Ki-67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1020-500</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td>Cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20TM automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automatic cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>For melanocyte dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>For melanocyte isolation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

y-27632 enriches the yield of human melanocytes from adult skin tissues

إن عزل وثقافة الخلايا الصباغية الأولية من أنسجة الجلد مهمة جداً للبحوث البيولوجية وقد استخدمت على نطاق واسع للتطبيقات السريرية. عزل الخلايا الصباغية الأولية من أنسجة الجلد عن طريق الطريقة التقليدية عادة ما يستغرق حوالي 3 إلى 4 أسابيع لتمرير ما يكفي. والأهم من ذلك، فإن الأنسجة المستخدمة عادة ما تكون من قبل الوليد، ولا يزال يشكل تحدياً لعزل الخلايا الصباغية الأولية بكفاءة عن الأنسجة البالغة. لقد طورنا مؤخرًا طريقة عزل جديدة للميلانوسيات تضيف Y-27632، وهو مثبط Rho kinase، إلى متوسط الثقافة الأولي لمدة 48 ساعة. نحن الآن وصف هذه الطريقة الجديدة بمزيد من التفصيل باستخدام البشرة الكبار لثقافة بكفاءة الخلايا الصباغية الأولية. الأهم من ذلك، ونحن نظهر أن الخلايا الصباغية التي تم الحصول عليها من أنسجة البالغين التي أعدتها هذه الطريقة الجديدة يمكن أن تعمل بشكل طبيعي. هذا البروتوكول الجديد سوف تستفيد بشكل كبير دراسات عيوب التصبغ والميلانوما باستخدام الخلايا الميلانوسية الأولية التي أعدت من أنسجة الجلد الكبار الوصول إليها بسهولة.

يظهر الشكل 1 رسم تخطيطي يقارن بين الأساليب التقليدية والجديدة. الإجراء لإعداد الأنسجة والهضم مع طريقة جديدة هو نفس الإجراء للأسلوب التقليدي، والفرق الوحيد هو أن الخلايا المعزولة هي إعادة تعليق في 10 مل من تيفا المتوسطة في وجود 10 μM Y-27632. بعد يومين من البذر، استبدل الوسائط بو?...

Watch this Scientific Journal Video about Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues at JoVE.com

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

هذه الورقة تفيد بأن إضافة Y-27632 إلى تيفا المتوسطة يمكن أن تزيد بشكل كبير من العائد من الخلايا الصباغية من أنسجة الجلد الكبار.

Y-27632 يثري العائد من الخلايا الصباغية البشرية من أنسجة الجلد الكبار

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

الهدف العام من الخلايا القائمة على بروتوكول هو عزل وثقافة الخلايا الصباغية البشرية، وتحسين أوجه القصور في الأساليب التقليدية. من الطريقة الجديدة يمكننا الحصول على كميات أكبر من خلايا الخلايا الصباغية الأولية في وقت قصير نسبيا، استنادا إلى المواد والمعدات. الأنسجة البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول هي حديثة للبالغين للأنسجة الجلدية التي يتم التخلص منها من جراحة الختان في المستشفى والتعامل معها وفقًا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحث البشري بالمؤسسة رقم 2015120401، تاريخ 12 مايو 2015.هذا هو عرض لجميع الكواشف المطلوبة. إعداد الأدوات والمواد العقيمة مقدما ووضع الأنسجة في طبق، وغسل الأنسجة مع 75٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية ومع غسل الحل العلاقات خمس دقائق كل يقطع الأنسجة إلى قطع مريحة وخردة الأنسجة مع شفرة الجراحية لإزالة طبقة الدهون. تسطيح الأنسجة مع الجانب الأدمة إلى أسفل إضافة 2.5 مليغرام لكل ملليلتر حل الفضاء للأنسجة الجلد.غطّي القطع واحفظها عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم الثاني، قشر قبالة البشرة من الأدمة ونقل على الفور البشرة إلى ثلاثة أطباق أخرى مع محلول الغسيل بدوره يغرق 0.05٪ التربسين في أنبوب المحتضنة لمدة 30 دقيقة في حمام مائي في 37 درجة مئوية. إضافة وحدة تخزين متساوية من حل تحييد.الماصات الحل صعودا وهبوطا لمدة 10 إلى 15 مرة. تمرير الحل من خلال مرشح الهريس 100 ميكرومتر. أجهزة الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق إزالة افرات إعادة تعليق البليت الخلية في 10 ملليلتر من المتوسطة تيفا.إضافة 10 ميكرومتر من Y-27632. ضع علامة على المعلومات التي يكون هذا مجال الرؤية تحت المجهر. ويظهر الخلايا العائمة في احتضان المتوسطة في حاضنة 37 درجة مئوية.هذا الرأي يظهر وجهة النظر في اليوم الثاني الخلايا بدأت في إرفاق الجزء السفلي من الطبق. والمنظر في اليوم التاسع يظهر ودائع واضحة من الخلايا الصباغية موجودة. إزالة يغسل supernatant الخلايا مع برنامج تلفزيوني إضافة مليمترين من 0.05٪ تريبسين احتضان الخلايا لمدة دقيقتين إضافة ملليلتر من حل تحييد.أجهزة الطرد المركزي في 200 مرة ز لمدة خمس دقائق. إزالة supernatant ببطء إعادة تعليق البليت الخلية مع 10 ملليمتر من المتوسطة تيفا. تغيير الوسط كل يومين.هذه الصور تظهر وجهات النظر من مرور مخطط واحد تخطيطي بحيث يتم عرض الأسلوب الجديد والطريقة التقليدية في هذا الشكل. الإجراء لإعداد الأنسجة وهضم طريقة جديدة هو نفس الطريقة التقليدية. والفرق الوحيد هو أن الخلايا الدهنية المعزولة تلقيح في 10 دقيقة في المتوسطة تيفا لها مع وجود 10 ميكرومتر Y-27632.بعد يومين استبدال وسائل الإعلام مع تيفا المتوسطة دون ملاحق في Y-27632. هذه اللوحة تظهر الصور التمثيلية للميلانويات التي أعدتها الطريقة التقليدية الصف العلوي والطريقة الجديدة في الصف السفلي في اليوم الثالث، اليوم السادس واليوم الثامن بعد التطعيم الأولي نسميه عدد الخلايا الصباغية في اليوم الثالث، اليوم السادس والثامن، وجدنا أن الطريقة الجديدة زادت من العائد الخلايا الصباغية بنحو خمس مرات. بعد ثمانية أيام العداد فعلنا العشرات وعد عدد الخلايا الصباغية في كل طبق واحد.وأظهرت النتائج أن عدد الخلايا الصباغية المعزولة عن طريق طريقة جديدة هو أكثر بكثير من الطريقة التقليدية. Ki67 الدائمة تؤكد أن الخلايا الصباغية المعزولة عن طريق طريقة جديدة يمكن أن تتكاثر عادة أكثر أهمية حصلنا على وظيفة طبيعية من الخلايا الصباغية مع طريقة جديدة. لقد فحصنا نقاء الخلايا الصباغية بعد المرور الأولي من العزلة.الممر واحدة ميلوانوسييت ل يقف ل MITF تعبير أيّ عبّر فقط في الخلايا الصباغية. ووجدنا ما يقرب من 100٪ كانت إيجابية ل MITF تشير إلى الخلايا الصباغية النقية التي تم الحصول عليها بعد مرور الأول. لاختبار الخلايا الصباغية المعزولة من الأساليب الجديدة يمكن أن تعمل بشكل طبيعي.تعاملنا مع الخلايا الصباغية مع قوة التبريد لأكثر من 90 في المختبر، ويلاحظ أن التبريد قوة يمكن أن تحفز تصبغ الخلايا الصباغية. إن أخذ هذه البيانات معًا يشير إلى أن الخلايا الصباغية المعزولة عن الطريقة الجديدة يمكن أن تنتج تصبغًا بشكل طبيعي. الصباغية الأولية، كما ذكر أعلاه الجلد وامتدت في الثقافة وقد استخدمت بسهولة للبحوث المختبرية والتطبيقات السريرية.بعد أن ذكرت أن معرف Y-27632 في وسط الثقافة الأولية قبل يومين يمكن أن يزيد بشكل كبير من الخروج من الخلايا الصباغية. باختصار، لقد أنشأنا بنجاح طريقة جديدة بسيطة وعالية الكفاءة لعزل الخلايا الصباغية الأولية النقية من الأنسجة البالغة.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

تشريح هيئات من اسماك الزرد الكبار

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية الظهارية من الجلد البشري

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

اختيار وعزل المستعمرات من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة برمجتها من الخلايا الليفية الكبار

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

انتقائية لقطة من hydroxymethylcytosine-5 من الحمض النووي الجيني

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

فيفو السابقين الثقافة من الفأر الجنينية بالبشرة والتصوير لايف للهجرة أرومة ميلانينية

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية للإنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية الجهاز التنفسي القياسات

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

ارتفاع العائد التعبير عن البروتينات المؤتلف الإنسان مع عابر ترنسفكأيشن من خلايا HEK293 في تعليق

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...