Name: y-27632 enriches the yield of human melanocytes from adult skin tissues
Uploaded: 2020-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af The National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) og Key Research and Development Program i Shandong-provinsen (2019GSF108107) til X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) og The Fundamental Research Funds of Shandong University (2019GN043) til J.M.

Brugen af voksenskindskind væv i denne protokol er blevet godkendt af Human Research Ethics Committee (Nr. 2015120401, dato: Maj 12, 2015).
BEMÆRK: Udfør alle følgende procedurer i et sterilt miljø for at forhindre forurening af celler og kulturer.
1. Forberedelser
<ol><li>Friske voksenhudevæv fra omskæringsoperationer i 15 ml rør indeholdende 10 ml fosfatstødpudesalt (PBS) og opbevares i 4 °C. BEMÆRK: Udskæn noget af vævene som beskrevet nedenfor ...

<ol>
	<li>Costin, G. E., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+pigmentation:+melanocytes+modulate+skin+color+in+response+to+stress.">Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress.</a> FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).</li><li>Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosinase+gene+expression+in+human+tissues.">Tyrosinase gene expression in human tissues.</a> Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).</li><li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi.">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li><li>Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanocytes+in+tissue+culture.">Human melanocytes in tissue culture.</a> Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).</li><li>Eisinger, M., Marko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+proliferation+of+normal+human+melanocytes+in+vitro+in+the+presence+of+phorbol+ester+and+cholera+toxin.">Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).</li><li>Hirobe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+keratinocyte-derived+factors+involved+in+regulating+the+proliferation+and+differentiation+of+mammalian+epidermal+melanocytes.">Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).</li><li>Halaban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+from+human+keratinocytes+is+a+natural+mitogen+for+melanocytes.">Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).</li><li>Kunisada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+expression+of+transgenic+hepatocyte+growth+factor+affects+melanocyte+development,+leading+to+dermal+melanocytosis.">Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis.</a> Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).</li><li>Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+human+melanocytes+is+regulated+by+endothelin-1+and+stem+cell+factor+in+synergy+with+cyclic+AMP+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue.">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).</li><li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632.">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li><li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfollicular+epidermal+stem+cells:+boosting+and+rescuing+from+adult+skin.">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin.</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li><li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem/progenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity.">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li><li>Yokoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+suppression+of+MITF+expression+via+HDAC+inhibitors+in+the+melanocyte+lineage.">Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).</li><li>Mi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+promotes+keratinocyte+survival+and+paracrine+secretion,+enhancing+establishment+of+primary+human+melanocytes+and+melanocyte-keratinocyte+co-cultures.">A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).</li></ol>

Den protokol, der er beskrevet her , var baseret på en nylig publikation16. Der bør lægges vægt på følgende kritiske trin for at opnå de bedste resultater med den nye metode. For det første, vellykket adskillelse af epidermis og dermis er afgørende. Skær den voksne forhud væv i 3-4 mm brede strimler ved hjælp af en skalpel klinge for at gøre dispase arbejde mere grundigt og nemt at adskille epidermis fra dermis. For det andet, når de adskiller disse to lag, forurening af dermis bør ...

Målet med denne undersøgelse var at udvikle en enkel og effektiv protokol til at isolere melanocytter fra epidermis af voksen hud til biologisk forskning og kliniske anvendelser. Melanocytter, som er placeret i den basale epidermis af huden og i hårsækkene, spiller en vigtig rolle i pigmentering af hud og hår ved at producere melanin1. Den resulterende hudpigmentering fra epidermale melanocytter fungerer som et ultraviolet strålingsfilter, der reducerer/forhindrer DNA-skader på underliggende celler i huden2. Den unormale spredning af melanocytter i huden er ret almindelig, såsom i dannelsen af godartede nevi (modermærker), hvor melanocytter potentielt omdanne til onkogen vækst efterfulgt af cellulære senescence3.
Siden 1957 har isolation og efterfølgende kultur af menneskelige primære melanocytter været muligt4, men først siden 1982 har der været en effektiv metode, der reproducerbart kan etablere kulturer af menneskelige melanocytter fra epidermis5. Den konventionelle metode til at isolere primære melanocytter fra epidermis indebærer en to-trins enzymatisk fordøjelse. Kort, huden er i første omgang fordøjet med dispase at adskille epidermis fra dermis, hvorefter epidermis er fordøjet med trypsin at producere suspensioner, der indeholder melanocytter og keratinocytter, som derefter kan selektivt dyrkes i forskellige medier. I øjeblikket tager den oprindelige kultur normalt omkring 3 til 4 uger for melanocytter at nå sammenløbet ved hjælp af den konventionelle metode, hvilket sandsynligvis skyldes den lave effektivitet af deres isolation. Derfor ville en forøgelse af den oprindelige produktion af melanocytter fra voksent hudvæv være ganske nyttigt for både laboratorieforskning og kliniske anvendelser.
Mange vækstfaktorer, hvoraf de fleste har vist sig at blive udskædt af keratinocytter (f.eks. α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF og SCF)5-8-8, regulerer differentiering og spredning af pattedyrsmelanocytter. I mangel af feeder lag, manglen på disse vækstfaktorer fører til nedsat spredning af melanocytter og deres øgede apoptose9. Co-kultur keratinocytter som feeder celler og melanocytter kunne føre til accelereret melanocyt spredning og reduceret apoptose. Men co-kultur metode ikke kun kræver mere hudvæv til at forberede keratinocytter, hvilket ikke er praktisk, men også kunne ikke arbejde effektivt, fordi de kulturbetingelser, der kræves af melanocytter ikke favoriserer keratinocyt vækst, og vice-versa.
Tidligere undersøgelser har rapporteret, at tilsætning af Y-27632, en ROCK-hæmmer, i vækstmediet kan øge udbyttet af menneskelige primære epidermale celler fra hudvæv10-14. Derfor ville det være interessant at teste, om isolering af menneskelige primære melanocytter ville drage fordel af tilstedeværelsen af Y-27632. Tilføjelsen af Y-27632 til inokulering TIVA medium15, som indeholder TPA, IBMX, Na3VO4 og dbcAMP, øgede faktisk udbyttet af primære melanocytter isoleret fra forhudvæv i de oprindelige kulturer16. Sammenlignet med den konventionelle protokol, denne nye protokol er betydeligt mere effektiv til at øge udbyttet af melanocytter16. Derfor beskriver denne protokol den nye metode i detaljer ved hjælp af voksen hudvæv baseret på en tidligere undersøgelse16 for at fremme dens anvendelse i grundlæggende og anvendt biologisk forskning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37119</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>431792</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026333</td>
			<td>For cell incubating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Shaker</td>
			<td>Shanghai Boxun</td>
			<td>150036</td>
			<td>For water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>For melanocyte isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C11995500</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1AC5</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5E44316</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-15371</td>
			<td>Induce pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5C42258</td>
			<td>For cell microscopic observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human MITF</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab12039</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>melanocytes culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-dibutyryladeno-sine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate (dbcAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA&#65289;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79346</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-human Ki-67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1020-500</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td>Cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20TM automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automatic cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>For melanocyte dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>For melanocyte isolation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

y-27632 enriches the yield of human melanocytes from adult skin tissues

Isolering og kultur af primære melanocytter fra hudvæv er meget vigtigt for biologisk forskning og har været meget udbredt til kliniske anvendelser. Isoler primære melanocytter fra hudvæv ved den konventionelle metode tager normalt omkring 3 til 4 uger at passage tilstrækkeligt. Endnu vigtigere, det anvendte væv er normalt nyfødte forskind og det er stadig en udfordring at effektivt isolere primære melanocytter fra voksne væv. Vi har for nylig udviklet en ny isolationsmetode for melanocytter, der tilføjer Y-27632, en Rho kinase hæmmer, til den oprindelige kultur medium for 48 h. Sammenlignet med den konventionelle protokol, denne nye metode dramatisk øger udbyttet af melanocytter og forkorter den tid, der kræves for at isolere melanocytter fra forhud væv. Vi beskriver nu denne nye metode mere detaljeret ved hjælp af voksen epidermis til effektivt at dyrke primære melanocytter. Vigtigere er det, vi viser, at melanocytter fremstillet af voksne væv fremstillet ved denne nye metode kan fungere normalt. Denne nye protokol vil i væsentlig grad gavne undersøgelser af pigmenteringsdefekter og melanomer ved hjælp af primære melanocytter fremstillet af let tilgængelige voksne hudvæv.

Figur 1 viser et skematisk diagram, der sammenligner de konventionelle og de nye metoder. Proceduren for vævsfrembræmning og fordøjelse med den nye metode er den samme som proceduren for den konventionelle metode, idet den eneste forskel er, at de isolerede celler opslæmmes i 10 ml TIVA-medium i nærvær af 10 μM Y-27632. To dage efter såning, erstatte medierne med normal TIVA medium uden Y-27632. Den konventionelle metode til isolering primære melanocytter fra hudvæv kræver normalt...

Watch this Scientific Journal Video about Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues at JoVE.com

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Dette papir rapporterer, at tilsætningen af Y-27632 til TIVA medium kan øge udbyttet af melanocytter fra voksne hudvæv.

Y-27632 Beriger udbyttet af humane melanocytter fra voksent hudvæv

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Det generelle mål med den cellebaserede protokol er at isolere og kultur menneskelige melanocytter celler, forbedre manglerne ved konventionelle metoder. Fra den nye metode kan vi få større mængder af primære melanocytter celler i en relativt kort tid, baseret på materialer og udstyr. Humane væv, der anvendes i denne protokol er friske voksne for hudvæv kasseres fra omskæring kirurgi på hospitalet og håndteres i henhold til retningslinjerne fra institutionens Human Research Ethics Committee nummer 2015120401, dato maj 12 2015.Dette er en visning af alle nødvendige reagenser. Forbered sterile instrumenter og materialer på forhånd og sæt vævet i en skål, vask vævet med 75% ethanol i 30 sekunder og med vasker opløsning binder fem minutter hver skærer vævet i praktiske stykker og skrot vævet med kirurgisk klinge for at fjerne fedtlaget. Flade væv med dermis side ned tilføje 2,5 milligram per milliliter rummet løsning til huden væv.Cover og gemme brikkerne på fire grader celsius natten over. På den anden dag, skræl epidermis fra dermis og straks overføre epidermis i yderligere tre retter med vaskeopløsning igen nedsænkes 0,05% trypsin i røret inkuberet i 30 minutter i et vandbad ved 37 grader celsius. Tilføj en tilsvarende diskenhed af neutraliseringsløsningen.Pipetter løsningen op og ned i 10 til 15 gange. Før opløsningen gennem et 100 mikrometer mash filter. centrifuge ved 200 gange g i fem minutter fjernes supernatanten ophænge cellepallen igen i 10 milliliter tivamedium.Der tilsættes 10 mikrometer Y-27632. Markér de oplysninger, der er dette, synsfeltet under mikroskopet. Det viser celler flyder i mediet inkubat i en 37 grader celsius inkubator.Denne visning viser visningen på dag to cellerne er begyndt at fastgøre bunden af skålen. Og udsigten på dag ni viser indlysende indskud af melanocytter findes. Fjern supernatanten vask cellerne med PBS tilføje to millimeter 0,05% trypsin inkubere cellerne i to minutter tilføje to milliliter af neutralisering løsning.centrifuge ved 200 gange g i fem minutter. Fjern supernatanten langsomt re-suspendere cellepallen med 10 millimeter tiva medium. Skift mediet hver anden dag.Disse billeder viser synspunkter passage en skematisk diagram, så den nye metode og den konventionelle metode præsenteres i denne figur. Proceduren for vævspræparat og fordøjelsen af ny metode er den samme som den konventionelle metode. Den eneste forskel er, at de isolerede fedtceller podet i 10 minutter i hendes tiva medium med tilstedeværelsen af 10 mikrometer Y-27632.Efter to dage erstatte medierne med tiva medium uden kosttilskud på Y-27632. Dette panel viser repræsentative billeder af melanocytter udarbejdet af den konventionelle metode øverste række og ved den nye metode nederste række på dag tre, dag seks og dag otte efter den første vaccination vi kalder antallet af melanocytter på dag tre, dag seks og otte, fandt vi, at den nye metode øget melanocytter udbytte med omkring fem gange. Efter otte dage tæller vi gjorde dusin og tælle antallet af melanocytter i hver enkelt skål.Resultaterne viste, at antallet af melanocytter isoleret ved ny metode er meget mere end den konventionelle metode. Ki67 stående bekræfte, at melanocytter isoleret ved ny metode normalt kan formere sig endnu vigtigere vi opnået normal funktion af melanocytter med den nye metode. Vi kontrollerede renheden af melanocytter efter første passage fra isolationen.Passagen en melanocytter for stå for MITF udtryk, som kun udtrykkes i melanocytter. Og vi fandt næsten 100% celler var positive for MITF angiver rene melanocytter opnået efter første passage. For at teste melanocytter isoleret fra de nye metoder kan fungere normalt.Vi behandlede melanocytter med kraftkøling i over 90 in vitro og observerer, at kraftkøling kan fremkalde pigmentering af melanocytter. At tage disse data sammen tyder på, at melanocytter isoleret fra den nye metode normalt kan producere pigmentering. Primære melanocytter, som anført ovenfor huden og udvidet i kultur har været let anvendes til laboratorieforskning og de kliniske anvendelser.Efter at have rapporteret, at ID Y-27632 i den oprindelige kultur medium før to dage kan dramatisk øger ud af melanocytter. Sammenfattende har vi med succes etableret en ny enkel og yderst effektiv metode til at isolere rene primære melanocytter fra voksne væv.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selektion og isolering Kolonier af Human induceret pluripotente stamceller omprogrammeret fra voksne fibroblaster

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selektiv opsamling af 5-hydroxymethylcytosine fra genomisk DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naive voksne stamceller Isolering fra primære humane fibroblastkulturer

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolering og dyrkning af Dental Epiteliale stamceller fra voksne mus Fortand

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonale Hud og live-billeddannelse af Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolering af mitokondrier fra minimale mængder af Mouse Skeletmuskel for High Throughput Microplate Respiratory Målinger

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

High Yield Ekspression af rekombinant human Proteiner med transient transfektion af HEK293-celler i suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering og kultur af primære muskeratinocytter fra neonatal og voksen mus hud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...