Name: y-27632 enriches the yield of human melanocytes from adult skin tissues
Uploaded: 2020-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door The National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), het Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36), het Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36), het Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36), het Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36)) en The Key Research and Development Program van de provincie Shandong (2019GSF108107) aan X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) en De Fundamentele Onderzoeksfondsen van de Shandong University (2019GN043) aan J.M.

Het gebruik van volwassen voorhuidweefsels in dit protocol is goedgekeurd door de Human Research Ethics Committee (no.2015120401, datum: 12 mei 2015).
OPMERKING: Voer alle volgende procedures uit in een steriele omgeving om verontreinigingen van cellen en culturen te voorkomen.
1. Voorbereidingen
<ol><li>Verzamel verse volwassen voorhuidweefsels van besnijdenisoperaties in 15 mL-buizen met 10 mL fosfaatbuffersoutline (PBS) en bewaar in 4 °C. OPMERKING: Scheid ...

<ol>
	<li>Costin, G. E., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+pigmentation:+melanocytes+modulate+skin+color+in+response+to+stress.">Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress.</a> FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).</li><li>Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosinase+gene+expression+in+human+tissues.">Tyrosinase gene expression in human tissues.</a> Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).</li><li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi.">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li><li>Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanocytes+in+tissue+culture.">Human melanocytes in tissue culture.</a> Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).</li><li>Eisinger, M., Marko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+proliferation+of+normal+human+melanocytes+in+vitro+in+the+presence+of+phorbol+ester+and+cholera+toxin.">Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).</li><li>Hirobe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+keratinocyte-derived+factors+involved+in+regulating+the+proliferation+and+differentiation+of+mammalian+epidermal+melanocytes.">Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).</li><li>Halaban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+from+human+keratinocytes+is+a+natural+mitogen+for+melanocytes.">Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).</li><li>Kunisada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+expression+of+transgenic+hepatocyte+growth+factor+affects+melanocyte+development,+leading+to+dermal+melanocytosis.">Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis.</a> Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).</li><li>Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+human+melanocytes+is+regulated+by+endothelin-1+and+stem+cell+factor+in+synergy+with+cyclic+AMP+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue.">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).</li><li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632.">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li><li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfollicular+epidermal+stem+cells:+boosting+and+rescuing+from+adult+skin.">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin.</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li><li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem/progenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity.">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li><li>Yokoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+suppression+of+MITF+expression+via+HDAC+inhibitors+in+the+melanocyte+lineage.">Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).</li><li>Mi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+promotes+keratinocyte+survival+and+paracrine+secretion,+enhancing+establishment+of+primary+human+melanocytes+and+melanocyte-keratinocyte+co-cultures.">A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).</li></ol>

Het hier beschreven protocol was gebaseerd op een recente publicatie16. Er moet enige aandacht worden besteed aan de volgende kritieke stappen om met de nieuwe methode de beste resultaten te bereiken. Ten eerste is een succesvolle scheiding van de opperhuid en de dermis cruciaal. Snijd de volwassen voorhuidweefsels in 3-4 mm brede stroken met behulp van een scalpelblad om de dispase grondiger en gemakkelijker te laten werken om de opperhuid van de dermis te scheiden. Ten tweede, bij het scheiden v...

Het doel van deze studie was om een eenvoudig en effectief protocol te ontwikkelen om melanocyten te isoleren van de opperhuid van volwassen huid voor biologisch onderzoek en klinische toepassingen. Melanocyten, die zich bevinden in de basale opperhuid van de huid en in haarzakjes, spelen een belangrijke rol bij de pigmentatie van de huid en het haar door melanine1te produceren. De resulterende huidpigmentatie van epidermale melanocyten fungeert als een ultraviolet stralingsfilter dat DNA-schade aan onderliggende cellen in de huid vermindert/voorkomt2. De abnormale proliferatie van melanocyten in de huid is heel gebruikelijk, zoals in de vorming van goedaardige nevi (moedervlekken) waarbij melanocyten mogelijk transformeren tot oncogene groei, gevolgd door cellulaire senescentie3.
Sinds 1957 is het isolement en de daaropvolgende cultuur van menselijke primaire melanocyten mogelijk4, maar pas sinds 1982 is er een efficiënte methode die reproduceibly culturen van menselijke melanocyten kan vestigen uit de opperhuid5. De conventionele methode om primaire melanocyten te isoleren van de opperhuid omvat een tweestapszymatische spijsvertering. Kortom, de huid wordt in eerste instantie verteerd met dispase om de opperhuid van de dermis te scheiden, waarna de opperhuid wordt verteerd met trypsine om suspensieën met melanocyten en keratinocyten te produceren, die vervolgens selectief kunnen worden gekweekt in verschillende media. Momenteel duurt de initiële cultuur meestal ongeveer 3 tot 4 weken voordat melanocyten samenvloeiing bereiken met behulp van de conventionele methode, wat waarschijnlijk te wijten is aan de lage efficiëntie van hun isolatie. Daarom zou het verhogen van de initiële productie van melanocyten uit volwassen huidweefsels heel nuttig zijn voor zowel laboratoriumonderzoek als klinische toepassingen.
Veel groeifactoren, waarvan de meeste zijn aangetoond dat ze worden afgescheiden door keratinocyten (bijvoorbeeld α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF en SCF)5-8, reguleren de differentiatie en proliferatie van zoogdiermeloolieten. Bij afwezigheid van feederlagen leidt het ontbreken van deze groeifactoren tot de verminderde proliferatie van melanocyten en hun verhoogde apoptose9. De co-cultuur van keratinocyten als feedercellen en melanocyten zou kunnen leiden tot versnelde melanocytenproliferatie en verminderde apoptose. Echter, de co-cultuur methode vereist niet alleen meer huidweefsels voor te bereiden keratinocyten, die niet praktisch is, maar ook niet efficiënt zou kunnen werken, omdat de cultuur voorwaarden vereist door melanocyten niet voorstander van keratinocyten groei, en vice versa.
Eerdere studies hebben gemeld dat de toevoeging van Y-27632, een ROCK-remmer, in het groeimedium de opbrengst van menselijke primaire epidermale cellen uit huidweefsels10-14kan verbeteren. Daarom zou het interessant zijn om te testen of de isolatie van menselijke primaire melanocyten zou profiteren van de aanwezigheid van Y-27632. De toevoeging van Y-27632 in het inentings TIVA medium15, dat TPA, IBMX, Na3VO4 en dbcAMP bevat, verhoogde de opbrengst van primaire melanocyten geïsoleerd uit voorhuidweefsels in de oorspronkelijke culturen16. In vergelijking met het conventionele protocol is dit nieuwe protocol aanzienlijk efficiënter in het verhogen van de opbrengst van melanocyten16. Daarom beschrijft dit protocol de nieuwe methode in detail met behulp van volwassen huidweefsels op basis van een eerdere studie16 om de toepassing ervan in fundamenteel en toegepast biologisch onderzoek te bevorderen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37119</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>431792</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026333</td>
			<td>For cell incubating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Shaker</td>
			<td>Shanghai Boxun</td>
			<td>150036</td>
			<td>For water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>For melanocyte isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C11995500</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1AC5</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5E44316</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-15371</td>
			<td>Induce pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5C42258</td>
			<td>For cell microscopic observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human MITF</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab12039</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>melanocytes culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-dibutyryladeno-sine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate (dbcAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA&#65289;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79346</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-human Ki-67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1020-500</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td>Cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20TM automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automatic cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>For melanocyte dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>For melanocyte isolation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

y-27632 enriches the yield of human melanocytes from adult skin tissues

De isolatie en cultuur van primaire melanocyten uit huidweefsels is zeer belangrijk voor biologisch onderzoek en is op grote schaal gebruikt voor klinische toepassingen. Het isoleren van primaire melanocyten van huidweefsels volgens de conventionele methode duurt meestal ongeveer 3 tot 4 weken om voldoende te passeren. Wat nog belangrijker is, de gebruikte weefsels zijn meestal pasgeboren foreskins en het is nog steeds een uitdaging om efficiënt te isoleren primaire melanocyten van volwassen weefsels. We hebben onlangs een nieuwe isolatiemethode voor melanocyten ontwikkeld die Y-27632, een Rho kinase-remmer, toevoegt aan het oorspronkelijke kweekmedium voor 48 uur. Vergeleken met het conventionele protocol verhoogt deze nieuwe methode de opbrengst van melanocyten drastisch en verkort het de tijd die nodig is om melanocyten te isoleren van voorhuidweefsels. We beschrijven deze nieuwe methode nu in meer detail met behulp van volwassen opperhuid om efficiënt te cultuur primaire melanocyten. Belangrijk is dat we aantonen dat melanocyten verkregen uit volwassen weefsels bereid door deze nieuwe methode normaal kunnen functioneren. Dit nieuwe protocol zal aanzienlijk ten goede komen aan studies van pigmentatiedefecten en melanomen met behulp van primaire melanocyten bereid uit gemakkelijk toegankelijke volwassen huidweefsels.

Figuur 1 toont een schematisch diagram waarin de conventionele en de nieuwe methoden worden vergeleken. De procedure voor weefselbereiding en -vertering met de nieuwe methode is dezelfde als de procedure voor de conventionele methode, het enige verschil is dat de geïsoleerde cellen opnieuw worden opgetrokken in 10 mL TIVA-medium in aanwezigheid van 10 μM Y-27632. Twee dagen na het zaaien, vervang de media met normale TIVA medium zonder Y-27632. De conventionele methode voor het isoleren va...

Watch this Scientific Journal Video about Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues at JoVE.com

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Dit document meldt dat de toevoeging van Y-27632 aan TIVA medium de opbrengst van melanocyten uit volwassen huidweefsels aanzienlijk kan verhogen.

Y-27632 verrijkt de opbrengst van menselijke melanocyten uit volwassen huidweefsels

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Het algemene doel van het op cellen gebaseerde protocol is om menselijke melanocytencellen te isoleren en te kweken, waardoor de tekortkomingen van conventionele methoden worden verbeterd. Van de nieuwe methode kunnen we grotere hoeveelheden primaire melanocyten cellen in een relatief korte tijd, op basis van materialen en apparatuur. Menselijke weefsels die in dit protocol worden gebruikt, zijn vers voor huidweefsels die zijn weggegooid uit besnijdenischirurgie in het ziekenhuis en worden behandeld volgens de richtlijnen van het Human Research Ethics Committee nummer 2015120401 van de instelling, dateren van 12 mei 2015.Dit is een weergave van alle benodigde reagentia. Bereid steriele instrumenten en materialen op voorhand en zet het weefsel in een schotel, was het weefsel met 75%ethanol gedurende 30 seconden en met wasbeurtoplossing banden vijf minuten elk snijdt het weefsel in handige stukken en schroot het weefsel met chirurgisch mes om de vetlaag te verwijderen. Plat de weefsels met de dermis kant naar beneden voeg 2,5 milligram per milliliter de ruimte oplossing aan de huidweefsels.Dek af en bewaar de stukken op vier graden Celsius 's nachts. Op de tweede dag, schil de opperhuid van de dermis en onmiddellijk de overdracht van de epidermis in nog eens drie gerechten met wasoplossing op zijn beurt dompelt 0,05% trypsine in de buis geïncubeerd gedurende 30 minuten in een waterbad op 37 graden Celsius. Voeg een gelijk volume van de neutralisatieoplossing toe.Pipetten de oplossing op en neer voor 10 tot 15 keer. Geef de oplossing door een stamppotfilter van 100 micrometer. centrifuge op 200 keer g gedurende vijf minuten verwijder de supernatant opnieuw opschorten van de cel pallet in 10 milliliter tiva medium.Voeg 10 micrometer Y-27632 toe. Markeer de informatie dit is het gezichtsveld onder de microscoop. Het toont cellen die in de middelgrote incubate drijven in een couveuse van 37 graden Celsius.Deze weergave toont de weergave op dag twee de cellen zijn begonnen met de onderkant van de schotel hechten. En het uitzicht op dag negen toont duidelijke deposito's van melanocyten bestaan. Verwijder de supernatant wassen van de cellen met PBS voeg twee millimeter van 0,05%trypsine incuberen de cellen gedurende twee minuten voeg twee milliliter van de neutralisatie-oplossing.centrifuge op 200 keer g gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant langzaam opnieuw op te schorten de cel pallet met 10 millimeter tiva medium. Verander het medium om de twee dagen.Deze foto's tonen de standpunten van passage een schematische diagram, zodat de nieuwe methode en de conventionele methode worden gepresenteerd in deze figuur. De procedure voor weefselbereiding en de vertering van nieuwe methode is dezelfde als de conventionele methode. Het enige verschil is dat de geïsoleerde vetcellen ingeënt in 10 minuten in haar tiva medium met de aanwezigheid van 10 micrometer Y-27632.Na twee dagen vervang de media met tiva medium zonder supplementen op Y-27632. Dit paneel toont representatieve beelden van melanocyten bereid door de conventionele methode bovenste rij en door de nieuwe methode onderste rij op dag drie, dag zes en dag acht na de eerste inenting noemen we het aantal melanocyten op dag drie, dag zes en acht, vonden we dat de nieuwe methode verhoogde de melanocyten opbrengst met ongeveer vijf keer. Na acht dagen balie hebben we dozijn en tellen het aantal melanocyten in elk gerecht.De resultaten toonden aan dat het aantal melanocyten geïsoleerd door nieuwe methode is veel meer dan de conventionele methode. Ki67 staan bevestigen dat melanocyten geïsoleerd door nieuwe methode kan normaal gesproken vermenigvuldigen wat nog belangrijker is dat we de normale functie van melanocyten verkregen met de nieuwe methode. We controleerden de zuiverheid van melanocyten na de eerste passage uit de isolatie.De passage melanocyten voor tribune voor uitdrukking MITF die slechts in melanocyten uitdrukte. En we ontdekten dat bijna 100% cellen positief waren voor MITF, wat aangeeft dat zuivere melanocyten na de eerste passage werden verkregen. Het testen van melanocyten geïsoleerd van de nieuwe methoden kan normaal functioneren.We behandelden melanocyten met krachtkoeling voor meer dan 90 in vitro en merken op dat krachtkoeling de pigmentatie van melanocyten kan veroorzaken. Het samen nemen van deze gegevens suggereert dat de melanocyten geïsoleerd van de nieuwe methode normaal gesproken pigmentatie kan produceren. Primaire melanocyten, zoals hierboven vermeld huid en uitgebreid in cultuur zijn gemakkelijk gebruikt voor laboratoriumonderzoek en de klinische toepassingen.Na te hebben gemeld dat ID Y-27632 in de oorspronkelijke cultuur medium voor twee dagen kan drastisch verhoogt de uit van melanocyten. Kortom, we hebben met succes een nieuwe eenvoudige en zeer efficiënte methode opgezet om zuivere primaire melanocyten te isoleren van volwassen weefsels.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Dissectie van organen van de Adult zebravis

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

Isolatie en Cultuur van Volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Selecteren en isoleren van Koloniën van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen geherprogrammeerd tegen Adult Fibroblasten

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selectieve vangen van 5-hydroxymethylcytosine van genomisch DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Volwassen stamcellen Isolatie van primaire humane fibroblastkweken

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolatie en Cultuur van Dental epitheliale stamcellen van de volwassen muis Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo cultuur van muis embryonale Huid en live-beeldvorming van melanoblast Migratie

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolatie en Cultuur van Primaire Muis Keratinocyten Uit Neonatale en Volwassen Muis Huid

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...