Name: y-27632 enriches the yield of human melanocytes from adult skin tissues
Uploaded: 2020-07-08T13:00:00
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Ces travaux ont été soutenus par le National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), the Key Program of Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD3 et the Key Research and Development Program of Shandong Province (2019GSF108107) à X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) et The Funds Funds Funds of Shandong University (2019GN043) à J.M.

L’utilisation de tissus prépuces adultes dans ce protocole a été approuvée par le Comité d’éthique de la recherche humaine (no 2015120401, date : 12 mai 2015).
REMARQUE : Effectuer toutes les procédures suivantes dans un environnement stérile pour prévenir les contaminations des cellules et des cultures.
1. Préparations
<ol><li>Recueillir les tissus frais du prépuce adulte des chirurgies de circoncision dans des tubes de 15 mL contenant 10 mL de sal...

<ol>
	<li>Costin, G. E., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+pigmentation:+melanocytes+modulate+skin+color+in+response+to+stress.">Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress.</a> FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).</li><li>Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosinase+gene+expression+in+human+tissues.">Tyrosinase gene expression in human tissues.</a> Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).</li><li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi.">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li><li>Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanocytes+in+tissue+culture.">Human melanocytes in tissue culture.</a> Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).</li><li>Eisinger, M., Marko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+proliferation+of+normal+human+melanocytes+in+vitro+in+the+presence+of+phorbol+ester+and+cholera+toxin.">Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).</li><li>Hirobe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+keratinocyte-derived+factors+involved+in+regulating+the+proliferation+and+differentiation+of+mammalian+epidermal+melanocytes.">Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).</li><li>Halaban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+from+human+keratinocytes+is+a+natural+mitogen+for+melanocytes.">Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).</li><li>Kunisada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+expression+of+transgenic+hepatocyte+growth+factor+affects+melanocyte+development,+leading+to+dermal+melanocytosis.">Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis.</a> Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).</li><li>Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+human+melanocytes+is+regulated+by+endothelin-1+and+stem+cell+factor+in+synergy+with+cyclic+AMP+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue.">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).</li><li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632.">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li><li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfollicular+epidermal+stem+cells:+boosting+and+rescuing+from+adult+skin.">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin.</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li><li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem/progenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity.">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li><li>Yokoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+suppression+of+MITF+expression+via+HDAC+inhibitors+in+the+melanocyte+lineage.">Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).</li><li>Mi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+promotes+keratinocyte+survival+and+paracrine+secretion,+enhancing+establishment+of+primary+human+melanocytes+and+melanocyte-keratinocyte+co-cultures.">A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).</li></ol>

Le protocole décrit ici était basé sur une publication récente16. Une certaine attention devrait être accordée aux étapes critiques suivantes pour obtenir les meilleurs résultats avec la nouvelle méthode. Tout d’abord, la séparation réussie de l’épiderme et du derme est cruciale. Couper les tissus du prépuce adulte en bandes de 3 à 4 mm de large à l’aide d’une lame de scalpel pour que le dispase fonctionne plus soigneusement et plus facilement pour séparer l’épiderme du ...

Le but de cette étude était de développer un protocole simple et efficace pour isoler les mélanocytes de l’épiderme de la peau adulte pour la recherche biologique et les applications cliniques. Les mélanocytes, qui sont situés dans l’épiderme basal de la peau et dans les follicules pileux, jouent un rôle important dans la pigmentation de la peau et des cheveux en produisant de la mélanine1. La pigmentation cutanée résultante des mélanocytes épidermiques agit comme un filtre de rayonnement ultraviolet qui réduit /empêche les dommages d’ADN aux cellules sous-jacentes dans la peau2. La prolifération anormale des mélanocytes dans la peau est assez commune, comme dans la formation de nevi bénin (taupes) dans lequel les mélanocytes potentiellement se transformer en croissance oncogène suivie par la sénescence cellulaire3.
Depuis 1957, l’isolement et la culture subséquente des mélanocytes primaires humains est possible4, mais ce n’est que depuis 1982 qu’il existe une méthode efficace qui peut reproduire les cultures de mélanocytes humains à partir de l’épiderme5. La méthode conventionnelle pour isoler les mélanocytes primaires de l’épiderme implique une digestion enzymatique en deux étapes. En bref, la peau est d’abord digérée avec du dispase pour séparer l’épiderme du derme, après quoi l’épiderme est digéré avec de la trypsine pour produire des suspensions contenant des mélanocytes et des kératinocytes, qui peuvent ensuite être cultivées sélectivement dans différents médias. Actuellement, la culture initiale prend habituellement environ 3 à 4 semaines pour que les mélanocytes atteignent la confluence en utilisant la méthode conventionnelle, qui est probablement due à la faible efficacité de leur isolement. Par conséquent, l’augmentation de la production initiale de mélanocytes à partir de tissus de la peau adulte serait très utile pour la recherche en laboratoire et les applications cliniques.
De nombreux facteurs de croissance, dont la plupart ont été sécrétés par les kératinocytes (p. ex., α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF et SCF)5à8, régulent la différenciation et la prolifération des mélanocytes mammifères. En l’absence de couches d’alimentation, l’absence de ces facteurs de croissance conduit à la diminution de la prolifération des mélanocytes et leur apoptose accrue9. La co-culture des kératinocytes comme cellules d’alimentation et de mélanocytes pourrait conduire à la prolifération accélérée des mélanocytes et à la réduction de l’apoptose. Cependant, la méthode de co-culture exige non seulement plus de tissus de peau pour préparer des kératinocytes, ce qui n’est pas pratique, mais aussi ne pourrait pas fonctionner efficacement parce que les conditions de culture exigées par les mélanocytes ne favorise pas la croissance des kératinocytes, et vice-versa.
Des études antérieures ont rapporté que l’ajout de Y-27632, un inhibiteur de ROCK, dans le milieu de croissance peut améliorer le rendement des cellules épidermiques primaires humaines des tissus de la peau10-14. Par conséquent, il serait intéressant de vérifier si l’isolement des mélanocytes primaires humains bénéficierait de la présence de Y-27632. En effet, l’ajout de Y-27632 dans le milieu15de tiva d’inoculation , qui contient TPA, IBMX, Na3VO4 et dbcAMP, a considérablement augmenté le rendement des mélanocytes primaires isolés des tissus de prépuce dans les cultures initiales16. Par rapport au protocole conventionnel, ce nouveau protocole est nettement plus efficace pour augmenter le rendement des mélanocytes16. Par conséquent, ce protocole décrit la nouvelle méthode en détail à l’aide de tissus cutanés adultes basés sur une étude précédente16 afin de promouvoir son application dans la recherche biologique de base et appliquée.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37119</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>431792</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026333</td>
			<td>For cell incubating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Shaker</td>
			<td>Shanghai Boxun</td>
			<td>150036</td>
			<td>For water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>For melanocyte isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C11995500</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1AC5</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5E44316</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-15371</td>
			<td>Induce pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5C42258</td>
			<td>For cell microscopic observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human MITF</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab12039</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>melanocytes culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-dibutyryladeno-sine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate (dbcAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA&#65289;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79346</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-human Ki-67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1020-500</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td>Cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20TM automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automatic cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>For melanocyte dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>For melanocyte isolation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

y-27632 enriches the yield of human melanocytes from adult skin tissues

L’isolement et la culture des mélanocytes primaires des tissus cutanés sont très importants pour la recherche biologique et ont été largement utilisés pour des applications cliniques. Isoler les mélanocytes primaires des tissus cutanés par la méthode conventionnelle prend habituellement environ 3 à 4 semaines pour passer suffisamment. Plus important encore, les tissus utilisés sont généralement des avant-parents nouveau-nés et il est encore un défi d’isoler efficacement les mélanocytes primaires des tissus adultes. Nous avons récemment mis au point une nouvelle méthode d’isolement pour les mélanocytes qui ajoute Y-27632, un inhibiteur de la rhénase, au milieu de culture initial pendant 48 h. Par rapport au protocole conventionnel, cette nouvelle méthode augmente considérablement le rendement des mélanocytes et raccourcit le temps nécessaire pour isoler les mélanocytes des tissus de prépuce. Nous décrivons maintenant cette nouvelle méthode plus en détail en utilisant l’épiderme adulte pour la culture efficace des mélanocytes primaires. Fait important, nous montrons que les mélanocytes obtenus à partir de tissus adultes préparés par cette nouvelle méthode peuvent fonctionner normalement. Ce nouveau protocole bénéficiera de manière significative aux études des défauts de pigmentation et des mélanomes utilisant des mélanocytes primaires préparés à partir de tissus de peau adultes facilement accessibles.

La figure 1 montre un diagramme schématique comparant les méthodes conventionnelles et les nouvelles. La procédure de préparation et de digestion des tissus avec la nouvelle méthode est la même que la procédure pour la méthode conventionnelle, la seule différence étant que les cellules isolées sont resuspendées dans 10 mL de TIVA moyen en présence de 10 μM Y-27632. Deux jours après l’ensemencement, remplacer le support par un support TIVA normal sans Y-27632. La méthode con...

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Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Cet article rapporte que l’ajout de Y-27632 à TIVA moyen peut augmenter considérablement le rendement des mélanocytes des tissus de la peau adulte.

Y-27632 enrichit le rendement des mélanocytes humains à partir de tissus cutanés adultes

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

L’objectif général du protocole basé sur les cellules est d’isoler et de culture les cellules des mélanocytes humains, améliorant ainsi les lacunes des méthodes conventionnelles. De la nouvelle méthode, nous pouvons obtenir de plus grandes quantités de cellules mélanocytes primaires dans un temps relativement court, basé sur des matériaux et des équipements. Les tissus humains utilisés dans ce protocole sont des adultes frais pour les tissus cutanés jetés de la chirurgie de circoncision à l’hôpital et manipulés conformément aux lignes directrices du numéro 2015120401 du Comité d’éthique de la recherche humaine de l’institution, date du 12 mai 2015.Il s’agit d’un affichage de tous les reagents requis. Préparer les instruments stériles et les matériaux à l’avance et mettre le tissu dans un plat, laver le tissu avec 75% d’éthanol pendant 30 secondes et avec des lavages solution attache cinq minutes chacun coupe le tissu en morceaux pratiques et gratter le tissu avec la lame chirurgicale pour enlever la couche de graisse. Aplatir les tissus avec le côté derme vers le bas ajouter 2,5 milligrammes par millilitre la solution spatiale pour les tissus de la peau.Couvrir et conserver les morceaux à quatre degrés centigrades pendant la nuit. Le deuxième jour, décoller l’épiderme du derme et transférer immédiatement l’épiderme dans trois autres plats avec solution de lavage à son tour submerge 0,05% trypsine dans le tube incubé pendant 30 minutes dans un bain d’eau à 37 degrés centigrades. Ajoutez un volume égal de la solution de neutralisation.Pipettes la solution de haut en bas pour 10 à 15 fois. Passez la solution à travers un filtre à purée de 100 micromètres. centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq minutes enlever le supernatant re-suspendre la palette cellulaire en 10 millilitres de tiva moyen.Ajouter 10 micromètres de Y-27632. Marquez l’information c’est le champ de vision sous le microscope. Il montre des cellules flottant dans le milieu d’incubation dans un incubateur centigrade de 37 degrés.Cette vue montre la vue le deuxième jour où les cellules ont commencé à fixer le fond du plat. Et la vue du neuvième jour montre des dépôts évidents de mélanocytes existent. Retirer le supernatant laver les cellules avec PBS ajouter deux millimètres de 0,05% trypsine incuber les cellules pendant deux minutes ajouter deux millilitres de la solution de neutralisation.centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq minutes. Retirer le supernatant lentement re-suspendre la palette cellulaire avec 10 millimètres de milieu tiva. Changez le milieu tous les deux jours.Ces images montrent les vues du passage d’un diagramme schématique de sorte que la nouvelle méthode et la méthode conventionnelle sont présentées dans cette figure. La procédure de préparation des tissus et la digestion de la nouvelle méthode est la même que la méthode conventionnelle. La seule différence est que les cellules adipeuses isolées inoculées en 10 minutes dans son milieu tiva avec la présence de 10 micromètres Y-27632.Après deux jours remplacer les médias par tiva moyen sans suppléments à Y-27632. Ce panneau montre des images représentatives des mélanocytes préparés par la ligne supérieure conventionnelle de méthode et par la nouvelle ligne inférieure de méthode au jour trois, sixième jour et jour huit après l’inoculation initiale nous appelons le nombre de mélanocytes au jour trois, sixième et huit, nous avons constaté que la nouvelle méthode a augmenté le rendement des mélanocytes d’environ cinq fois. Après huit jours compteur, nous avons fait douzaine et compter le nombre de mélanocytes dans chaque plat unique.Les résultats ont montré que le nombre de mélanocytes isolés par une nouvelle méthode est beaucoup plus que la méthode conventionnelle. Ki67 debout confirmer que les mélanocytes isolés par une nouvelle méthode peut normalement proliférer plus important encore, nous avons obtenu la fonction normale des mélanocytes avec la nouvelle méthode. Nous avons vérifié la pureté des mélanocytes après le passage initial de l’isolement.Le passage un mélanocytes pour le stand pour l’expression de MITF qui s’est exprimé seulement dans les mélanocytes. Et nous avons trouvé près de 100% cellules étaient positives pour MITF indiquant les mélanocytes purs obtenus après le premier passage. Tester les mélanocytes isolés des nouvelles méthodes peut fonctionner normalement.Nous avons traité les mélanocytes avec refroidissement de force pendant plus de 90 in vitro et observons que le refroidissement de force peut induire la pigmentation des mélanocytes. La prise de ces données ensemble suggère que les mélanocytes isolés de la nouvelle méthode peuvent normalement produire la pigmentation. Les mélanocytes primaires, tels qu’énoncés ci-dessus de la peau et étendus en culture, ont été facilement utilisés pour la recherche en laboratoire et les applications cliniques.Après avoir signalé que ID Y-27632 dans le milieu de culture initial avant deux jours peut augmenter considérablement l’out des mélanocytes. En résumé, nous avons réussi à établir une nouvelle méthode simple et très efficace pour isoler les mélanocytes primaires purs des tissus adultes.

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