Name: y-27632 enriches the yield of human melanocytes from adult skin tissues
Uploaded: 2020-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues at JoVE.com

이 작품은 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2017YFA0104604), 중국 국립 자연 과학 재단의 일반 프로그램 (81772093), 군사 물류 연구 프로젝트 (AWS17J005), 산동성 자연 과학 재단 (ZR2019ZD33)의 주요 프로그램에 의해 지원되었습니다. 6) 산동성 의 주요 연구 개발 프로그램 (2019GSF108107) X.W. 광동 기본 및 응용 기본 연구 재단 (2019A1515110833) 및 산동대학의 기초 연구 기금 (2019GN043)에 J.M.

이 프로토콜에서 성인 포피 티슈의 사용은 인간 연구 윤리위원회 (No.2015120401, 날짜 : 2015년 5월 12일)에 의해 승인되었습니다.
참고: 세포와 배양물의 오염을 방지하기 위해 멸균 환경에서 다음 모든 절차를 수행합니다.
1. 준비
<ol><li>10mL의 인산염 완충식염(PBS)을 포함하는 15mL 튜브에서 할례 수술로부터 신선한 성인 포피피 조직을 수집하고 4°C에 보관하십...

<ol>
	<li>Costin, G. E., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+pigmentation:+melanocytes+modulate+skin+color+in+response+to+stress.">Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress.</a> FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).</li><li>Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosinase+gene+expression+in+human+tissues.">Tyrosinase gene expression in human tissues.</a> Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).</li><li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi.">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li><li>Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanocytes+in+tissue+culture.">Human melanocytes in tissue culture.</a> Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).</li><li>Eisinger, M., Marko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+proliferation+of+normal+human+melanocytes+in+vitro+in+the+presence+of+phorbol+ester+and+cholera+toxin.">Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).</li><li>Hirobe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+keratinocyte-derived+factors+involved+in+regulating+the+proliferation+and+differentiation+of+mammalian+epidermal+melanocytes.">Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).</li><li>Halaban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+from+human+keratinocytes+is+a+natural+mitogen+for+melanocytes.">Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).</li><li>Kunisada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+expression+of+transgenic+hepatocyte+growth+factor+affects+melanocyte+development,+leading+to+dermal+melanocytosis.">Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis.</a> Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).</li><li>Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+human+melanocytes+is+regulated+by+endothelin-1+and+stem+cell+factor+in+synergy+with+cyclic+AMP+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue.">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).</li><li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632.">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li><li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfollicular+epidermal+stem+cells:+boosting+and+rescuing+from+adult+skin.">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin.</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li><li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem/progenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity.">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li><li>Yokoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+suppression+of+MITF+expression+via+HDAC+inhibitors+in+the+melanocyte+lineage.">Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).</li><li>Mi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+promotes+keratinocyte+survival+and+paracrine+secretion,+enhancing+establishment+of+primary+human+melanocytes+and+melanocyte-keratinocyte+co-cultures.">A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).</li></ol>

여기에 설명된 프로토콜은 최근 간행물16을기반으로 했습니다. 새로운 방법으로 최상의 결과를 얻으려면 다음 중요한 단계에 주의를 기울여야 합니다. 첫째, 표피와 진피의 성공적인 분리가 중요합니다. 성인 포피 조직을 메스 블레이드를 사용하여 3-4mm 너비의 스트립으로 잘라 내어 디스파가 더 철저하고 쉽게 변미에서 표피를 분리할 수 있도록 합니다. 둘째, 이 두 층을 분리할...

이 연구의 목표는 생물학적 연구 및 임상 응용을 위해 성인 피부표에서 멜라닌신을 분리하는 간단하고 효과적인 프로토콜을 개발하는 것이었습니다. 피부의 기저 표피와 모낭에 위치한 멜라닌 세포는 멜라닌1을생성하여 피부와 모발의 색소 침착에 중요한 역할을 한다. 표피 멜라닌세포로부터의 피부 색소 침착은 피부2의근본적인 세포에 DNA 손상을 줄여 방지하는 자외선 필터역할을 한다. 피부에 있는 멜라닌세포의 비정상적인 증식은 멜라닌세포가 잠재적으로 세포 노화3에선행된 종양발생 성장으로 잠재적으로 변환되는 양성 네비(moles)의 형성과 같이 아주 일반적이다.
1957년 이래, 인간 1차 멜라닌세포의 고립및 후속 배양은4가가능했지만, 1982년부터만 표피5로부터인간의 멜라닌세포의 배양을 재현가능하게 확립할 수 있는 효율적인 방법이 있었다. 표피로부터 1차 멜라닌세포를 분리하는 종래의 방법은 2단계 효소 소화를 포함한다. 간단히 말해서, 피부는 처음에 진피에서 표피를 분리하기 위해 디스파스로 소화되며, 그 후 표피는 트립신으로 소화되어 멜라노세포와 각질 세포가 함유된 현탁액을 생성하며, 이는 다른 미디어에서 선택적으로 재배될 수 있다. 현재, 초기 배양은 일반적으로 멜라닌세포가 기존의 방법을 사용하여 합류에 도달하는 데 약 3~4주가 걸리며, 이는 그들의 격리효율이 낮기 때문일 가능성이 높다. 따라서 성인 피부 조직에서 멜라닌 세포의 초기 생산을 증가 실험실 연구 및 임상 응용 모두에 대 한 매우 도움이 될 것 이다.
많은 성장 인자, 대부분은 각질 세포에 의해 분비되는 것으로 나타났다 (예를 들어, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF 및 SCF)5-8,포유류 멜라노사이클의 분화 및 확산을 조절. 피더 층이 없는 경우, 이러한 성장 인자의 부족은 멜라닌세포의 증식 감소와 세포멸 감소9로이어집니다. 피더 세포와 멜라닌세포로 각질 세포의 공동 배양은 멜라닌세포 증식을 가속화하고 세포멸을 감소시킬 수 있다. 그러나, 공동 배양 방법은 실용적이지 않은 각질 세포를 준비하기 위해 더 많은 피부 조직을 요구할 뿐만 아니라 멜라노세포에 요구되는 배양 조건이 각질 세포 성장을 선호하지 않기 때문에 효율적으로 작동할 수 없으며, 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
이전 연구는 Y-27632의 추가, ROCK 억제제, 성장 배지에 피부 조직에서 인간의 일차 표피 세포의 수율을 향상시킬 수 있다고 보고10-14. 따라서, 인간 1 차적인 멜라닌세포의 격리가 Y-27632의 존재에서 유익할 지 여부를 시험하는 것이 흥미로할 것입니다. 실제로, Y-27632를 접종 TIVA배지(15)에첨가하여 TPA, IBMX, Na3VO4 및 dbcAMP를 함유하고 있으며, 초기 배양에서 포피 조직으로부터 분리된 1차 멜라닌세포의 수율을 크게증가시켰다(16). 종래의 프로토콜에 비해, 이 새로운 프로토콜은멜라닌세포(16)의수율을 높이는 데 훨씬 더 효율적입니다. 따라서, 본 프로토콜은 기초및 적용된 생물학적 연구에서 적용을 촉진하기 위해 이전 연구16을 기반으로 성인 피부 조직을 사용하여 새로운 방법을 자세히 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37119</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>431792</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026333</td>
			<td>For cell incubating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Shaker</td>
			<td>Shanghai Boxun</td>
			<td>150036</td>
			<td>For water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>For melanocyte isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C11995500</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1AC5</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5E44316</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-15371</td>
			<td>Induce pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5C42258</td>
			<td>For cell microscopic observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human MITF</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab12039</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>melanocytes culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-dibutyryladeno-sine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate (dbcAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA&#65289;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79346</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-human Ki-67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1020-500</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td>Cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20TM automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automatic cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>For melanocyte dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>For melanocyte isolation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

y-27632 enriches the yield of human melanocytes from adult skin tissues

피부 조직에서 1 차적인 멜라닌세포의 격리 그리고 문화는 생물학 연구를 위해 아주 중요하고 임상 응용을 위해 널리 이용되고 있습니다. 종래의 방법에 의한 피부 조직으로부터 1차 멜라닌세포를 분리하는 데는 보통 충분히 통과하기까지 약 3~4주가 소요된다. 더 중요한 것은, 사용된 조직은 일반적으로 신생아 포킨스이고 성인 조직에서 1 차적인 melanocytes를 효율적으로 격리하는 도전입니다. 최근에는 Rho 키나아제 억제제인 Y-27632를 초기 배양 배지에 48h.를 추가하는 멜라닌세포에 대한 새로운 절연 방법을 개발했습니다. 우리는 지금 1 차적인 melanocytes를 능통하게 배양하기 위하여 성인 표피를 사용하여 더 자세히 이 새로운 방법을 기술합니다. 중요한 것은, 우리는 이 새로운 방법에 의해 제조된 성인 조직에서 얻은 멜라닌세포가 정상적으로 작동할 수 있다는 것을 보여줍니다. 이 새로운 프로토콜은 쉽게 접근 성인 피부 조직에서 제조된 1 차적인 흑색종을 사용하여 색소 침착 결함 및 흑색종의 연구 결과를 현저하게 유익할 것입니다.

도 1은 종래와 새 방법을 비교하는 회로도를 나타낸다. 새로운 방법을 이용한 조직 제제 및 소화 절차는 종래의 방법에 대한 절차와 동일하며, 유일한 차이점은 10 μM Y-27632의 존재시 TIVA 배지의 10mL에서 분리된 세포가 재주중단된다는 것입니다. 시드 후 이틀 후, Y-27632없이 일반 TIVA 매체로 미디어를 교체하십시오. 피부 조직에서 1 차적인 melanocytes를 격리하는 전통적인 방법은...

Watch this Scientific Journal Video about Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues at JoVE.com

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

이 논문은 TIVA 배지에 Y-27632를 첨가하면 성인 피부 조직에서 멜라닌세포의 수율을 크게 증가시킬 수 있다고 보고합니다.

Y-27632 성인 피부 조직에서 인간 멜라닌 세포의 수율을 강화

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

세포 기반 프로토콜의 일반적인 목표는 인간 멜라닌세포 세포를 분리하고 배양하여 기존의 방법의 단점을 개선하는 것이다. 새로운 방법에서 우리는 재료 와 장비에 따라 상대적으로 짧은 시간에 1 차적인 멜라닌 세포의 더 많은 양을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 인간 조직은 2015년 5월 12일 자, 병원의 할례 수술에서 버려지고 기관의 인간 연구 윤리위원회 번호 2015120401의 지침에 따라 취급된 피부 조직에 대한 신선한 성인입니다.이것은 필요한 모든 시약의 표시입니다. 멸균 기기와 재료를 미리 준비하고 조직을 접시에 넣고, 조직을 75%에탄올로 30초 간 세척하고, 세차액으로 조직을 5분간 편리하게 잘라내고 수술용 블레이드로 조직을 스크랩하여 지방층을 제거한다. 진피 측으로 조직을 평평하게 하여 밀리리터당 2.5밀리그램을 피부 조직에 공간 용액을 추가합니다.뚜껑을 덮고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 둘째 날, 진피에서 표피를 벗겨 내고 즉시 37도센티미터의 수조에서 30분 동안 배양된 튜브에 0.05%의 트립신을 침수하여 세척용으로 다른 3가지 접시로 표피를 옮기는 다. 중화 솔루션의 동일한 볼륨을 추가합니다.10~15회 용액을 위아래로 피펫합니다. 100 마이크로미터 매시 필터를 통해 솔루션을 전달합니다. 5 분 동안 200 배 g에서 원심 분리기는 티바 배지의 10 밀리리터에서 셀 팔레트를 다시 중단하는 슈퍼 네티얼을 제거합니다.Y-27632의 10 마이크로미터를 추가합니다. 현미경의 밑에 보기의 필드인 정보를 표시합니다. 그것은 37섭씨 인큐베이터에서 배지 인큐베이트에 떠있는 세포를 보여줍니다.이 뷰는 세포가 접시의 바닥을 연결하기 시작한 둘째 날의 보기를 보여줍니다. 그리고 9일째에 보는 것은 멜라닌세포의 명백한 예금이 존재한다는 것을 보여줍니다. PBS로 셀을 세척하는 상체 세척을 제거하면 2 분 동안 세포를 배양하는 0.05 %의 2 밀리미터를 추가하여 중화 용액의 2 밀리리터를 추가합니다.원심 분리기는 5 분 동안 200 배 g에서. 10mm의 티바 배지로 셀 팔레트를 천천히 다시 일시 중단하는 상체를 제거합니다. 2일마다 배지를 변경합니다.이 사진은 새로운 방법과 종래의 방법이 이 그림에 제시되도록 하나의 회로도도의 구절의 전망을 보여줍니다. 조직 제제 및 새로운 방법의 소화를 위한 절차는 종래의 방법과 동일하다. 유일한 차이점은 10 마이크로 미터 Y-27632의 존재와 그녀의 티바 매체에서 10 분 안에 접종 된 고립 된 지방 세포입니다.이틀 후 Y-27632에서 보충 교재 없이 티바 매체로 미디어를 대체. 본 패널은 종래의 메소드 탑 행에 의해 제조된 멜라닌세포의 대표적인 이미지를 보여주며, 3일째, 6일째, 8일째에 멜라닌세포의 수를 호출한 후 3일째, 6일째 및 8일째에 새로운 방법 하단행에 의해, 새로운 방법은 멜라닌세포 수율을 약 5배 증가시켰다는 것을 발견했다. 8 일 카운터 후 우리는 다스를했고 각 단일 요리에 멜라닌 세포의 수를 계산합니다.결과는 새로운 방법에 의해 분리된 멜라닌세포의 수가 종래의 방법보다 훨씬 더 많은 것을 보여주었다. Ki67 서 새로운 방법에 의해 분리 된 멜라닌 세포가 일반적으로 증식 할 수 있음을 확인 더 중요하게 우리는 새로운 방법으로 멜라닌 세포의 정상적인 기능을 얻었다. 우리는 격리에서 초기 통로 후에 멜라닌세포의 순도를 확인했습니다.멜라닌세포에서만 표현된 MITF 발현을 위한 1개의 멜라닌세포통로. 그리고 우리는 거의 100%의 세포가 첫번째 통로 후에 얻은 순수한 멜라닌세포를 나타내는 MITF를 위해 긍정적이었다는 것을 것을을 발견했습니다. 새로운 방법에서 분리된 멜라닌세포를 테스트하는 것은 정상적으로 작동할 수 있다.우리는 체외에서 90 개 이상의 힘 냉각으로 멜라닌세포를 처리하고 힘 냉각이 멜라닌세포의 색소 침착을 유도 할 수 있음을 관찰했다. 이러한 데이터를 종합해서 새로운 방법에서 분리된 멜라닌세포가 일반적으로 색소 침착을 생성할 수 있음을 시사한다. 1 차적인 멜라닌세포는, 위에 명시되고 문화에서 확장된 바와 같이 실험실 연구 및 임상 응용을 위해 쉽게 사용되었습니다.ID Y-27632가 2일 전에 초기 배양 배지로 보고하면 멜라닌세포에서 크게 증가할 수 있다. 요약하자면, 우리는 성공적으로 성인 조직에서 순수한 기본 멜라닌세포를 분리하는 새로운 간단하고 매우 효율적인 방법을 설립했다.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

성인 Zebrafish에서 기관의 해부

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아의 분리

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

서스펜션의 HEK293 세포의 과도 형질와 재조합 인간 단백질의 높은 수율 식

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...