Name: y-27632 enriches the yield of human melanocytes from adult skin tissues
Uploaded: 2020-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2017YFA0104604), O Programa Geral da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81772093), Projeto de Pesquisa Logística Militar (AWS17J005), o Programa Chave da Fundação de Ciências Naturais da Província de Shandong (ZR2019ZD36) e o Programa de Pesquisa e Desenvolvimento Chave da Província de Shandong (2019GSF108107) para x.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A151510833) e Os Fundos Fundamentais de Pesquisa da Universidade de Shandong (2019GN043) para J.M.

O uso de tecidos de prepúcio adulto neste protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana (nº 2015120401, data: 12 de maio de 2015).
NOTA: Realize todos os seguintes procedimentos em um ambiente estéril para evitar contaminações de células e culturas.
1. Preparativos
<ol><li>Reúna tecidos de prepúcio adulto frescos de cirurgias de circuncisão em tubos de 15 mL contendo 10 mL de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) e armazene em 4 °...

<ol>
	<li>Costin, G. E., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+pigmentation:+melanocytes+modulate+skin+color+in+response+to+stress.">Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress.</a> FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).</li><li>Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosinase+gene+expression+in+human+tissues.">Tyrosinase gene expression in human tissues.</a> Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).</li><li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi.">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li><li>Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanocytes+in+tissue+culture.">Human melanocytes in tissue culture.</a> Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).</li><li>Eisinger, M., Marko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+proliferation+of+normal+human+melanocytes+in+vitro+in+the+presence+of+phorbol+ester+and+cholera+toxin.">Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).</li><li>Hirobe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+keratinocyte-derived+factors+involved+in+regulating+the+proliferation+and+differentiation+of+mammalian+epidermal+melanocytes.">Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).</li><li>Halaban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+from+human+keratinocytes+is+a+natural+mitogen+for+melanocytes.">Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).</li><li>Kunisada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+expression+of+transgenic+hepatocyte+growth+factor+affects+melanocyte+development,+leading+to+dermal+melanocytosis.">Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis.</a> Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).</li><li>Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+human+melanocytes+is+regulated+by+endothelin-1+and+stem+cell+factor+in+synergy+with+cyclic+AMP+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue.">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).</li><li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632.">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li><li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfollicular+epidermal+stem+cells:+boosting+and+rescuing+from+adult+skin.">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin.</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li><li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem/progenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity.">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li><li>Yokoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+suppression+of+MITF+expression+via+HDAC+inhibitors+in+the+melanocyte+lineage.">Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).</li><li>Mi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+promotes+keratinocyte+survival+and+paracrine+secretion,+enhancing+establishment+of+primary+human+melanocytes+and+melanocyte-keratinocyte+co-cultures.">A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).</li></ol>

O protocolo descrito aqui foi baseado em uma publicação recente16. Alguma atenção deve ser dada aos seguintes passos críticos para alcançar os melhores resultados com o novo método. Em primeiro lugar, a separação bem sucedida da epiderme e da derme é crucial. Corte os tecidos de prepúcio adulto em tiras de 3-4 mm de largura usando uma lâmina de bisturi para fazer o dispase funcionar com mais profundidade e facilidade para separar a epiderme da derme. Em segundo lugar, ao separar essas ...

O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo simples e eficaz para isolar melanócitos da epiderme da pele adulta para pesquisa biológica e aplicações clínicas. Os melanócitos, localizados na epiderme basal da pele e nos folículos capilares, desempenham um papel importante na pigmentação da pele e do cabelo, produzindo melanina1. A pigmentação da pele resultante dos melanócitos epidérmicos atua como um filtro de radiação ultravioleta que reduz/previne danos ao DNA às células subjacentes na pele2. A proliferação anormal de melanócitos na pele é bastante comum, como na formação de nevi benigno (mols) em que os melanócitos potencialmente se transformam em crescimento oncogênico seguido pela senescência celular3.
Desde 1957, o isolamento e a cultura subsequente dos melanócitos primários humanos são possíveis4, mas somente desde 1982 existe um método eficiente que pode estabelecer de forma reproduzivelmente culturas de melanócitos humanos a partir da epiderme5. O método convencional para isolar melanócitos primários da epiderme envolve uma digestão enzimática de duas etapas. Resumidamente, a pele é inicialmente digerida com despase para separar a epiderme da derme, após a qual a epiderme é digerida com trippsina para produzir suspensões contendo melanócitos e queratinócitos, que podem então ser cultivados seletivamente em diferentes mídias. Atualmente, a cultura inicial geralmente leva cerca de 3 a 4 semanas para que os melanócitos atinjam a confluência usando o método convencional, o que é provável devido à baixa eficiência de seu isolamento. Portanto, aumentar a produção inicial de melanócitos a partir de tecidos de pele adultos seria bastante útil tanto para pesquisas laboratoriais quanto para aplicações clínicas.
Muitos fatores de crescimento, a maioria dos quais têm se mostrado secretados por queratinócitos (por exemplo, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF e SCF)5-8, regulam a diferenciação e proliferação de melanócitos mamíferos. Na ausência de camadas alimentadores, a falta desses fatores de crescimento leva à diminuição da proliferação de melanócitos e ao aumento da apoptose9. A co-cultura dos queratinócitos como células alimentadoras e melanócitos poderia levar à acelerada proliferação de melanócitos e à redução da apoptose. No entanto, o método de cocultura não só exige mais tecidos da pele para preparar queratinócitos, o que não é prático, mas também não poderia funcionar de forma eficiente porque as condições culturais exigidas pelos melanócitos não favorecem o crescimento do queratinócito, e vice-versa.
Estudos anteriores relataram que a adição do Y-27632, um inibidor de ROCHA, no meio de crescimento pode aumentar o rendimento das células epidérmicas primárias humanas dos tecidos da pele10-14. Portanto, seria interessante testar se o isolamento dos melanócitos primários humanos beneficiaria da presença de Y-27632. De fato, a adição de Y-27632 no meio TIVA de inoculação15, que contém TPA, IBMX, Na3VO4 e dbcAMP, aumentou significativamente o rendimento de melanócitos primários isolados dos tecidos prepúcios nas culturas iniciais16. Em comparação com o protocolo convencional, este novo protocolo é significativamente mais eficiente no aumento do rendimento dos melanócitos16. Portanto, este protocolo descreve o novo método em detalhes utilizando tecidos de pele adultos com base em um estudo anterior16, a fim de promover sua aplicação em pesquisas biológicas básicas e aplicadas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37119</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>431792</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026333</td>
			<td>For cell incubating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Shaker</td>
			<td>Shanghai Boxun</td>
			<td>150036</td>
			<td>For water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>For melanocyte isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C11995500</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1AC5</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5E44316</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-15371</td>
			<td>Induce pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5C42258</td>
			<td>For cell microscopic observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human MITF</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab12039</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>melanocytes culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-dibutyryladeno-sine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate (dbcAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA&#65289;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79346</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-human Ki-67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1020-500</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td>Cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20TM automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automatic cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>For melanocyte dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>For melanocyte isolation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

y-27632 enriches the yield of human melanocytes from adult skin tissues

O isolamento e a cultura dos melanócitos primários dos tecidos da pele é muito importante para a pesquisa biológica e tem sido amplamente utilizado para aplicações clínicas. Isolar melanócitos primários dos tecidos da pele pelo método convencional geralmente leva cerca de 3 a 4 semanas para passar o suficiente. Mais importante, os tecidos utilizados geralmente são prepúcios recém-nascidos e ainda é um desafio isolar eficientemente os melanócitos primários de tecidos adultos. Recentemente desenvolvemos um novo método de isolamento para melanócitos que adiciona Y-27632, um inibidor de Rho quinase, ao meio de cultura inicial por 48 h. Em comparação com o protocolo convencional, este novo método aumenta drasticamente o rendimento dos melanócitos e encurta o tempo necessário para isolar melanócitos de tecidos foreskin. Descrevemos agora este novo método com mais detalhes usando epiderme adulta para cultivar de forma eficiente melanócitos primários. É importante ressaltar que os melanócitos obtidos a partir de tecidos adultos preparados por este novo método podem funcionar normalmente. Este novo protocolo beneficiará significativamente os estudos de defeitos de pigmentação e melanomas usando melanócitos primários preparados a partir de tecidos de pele adultos de fácil acesso.

A Figura 1 mostra um diagrama esquemático comparando os métodos convencionais e os novos. O procedimento de preparação e digestão tecidual com o novo método é o mesmo que o procedimento para o método convencional, sendo que a única diferença é que as células isoladas são resuspengiadas em 10 mL de meio TIVA na presença de 10 μM Y-27632. Dois dias após a semeadura, substitua a mídia por um meio TIVA normal sem Y-27632. O método convencional de isolar melanócitos primários ...

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Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Este artigo relata que a adição de Y-27632 ao meio TIVA pode aumentar significativamente o rendimento de melanócitos de tecidos de pele adultos.

Y-27632 Enriquece o rendimento de melanócitos humanos de tecidos de pele adultos

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

O objetivo geral do protocolo baseado em células é isolar e cultivar células de melanócitos humanos, melhorando as deficiências dos métodos convencionais. A partir do novo método podemos obter maiores quantidades de células melanócitos primárias em um tempo relativamente curto, com base em materiais e equipamentos. Os tecidos humanos utilizados neste protocolo são adultos frescos para tecidos de pele descartados da cirurgia de circuncisão no hospital e manuseados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa Humana da Instituição número 2015120401, data de 12 de maio de 2015.Esta é uma exibição de todos os reagentes necessários. Prepare instrumentos e materiais estéreis com antecedência e coloque o tecido em um prato, lave o tecido com 75% de etanol por 30 segundos e com as amarras da solução de lavagem de cinco minutos cada um corta o tecido em pedaços convenientes e raspa o tecido com lâmina cirúrgica para remover a camada de gordura. Achate os tecidos com o lado de dermis para baixo adicione 2,5 miligramas por mililitro a solução espacial para os tecidos da pele.Cubra e armazene as peças a quatro graus centígrados durante a noite. No segundo dia, retire a epiderme da derme e transfira imediatamente a epiderme em outros três pratos com solução de lavagem, por sua vez, submerge 0,05% de trippsina no tubo incubado por 30 minutos em um banho de água a 37 graus centígrados. Adicione um volume igual da solução de neutralização.Pipeta a solução para cima e para baixo por 10 a 15 vezes. Passe a solução através de um filtro de massa de 100 micrômetros. centrífuga a 200 vezes g por cinco minutos remova a re-suspensão do pallet celular em 10 mililitros de meio tiva.Adicione 10 micrômetros de Y-27632. Marque a informação que este é o campo de visão sob o microscópio. Mostra células flutuando no meio incubado em uma incubadora centígrada de 37 graus.Esta vista mostra a vista no segundo dia as células começaram a anexar a parte inferior do prato. E a visão do nono dia mostra que existem depósitos óbvios de melanócitos. Remova a lavagem supernaca das células com PBS adicione dois milímetros de 0,05% de trippsina incubar as células por dois minutos adicione dois mililitros da solução de neutralização.centrífuga a 200 vezes g por cinco minutos. Remova lentamente o supernatante para suspender lentamente a pálete celular com 10 milímetros de meio tivo. Troque o meio a cada dois dias.Estas imagens mostram as visões da passagem um diagrama esquemático para que o novo método e o método convencional sejam apresentados nesta figura. O procedimento para preparação tecidual e digestão de novo método é o mesmo do método convencional. A única diferença é que as células de gordura isoladas inocularam em 10 minutos em seu meio tivo com a presença de 10 micrômetros Y-27632.Após dois dias substitua a mídia por tiva medium sem suplementos em Y-27632. Este painel mostra imagens representativas de melanócitos preparados pela linha superior do método convencional e pela nova linha inferior do método no terceiro dia, dia seis e oitavo após a inoculação inicial que chamamos de número de melanócitos no terceiro dia, dia seis e oito, descobrimos que o novo método aumentou o rendimento dos melanócitos em cerca de cinco vezes. Depois de oito dias contra fizemos dúzia e contamos o número de melanócitos em cada prato.Os resultados mostraram que o número de melanócitos isolados pelo novo método é muito maior do que o método convencional. Ki67 em pé confirmam que os melanócitos isolados pelo novo método podem normalmente proliferar mais importante, obtivemos função normal dos melanócitos com o novo método. Verificamos a pureza dos melanócitos após a passagem inicial do isolamento.A passagem um melanócitos para defender a expressão MITF que se expressava apenas em melanócitos. E descobrimos que quase 100% das células eram positivas para o MITF indicando melanócitos puros obtidos após a primeira passagem. Para testar melanócitos isolados dos novos métodos pode funcionar normalmente.Tratamos melanócitos com resfriamento de força para mais de 90 in vitro e observamos que o resfriamento de força pode induzir a pigmentação de melanócitos. A coleta desses dados sugere que os melanócitos isolados do novo método normalmente podem produzir pigmentação. Os melanócitos primários, como indicado acima da pele e estendidos na cultura têm sido facilmente utilizados para pesquisas laboratoriais e aplicações clínicas.Tendo relatado que o ID Y-27632 no meio de cultura inicial antes de dois dias pode aumentar drasticamente a saída dos melanócitos. Em resumo, estabelecemos com sucesso um novo método simples e altamente eficiente para isolar melanócitos primários puros de tecidos adultos.

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