Name: y-27632 enriches the yield of human melanocytes from adult skin tissues
Uploaded: 2020-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFA0104604), el Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81772093), Proyecto de Investigación Logística Militar (AWS17J005), el Programa Clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2019ZD36) y el Programa clave de investigación y desarrollo de la provincia de Shandong (2019GSF108107) a X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) y The Fundamental Research Funds of Shandong University (2019GN043) a J.M.

El uso de tejidos adultos de antepuesto en este protocolo ha sido aprobado por el Comité de ética de la investigación humana (No.2015120401, fecha: 12 de mayo de 2015).
NOTA: Realice todos los procedimientos siguientes en un entorno estéril para evitar contaminaciones de células y cultivos.
1. Preparativos
<ol><li>Reunir los tejidos adultos frescos del prepucio de las cirugías de circuncisión en tubos de 15 ml que contengan 10 ml de solución salina tampón...

<ol>
	<li>Costin, G. E., Hearing, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+pigmentation:+melanocytes+modulate+skin+color+in+response+to+stress.">Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress.</a> FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).</li><li>Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosinase+gene+expression+in+human+tissues.">Tyrosinase gene expression in human tissues.</a> Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).</li><li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi.">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li><li>Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanocytes+in+tissue+culture.">Human melanocytes in tissue culture.</a> Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).</li><li>Eisinger, M., Marko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+proliferation+of+normal+human+melanocytes+in+vitro+in+the+presence+of+phorbol+ester+and+cholera+toxin.">Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).</li><li>Hirobe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+keratinocyte-derived+factors+involved+in+regulating+the+proliferation+and+differentiation+of+mammalian+epidermal+melanocytes.">Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes.</a> Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).</li><li>Halaban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+from+human+keratinocytes+is+a+natural+mitogen+for+melanocytes.">Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).</li><li>Kunisada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+expression+of+transgenic+hepatocyte+growth+factor+affects+melanocyte+development,+leading+to+dermal+melanocytosis.">Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis.</a> Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).</li><li>Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+of+human+melanocytes+is+regulated+by+endothelin-1+and+stem+cell+factor+in+synergy+with+cyclic+AMP+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).</li><li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells.">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue.">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).</li><li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632.">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li><li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfollicular+epidermal+stem+cells:+boosting+and+rescuing+from+adult+skin.">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin.</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li><li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem/progenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity.">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li><li>Yokoyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+suppression+of+MITF+expression+via+HDAC+inhibitors+in+the+melanocyte+lineage.">Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).</li><li>Mi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+promotes+keratinocyte+survival+and+paracrine+secretion,+enhancing+establishment+of+primary+human+melanocytes+and+melanocyte-keratinocyte+co-cultures.">A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).</li></ol>

El protocolo descrito aquí se basó en una publicación reciente16. Se debe prestar cierta atención a los siguientes pasos críticos para lograr los mejores resultados con el nuevo método. En primer lugar, la separación exitosa de la epidermis y la dermis es crucial. Corte los tejidos adultos del prepucio en tiras de 3-4 mm de ancho usando una cuchilla de bisturí para hacer que el dispase funcione más a fondo y fácilmente para separar la epidermis de la dermis. En segundo lugar, al separar ...

El objetivo de este estudio fue desarrollar un protocolo simple y eficaz para aislar los melanocitos de la epidermis de la piel adulta para la investigación biológica y aplicaciones clínicas. Los melanocitos, que se encuentran en la epidermis basal de la piel y en los folículos pilosos, desempeñan un papel importante en la pigmentación de la piel y el cabello produciendo melanina1. La pigmentación cutánea resultante de los melanocitos epidérmicos actúa como un filtro de radiación ultravioleta que reduce/previene el daño del ADN a las células subyacentes en la piel2. La proliferación anormal de melanocitos en la piel es bastante común, como en la formación de nevi benignos (moles) en los que los melanocitos potencialmente se transforman en crecimiento oncogénico seguido de la senescencia celular3.
Desde 1957, el aislamiento y posterior cultura de los melanocitos primarios humanos ha sido posible4, pero sólo desde 1982 ha habido un método eficiente que puede establecer reproduciblemente culturas de melanocitos humanos de la epidermis5. El método convencional para aislar los melanocitos primarios de la epidermis implica una digestión enzimática de dos pasos. Brevemente, la piel se digiere inicialmente con dispase para separar la epidermis de la dermis, después de lo cual la epidermis se digiere con tripina para producir suspensiones que contienen melanocitos y queratinocitos, que luego pueden ser cultivados selectivamente en diferentes medios. Actualmente, el cultivo inicial suele tardar entre 3 y 4 semanas en llegar a la confluencia utilizando el método convencional, que es probable que se deba a la baja eficiencia de su aislamiento. Por lo tanto, aumentar la producción inicial de melanocitos a partir de tejidos cutáneos adultos sería muy útil tanto para la investigación de laboratorio como para aplicaciones clínicas.
Muchos factores de crecimiento, la mayoría de los cuales han demostrado ser secretados por queratinocitos (p. ej., -MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF y SCF)5-8, regulan la diferenciación y proliferación de melanocitos de mamíferos. En ausencia de capas alimentadoras, la falta de esos factores de crecimiento conduce a la disminución de la proliferación de melanocitos y su aumento de la apoptosis9. El co-cultivo de queratinocitos como células alimentadas y melanocitos podría conducir a la proliferación acelerada de melanocitos y a reducir la apoptosis. Sin embargo, el método de co-cultivo no sólo exige más tejidos de la piel para preparar queratinocitos, lo que no es práctico, sino que también no podría funcionar eficientemente porque las condiciones de cultivo requeridas por los melanocitos no favorecen el crecimiento de queratinocitos, y viceversa.
Estudios previos han informado de que la adición de Y-27632, un inhibidor de ROCK, en el medio de crecimiento puede mejorar el rendimiento de las células epidérmicas primarias humanas de los tejidos de la piel10-14. Por lo tanto, sería interesante probar si el aislamiento de los melanocitos primarios humanos se beneficiaría de la presencia de Y-27632. De hecho, la adición de Y-27632 en el medio TIVA de inoculación15, que contiene TPA, IBMX, Na3VO4 y dbcAMP, aumentó significativamente el rendimiento de los melanocitos primarios aislados de los tejidos de prepucio en los cultivos iniciales16. En comparación con el protocolo convencional, este nuevo protocolo es significativamente más eficiente en el aumento del rendimiento de los melanocitos16. Por lo tanto, este protocolo describe el nuevo método en detalle utilizando tejidos cutáneos adultos basados en un estudio anterior16 con el fin de promover su aplicación en la investigación biológica básica y aplicada.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21203</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37119</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30702115</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>Corning incorporated</td>
			<td>431792</td>
			<td>Cell filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>171003</td>
			<td>For cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026333</td>
			<td>For cell incubating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Shaker</td>
			<td>Shanghai Boxun</td>
			<td>150036</td>
			<td>For water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>For melanocyte isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C11995500</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-001-1AC5</td>
			<td>Component of neutralization medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5E44316</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-15371</td>
			<td>Induce pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11330032</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>5C42258</td>
			<td>For cell microscopic observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-human MITF</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab12039</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>melanocytes culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6,2&#39;-O-dibutyryladeno-sine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate (dbcAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0627</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA&#65289;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>79346</td>
			<td>melanocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-human Ki-67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>For Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1020-500</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td>Cell centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20TM automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automatic cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>For melanocyte dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503</td>
			<td>For melanocyte isolation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

y-27632 enriches the yield of human melanocytes from adult skin tissues

El aislamiento y cultivo de melanocitos primarios de los tejidos de la piel es muy importante para la investigación biológica y ha sido ampliamente utilizado para aplicaciones clínicas. Aislar los melanocitos primarios de los tejidos de la piel por el método convencional generalmente toma alrededor de 3 a 4 semanas para pasar lo suficiente. Más importante aún, los tejidos utilizados son generalmente prepucios recién nacidos y sigue siendo un desafío aislar eficientemente los melanocitos primarios de los tejidos adultos. Recientemente desarrollamos un nuevo método de aislamiento para melanocitos que añade Y-27632, un inhibidor de la quinasa Rho, al medio de cultivo inicial durante 48 h. En comparación con el protocolo convencional, este nuevo método aumenta dramáticamente el rendimiento de los melanocitos y acorta el tiempo necesario para aislar los melanocitos de los tejidos de prepucio. Ahora describimos este nuevo método con más detalle utilizando la epidermis adulta para cultivar eficientemente melanocitos primarios. Es importante destacar que los melanocitos obtenidos a partir de tejidos adultos preparados por este nuevo método pueden funcionar normalmente. Este nuevo protocolo beneficiará significativamente los estudios de defectos de pigmentación y melanomas utilizando melanocitos primarios preparados a partir de tejidos de piel adultos de fácil acceso.

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático que compara los métodos convencionales y los nuevos. El procedimiento para la preparación y digestión de tejidos con el nuevo método es el mismo que el procedimiento para el método convencional, la única diferencia es que las células aisladas se resuspenden en 10 ml de medio TIVA en presencia de 10 M Y-27632. Dos días después de la siembra, sustituya el soporte por un medio TIVA normal sin Y-27632. El método convencional de aislar los me...

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Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

Este documento informa que la adición de Y-27632 al medio TIVA puede aumentar significativamente el rendimiento de los melanocitos de los tejidos cutáneos adultos.

Y-27632 enriquece el rendimiento de los melanocitos humanos de los tejidos adultos de la piel

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

El objetivo general del protocolo basado en células es aislar y cultivar células de melanocitos humanos, mejorando las deficiencias de los métodos convencionales. A partir del nuevo método podemos obtener mayores cantidades de células de melanocitos primarios en un tiempo relativamente corto, basado en materiales y equipos. Los tejidos humanos utilizados en este protocolo son adultos frescos para los tejidos de la piel desechados de la cirugía de circuncisión en el hospital y manejados de acuerdo con las directrices del Comité de ética de la investigación humana número 2015120401 de la Institución, fecha 12 de mayo de 2015.Esta es una visualización de todos los reactivos necesarios. Preparar instrumentos y materiales estériles con antelación y colocar el tejido en un plato, lavar el tejido con 75%etanol durante 30 segundos y con lavados solución ata cinco minutos cada uno corta el tejido en piezas convenientes y raspar el tejido con cuchilla quirúrgica para eliminar la capa de grasa. Aplanar los tejidos con el lado de la dermis hacia abajo añadir 2,5 miligramos por mililitro la solución espacial a los tejidos de la piel.Cubra y almacene las piezas a cuatro grados centígrados durante la noche. En el segundo día, pelar la epidermis de la dermis e inmediatamente transferir la epidermis a otros tres platos con solución de lavado a su vez sumerge 0.05% tripsina en el tubo incubado durante 30 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Agregue un volumen igual de la solución de neutralización.Pipeta la solución hacia arriba y hacia abajo de 10 a 15 veces. Pase la solución a través de un filtro de puré de 100 micrómetros. centrífuga a 200 veces g durante cinco minutos retire el sobrenadante re-suspender el palé celular en 10 mililitros de medio tiva.Añadir 10 micrómetros de Y-27632. Marque la información que este es el campo de visión bajo el microscopio. Muestra células flotando en la incubadora media en una incubadora de 37 grados centígrados.Esta vista muestra la vista en el segundo día que las celdas han comenzado a adjuntar la parte inferior del plato. Y la vista en el día nueve muestra que existen depósitos obvios de melanocitos. Retire el sobrenadante lavar las células con PBS añadir dos milímetros de 0.05%trypsin incubar las células durante dos minutos añadir dos mililitros de la solución de neutralización.centrífuga a 200 g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante re-suspender lentamente el palé celular con 10 milímetros de medio tiva. Cambie el medio cada dos días.Estas imágenes muestran las vistas del pasaje de un diagrama esquemático por lo que el nuevo método y el método convencional se presentan en esta figura. El procedimiento para la preparación de tejidos y la digestión del nuevo método es el mismo que el método convencional. La única diferencia es que las células grasas aisladas se inocularon en 10 minutos en su medio tiva con la presencia de 10 micrómetros Y-27632.Después de dos días reemplazar los medios de comunicación con medio tiva sin suplementos en Y-27632. Este panel muestra imágenes representativas de melanocitos preparadas por el método convencional fila superior y por el nuevo método fila inferior en el día tres, día seis y día ocho después de la inoculación inicial llamamos al número de melanocitos en el día tres, día seis y ocho, encontramos que el nuevo método aumentó el rendimiento de los melanocitos en unas cinco veces. Después de ocho días de contraataque hicimos docenas y contamos el número de melanocitos en cada plato.Los resultados mostraron que el número de melanocitos aislados por el nuevo método es mucho más que el método convencional. Ki67 de pie confirman que los melanocitos aislados por un nuevo método normalmente pueden proliferar más importantemente que obtuvimos la función normal de los melanocitos con el nuevo método. Comprobamos la pureza de los melanocitos después del paso inicial del aislamiento.El pasaje que uno melanocitos para representa la expresión MITF que se expresa sólo en melanocitos. Y encontramos que casi 100% de las células eran positivas para MITF indicando melanocitos puros obtenidos después del primer pasaje. Para probar los melanocitos aislados de los nuevos métodos puede funcionar normalmente.Tratamos los melanocitos con enfriamiento por fuerza durante más de 90 in vitro y observamos que el enfriamiento de la fuerza puede inducir la pigmentación de los melanocitos. Tomar estos datos juntos sugiere que los melanocitos aislados del nuevo método normalmente pueden producir pigmentación. Los melanocitos primarios, como se ha indicado anteriormente en la piel y extendidos en el cultivo se han utilizado fácilmente para la investigación de laboratorio y las aplicaciones clínicas.Habiendo informado de que ID Y-27632 en el medio de cultivo inicial antes de dos días puede aumentar dramáticamente la salida de los melanocitos. En resumen, establecimos con éxito un nuevo método simple y altamente eficiente para aislar los melanocitos primarios puros de los tejidos adultos.

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