Name: assessment of global ocular structure following spaceflight using a micro-computed tomography (micro-ct) imaging method
Uploaded: 2020-10-27T13:00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography Micro-CT Imaging Method at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af NASA Space Biology grant # NNX15AB41G og LLU Institut for Grundlæggende Videnskaber. Sungshin Choi, Dennis Leveson og Rebecca Klotz bidrog væsentligt til succesen med vores rumflyvningsundersøgelse, og vi sætter stor pris på deres støtte. Forfatterne vil også gerne takke hele NASA Biospecimen Sharing Program gruppe for deres store hjælp.
Forfatterne vil også gerne takke Center for Dental Research for Micro-CT service.

Undersøgelsen fulgte anbefalingerne i vejledningen om pleje og brug af laboratoriedyr fra National Institutes of Health (NIH) og blev godkendt af både Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Loma Linda University (LLU) og The National Aeronautics and Space Administration (NASA). Mere detaljerede oplysninger om dette flyveeksperiment findes andresteder 9,15.
1. Flyve- og kontrolforhold
BEMÆRK: En 12th Commercial Resupply Service (CRS-12) nyttelast blev lanceret af SpaceX på Kennedy Space Center (KSC) på en 35-dages mission i august 2017, som omfattede ombord 10-uger gamle mandlige C57BL/6 mus (n = 20) for NASAs niende Gnavere Research eksperiment (RR-9).
<ol><li>Før du vender tilbage til Jorden via SpaceX's Dragon kapsel, har musene bor i NASAs Gnavere Habitats (RH) ombord ISS i 35 dage ved en omgivende temperatur på 26-28 °C med en 12-timers lys / mørk cyklus under hele flyvningen.</li>
	<li>Placer Ground Control (GC) mus i samme kabinet hardware, der anvendes i flyvningen og matche miljømæssige parametre såsom temperatur og kuldioxid (CO2)niveauer så tæt som muligt baseret på telemetri data.</li>
	<li>Feed GC mus samme NASA food bar kost som deres rumbaserede kolleger. Giv både rumflyvning og GC mus med samme ad libitum adgang til vand og mad.</li>
</ol>2. Efter flyvning evaluering af mus
<ol><li>Inden for 28 timer efter splashdown på Jorden, transportere musene til Loma Linda University (LLU). Når musene er der, fjernes de fra dyrets indhegningshardware, og der skal vurderes, om der er overlevelse og sundhed. BEMÆRK: Efter observation rapporterede inspektionspersonalet, at alle mus havde overlevet 35-dages rummissionen og var i god stand, dvs.</li>
</ol>3. Dissekere og bevarelse af museøjne efter rumflyvning
<ol><li>Inden for 38(±4) timer efter splashdown (n=20/gruppe) aflives musene i 100% CO2 og indsamle deres øjne.</li>
	<li>Disseker højre øjenhæninaer og læg dem individuelt i sterile kryovialer, fastfrysning i flydende nitrogen, og hold den ved −80 °C før brug.</li>
	<li>Fastgør hele venstre øjne i 4% paraformaldehyd i fosfat-bufferet saltvand (PBS) i 24 timer og skyl derefter med fosfat-bufferet saltvand (PBS) for mikro-CT-analyser.</li>
</ol>4. Prøveforberedelse til mikro-CT-scanning
<ol><li>Efter fiksering, dehydrere musenes øjne i ethanol. For at forhindre yderligere eller brat svind af den faste prøve skal der anvendes en sorteret serie ethanolopløsninger: begyndende med 50 % ethanol i 1 time og derefter øge koncentrationerne af ethanolopløsningerne som følger i 1 time hver: 70, 80, 90, 96 og 100 %. BEMÆRK: Musenes øjne skal håndteres i et hættekammer.</li>
	<li>Farvning af fosforolsyre (PMA) FORSIGTIG: På grund af, at PMA er ætsende, kræftfremkaldende og giftig for organer, er passende beskyttelse af personlige midler nødvendigt, herunder brug af en røghætte.<ol>
<li>Forbered farvningsopløsningen: 10 mg PMA i 100 ml absolut ethanol.</li>
		<li>Pletten musenes øjne (10 wt. % fosfofalybdisk syre - PMA opløst i absolut ethanol) i 6 dage.</li>
		<li>Før scanning skal du først vaske øjenprøverne i absolut ethanol og derefter placere hvert øje i individuelle 2 ml plastbeholdere, der er fyldt med 100% absolut ethanol. Tilføj en vatrondel til stabiliserede prøver under scanningen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Mikro-CT scanning og analyse
BEMÆRK: SkyScan 1272-scanneren, et røntgen-ray-system til stationære computere, blev brugt til vurdering af retinale skader i musenes øjne
<ol><li>Monter bløddelsprøven på en passende prøveholder. For at undgå bevægelse under røntgen-CT-målingerne skal prøven sikres en tætsiddende plads på holderen (figur 1).</li>
	<li>Efter omhyggelig justering af hver prøve, individuelt scanne prøven via røntgenstråler.<ol>
<li>Når du har åbnet softwaren, skal du centrere prøven i rammen. I protokollen skal du ikke bruge noget filter og indstille matrixen til at øge pixlen til 4 μm. Brug mikropositionering til at holde prøven centreret på rammen.</li>
		<li>Derefter skal du kontrollere parameteren for at maksimere kontrastmidlet. Hvis du vil udføre kalibreringen, skal du fjerne eksemplet og kontrollere, at flat-field-korrektionen er større end 80 %.</li>
		<li>Efter kalibrering skal prøven sættes i igen i scanningskammeret. Til scanning skal du bruge et rotationstrin på 0,400, en ramme med et gennemsnit på 4, en tilfældig bevægelse på 30 og rotere prøverne 180°.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Brug en positionering jig til gentagne målinger. På grund af fase-kontrast ekstraudstyr udført som beskrevet, objekt detaljer så små som 4 μm kan påvises fra røntgenstråler genereret af en forseglet mikro-fokus X-ray rør (wolfram anode) på 50 keV og 80 mA med en integration tid på 90 minutter. BEMÆRK: De anskaffelsesparametre, der er fastlagt i dette afsnit for udvælgelse for at producere CT-scanninger med den højeste billedkvalitet.</li>
	<li>Efter scanning skal du bruge software (f.eks.<ol>
<li>Juster histogrammet, og brug det samme område (0 – 0,24) til alle prøverne. Rekonstruere region af interesse var en cirkel, og ingen skalaer eller etiketter blev brugt.</li>
		<li>For at reducere artefakter under scanningen skal du bruge en strålehærdende korrektion på 20, en udjævningskorrektion på 1, en ringartefakt reduktion på 6, og udføre ingen ændring i forskydningskompensationen. Efter genopbygningen blev det bekræftet, at stikprøven lå i den pågældende region.</li>
		<li>Flyt billeder ved hjælp af et plan parallelt med synsnerven og linsen i øjnene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Når du har scannet, skal du bruge software (f.eks. BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, med denne software, kan billederne re-placeret ved hjælp af et fly parallelt med synsnerven og linse af øjnene til at udføre en standardiseret analyse.</li>
	<li>Beskrivende analyse<ol>
<li>Mål strukturerne ved hjælp af et måleværktøj i softwaren (f.eks. Brug den optiske nerve til at afgrænse området af interesse for analyse. Ved beregning brugte protokollen det midterste udsnit til at udføre målingerne. Denne evaluering blev udført ved beskrivende analyse (figur 2 og figur 3).</li>
		<li>Der udføres målinger af nethinden, retinal pigmentepitel (RPE), choroid og scleralaget i sagittal (Figur 2) og aksial visning (Figur 3). Tag tre målinger af hver struktur for at beregne et gennemsnit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dawson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+New+Space+Race.">The New Space Race.</a> The Politics and Perils of Space Exploration. , 1-24 (2017).</li><li>Mao, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+environment+induces+mitochondrial+oxidative+damage+in+ocular+tissue.">Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue.</a> Radiation Research. 180, 340-350 (2013).</li><li>Overbey, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+Exposed+to+Combined+Chronic+Low-Dose+Irradiation+and+Modeled+Microgravity+Develop+Long-Term+Neurological+Sequelae.">Mice Exposed to Combined Chronic Low-Dose Irradiation and Modeled Microgravity Develop Long-Term Neurological Sequelae.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4094 (2019).</li><li>Nelson, E. S., Mulugeta, L., Myers, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgravity-induced+fluid+shift+and+ophthalmic+changes.">Microgravity-induced fluid shift and ophthalmic changes.</a> Life. 4, 621-665 (2014).</li><li>Lee, A. G., Mader, T. H., Robert Gibson, C., Brunstetter, T. J., Tarver, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space+flight-associated+neuro-ocular+syndrome+(SANS).">Space flight-associated neuro-ocular syndrome (SANS).</a> Eye. 32, 1164-1167 (2018).</li><li>Stenger, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Evidence Report: Risk of Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome (SANS). , (2017).</li><li>Garrett-Bakelman, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NASA+Twins+Study:+A+multidimensional+analysis+of+a+year-long+human+spaceflight.">The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a year-long human spaceflight.</a> Science. 364, (2019).</li><li>Mader, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+disc+edema,+globe+flattening,+choroidal+folds,+and+hyperopic+shifts+observed+in+astronauts+after+long+duration+space+flight.">Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight.</a> Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).</li><li>Mao, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+ocular+response+to+a+35-day+spaceflight+mission:+Evidence+of+blood-retinal+barrier+disruption+and+ocular+adaptations.">Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations.</a> Science Reports. 9 (1), 8215 (2019).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+developmental+biology:+a+versatile+tool+for+high-contrast+3D+imaging+at+histological+resolutions.">MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions.</a> Developmental Dynamics. , 632-640 (2009).</li><li>Silva, J. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+non-destructive+soft-tissue+visualization+with+X-ray+staining+micro-tomography.">Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography.</a> Science Reports. 5, 14088 (2015).</li><li>Descamps, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+tissue+discrimination+with+contrast+agents+using+micro-CT+scanning.">Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-CT scanning.</a> Belgian Journal of Zoology. , 20-40 (2014).</li><li>Wu, J., Yin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+research+of+nasolabial+muscle+structure+in+fetus+with+cleft+lip:+an+iodine+staining+technique+based+on+microcomputed+tomography.">Anatomy research of nasolabial muscle structure in fetus with cleft lip: an iodine staining technique based on microcomputed tomography.</a> Journal of Craniofacial Surgery. 25 (3), 1056-1061 (2014).</li><li>Roque-Torres, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application of Micro-CT in Soft Tissue Specimen Imaging. In: Orhan K. (eds) Micro-computed Tomography (micro-CT) in Medicine and Engineering. , 139-170 (2020).</li><li>Overbey, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+influences+gene+expression,+photoreceptor+integrity,+and+oxidative+stress-related+damage+in+the+murine+retina.">Spaceflight influences gene expression, photoreceptor integrity, and oxidative stress-related damage in the murine retina.</a> Science Reports. 9 (1), 13304 (2019).</li><li>Elkhoury, J. E., Shankar, R., Ramakrishnan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+and+Limitations+of+X-Ray+Micro-CT+with+Applications+to+Sandstones+and+Limestones.">Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones.</a> Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).</li><li>Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+limitations+of+X-Ray+micro-computed+tomography+in+arthropod+neuroanatomy:+A+methodological+and+comparative+survey.">Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).</li><li>Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitational+Influence+on+Intraocular+Pressure:+Implications+for+Spaceflight+and+Disease.">Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease.</a> Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).</li><li>Lee, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+associated+neuro-ocular+syndrome+(SANS)+and+the+neuro-ophthalmologic+effects+of+microgravity:+a+review+and+an+update.">Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update.</a> NPJ Microgravity. 6, 7 (2020).</li></ol>

Alle forfattere har intet at afsløre.

Resultaterne af denne undersøgelse viste, at der var strukturelle ændringer i rumflyvning mus øjet ved hjælp af mikro-CT teknik i forhold til GC grupper, især af nethinden, RPE, og choroid lag af øjet, som det fremgår af deres nedsat tykkelse. Micro-CT giver en effektiv og ikke-destruktiv teknik til at karakterisere ændringerne uden behov for manipulation. Brugen af PMA farvning forbedret kvaliteten af mikro-CT billeder til at opnå klare 3D tomografiske billeder efter rekonstruktion, ovenstående ethvert behov for fysisk at ændre strukturen af prøven. En ekstra fordel ved disse billeder er, at de viser hele interesseområdet digitalt, hvilket øger tilgængeligheden samt reproducerbarheden af resultaterne. Gennem mikro-CT-billeder produceret i løbet af denne undersøgelse, den målrettede prøve viste differentiering af de mange strukturer som nethinden, RPE, choroid, og sclera lag til bestemmelse af tykkelsen af hvert lag.
Et kritisk skridt i protokollen er manipulation af prøverne på grund af deres størrelse og tekstur. Håndteringen af prøven skal udføres omhyggeligt uden at lægge pres på prøven under præparatet. Mikro-CT har nogle begrænsninger: opløsning og manglen på standardiserede værdier for parametrene. Under scanningen kan de forskellige mikro-CT-scannere have forskellige billedbehandlingsalgoritmer; alligevel kalibrering for en gråtoner kan forfølges for at overvinde ethvert problem. Efter scanning, rekonstruktion af billederne bør være baseret på væv og den analyse, der vil blive udført. Det kan være kritisk, da billedkvaliteten afhænger af det tomografiske system, indstillingerne, prøvestørrelsen samt tilberedningsmetoderne16,17.
På grund af sin vellykkede anvendelse i at studere flere typer af normale og patologiske væv, mikro-CT billeddannelse kapaciteter bør anvendes i fremtidig forskning til at udarbejde volumetriske data til andre analyser. På grundlag af denne undersøgelses formål var det således acceptabelt at anvende bidimensionale målinger, men segmentering af brutto3D-strukturen kan også være gavnligt at give en præcis oversigt over hele prøven. Selv med alle fordelene ved en ikke-destruktiv teknik, mikro-CT vil ikke erstatte andre metoder såsom immunohistochemistry, men vil supplere og tillade efterfølgende histologi analyser, hvis det ønskes.
En langvarig rumflyvning tilstand producerer en række strukturelle og funktionelle okulære ændringer i astronauterne under og efter rummission defineret som SANS. Resultaterne omfatter hyperopiske skift, kloden udfladning, choroidal / retinal folder, og vat pletter19. I modsætning til astronauternes optiske sammenhæng tomografi (OCT) konstatering af retinale nerve fiber lag fortykkelse, udtynding af nethinden og choroidal lag blev dokumenteret i dette dyr mikro-CT-undersøgelse. Disse resultater var uventede. Denne uoverensstemmelse kan skyldes konfunderende faktorer. Mus har begrænset cephalad væske skift i forhold til mennesker. Denne mangel på væskeskift kan have fremkaldt forskellige reaktioner på tyngdekraftsændringer. For det andet blev mus dissekeret inden for 38 timer efter stænk ned, og en akut respons for re-tilpasning kan også bidrage til morfologiske ændringer i nethinden og choroid. Bekræftelse af denne mulighed kræver yderligere målinger under rumflyvning og lang sigt efter missionen.
Resultaterne af denne undersøgelse viser, at rumflyvningsforhold, især gravitationelle ændringer, kan fremkalde en akut og kortsigtet respons i øjet. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at fastslå konsekvenserne af de akutte ændringer på okulær på retinale funktion og mekanisme af rumflyvning-induceret struktur ændringer.

I rumflyvningens mikrotyngdekraftsmiljø kan øget intrakranielt tryk (ICP) forårsaget af væskeskift have bidraget til rumflyvnings-associeret neuro-okulært syndrom (SANS)1,2,3,4,5. Faktisk har over 40% af astronauter oplevet SANS under og efter en International Space Station (ISS) mission6, herunder rumflyvning genstand for NASA Twins Study7. Den nuværende patofysiologi af SANS omfatter fysiologiske ændringer såsom optisk disk ødem, kloden udfladning, choroidal og retinale folder, hyperopiske brydning fejlskift, og nervefiber lag infarkter (dvs. vat pletter) og er veldokumenteret5,8. De underliggende mekanismer i de ændringer og faktorer, der bidrager til udviklingen af skader, er imidlertid uklare. For at få en bedre forståelse af SANS, dyremodeller er tilgængelige for at karakterisere rumflyvning-associerede ændringer i retinale struktur og funktion.
I en tidligere undersøgelse af de samme dyr, rapporterede vi virkningen af 35 dages rumflyvning på musen nethinden. Resultaterne belyse, at rumflyvning inducerer betydelig skade i nethinden og retinal vaskulatur, og nogle proteiner / veje forbundet med celledød, inflammation og metabolisk stress blev væsentligt ændret efter rumflyvning9.
I øjeblikket er der en række noninvasive imaging teknikker etableret for at overvåge sygdomsudvikling og progression, samt fysiologiske reaktioner på forskellige miljømæssige stressfaktorer, som også er meget udbredt i små gnavere modeller. En af disse teknikker er mikro-CT, som evaluerer anatomiske strukturer og patologiske processer, og har med succes været anvendt på organismer så små som mus10.
Mikro-CT kan opnå en mikrosized opløsning, og det kan give høj kontrast til volumetrisk analyse af blødt væv med tilføjelse af den relevante kontrastmiddel10,11,,12,13,14. Mikro-CT-teknologi er fordelagtig i forhold til traditionelle metoder såsom grov anatomi, lys mikroskopi, og histologi undersøgelse, da det minimerer fysisk skade på den geometriske profil af prøverne og ændrer ikke det rumlige forhold mellem strukturer. Desuden kan tre-dimensionelle (3D) modeller af strukturer rekonstrueres fra mikro-CT-billeder12,14. Til dato, på trods af dokumentation for synsnedsættelse efter eksponering for rummiljøet, er der kun få data i dyremodeller til rådighed for en bedre forståelse af rumflyvningsrelaterede ændringer i retinale struktur og funktion. I den nuværende undersøgelse blev mus fløjet på en 35-dages mission ombord på ISS for at bestemme rumflyvningsmiljøets indvirkning på okulære vævsstrukturer ved at kvantificere mikrostrukturen i nethinden, RPE og choroidlagene ved hjælp af mikro-CT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 wt. % phosphomolybdic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12026-57-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute by Baker Analyzed</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80252500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global ocular structure following spaceflight using a micro-computed tomography (micro-ct) imaging method

Rapporter viser, at langvarig eksponering for et rumflyvningsmiljø medfører morfologiske og funktionelle oftalmologiske ændringer i astronauter under og efter en international rumstation (ISS) mission. De underliggende mekanismer i disse rumflyvningsinducerede ændringer er imidlertid på nuværende tidspunkt ukendte. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme rumflyvningsmiljøets indvirkning på okulære strukturer ved at evaluere tykkelsen af musethinden, nethindepigmentepitel (RPE), choroid og scleralaget ved hjælp af mikro-CT-billeddannelse. Ti uger gamle C57BL/6 mandlige mus blev anbragt ombord på ISS for en 35-dages mission og derefter vendte tilbage til Jorden i live til vævsanalyse. Til sammenligning blev jordkontrolmus (GC) på Jorden opretholdt under identiske miljøforhold og hardware. Okulære vævsprøver blev indsamlet til mikro-CT-analyse inden for 38(±4) timer efter splashdown. Billederne af tværsnittet af nethinden, RPE, choroid, og sclera lag af det faste øje blev registreret i en aksial og sagittal visning ved hjælp af en mikro-CT imaging erhvervelse metode. Mikro-CT-analysen viste, at tværsnitsområderne i nethinden, RPE og choroidlagtykkelsen blev ændret i rumflyvningsprøver sammenlignet med GC, hvor rumflyvningsprøver viste betydeligt tyndere tværsnit og lag sammenlignet med kontroller. Resultaterne fra denne undersøgelse viser, at mikro-CT evaluering er en følsom og pålidelig metode til at karakterisere okulære struktur ændringer. Disse resultater forventes at forbedre forståelsen af miljøbelastningens indvirkning på de globale okulære strukturer.

Den gennemsnitlige tykkelse af nethinden, RPE, choroid og sclera lag blev registreret ved hjælp af mikro-CT-scanninger efter at have fulgt protokollen ovenfor (Figur 1). Teknikken viste en multiplanær rekonstruktion af øjnene i tre forskellige synspunkter. Under analysen var observatøren i stand til at rulle gennem hele prøven for at standardisere analysen lige midt i prøven.
Mikro-CT-analysen viste tværsnitsområderne i øjnene i sagittal- og aksial visning (figur 2 og figur 3), hvor de lineære målinger blev udført. RPE- og choroidlaget var betydeligt eller lavere i rumflyvningsgruppen sammenlignet med GC-gruppen (Figur 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig01v2.jpg"> Figur 1: Mikro-CT-procedure for blødt væv. (A) Bløddelsprøve (museøje). bB) Prøverne blev fastsat i 4 % formaldehyd i fosfatbufferopløsning (PBS). Efter fikseringen blev musenes øjne dehydreret i ethanol. For at forhindre en yderligere og brat svind af den faste prøve blev der anvendt en sorteret serie ethanolopløsninger, begyndende med 50 % ethanol i 1 time og følgende ethanolopløsninger i de anførte koncentrationer i 1 time hver: 70, 80, 90, 96 og 100 %. (C) Musenes øjne blev plettet i fosforlydsyre (PMA) i 6 dage, vasket i absolut ethanol og derefter placeret i individuelle 2 ml plastbeholdere fyldt med absolut ethanol. (D) En desktop X-ray mikro-CT-system scanner blev brugt til at vurdere retinale skade i mus øjne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig02.jpg"> Figur 2: Sagittal visning af en jordkontrol mus. Lag af øjet på højre side af billedet er kommenteret, fra top-til-bund, nethinden (0,077 mm), nethinden pigment lag (RPE, 0,038 mm), choroid (0,041 mm), sclera (0,059 mm). Dette tal er taget fra Overbey et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig03.jpg"> Figur 3: Aksial visning af en jordkontrolmus. Lag af øjet på højre side af billedet er kommenteret, fra top-til-bund, nethinden (0,144 mm), nethinde pigment lag (RPE, 0,051 mm), choroid (0,041 mm), sclera (0,073 mm). Dette tal er taget fra Overbey et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig04.jpg"> Figur 4: Gennemsnitlig tykkelse af retinale lag, RPE lag, og choroid lag målt ved mikro-CT i rumflyvning og kontrolgrupper. Optællingerne blev i gennemsnit fordelt på fem nethiner pr. gruppe. Værdierne var repræsenteret som middeltykkelse ± standardfejl (SEM). SEM af middelværdien er markeret med fejllinjer. Markant lavere i tværsnitstykkelsen i flt-gruppen (spaceflight) sammenlignet med gruppen med jordkontrol (GC) er angivet '*' (p < 0,05). Dette tal er taget fra Overbey et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography Micro-CT Imaging Method at JoVE.com

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography Micro-CT Imaging Method

Vi præsenterer en protokol ved hjælp af høj opløsning mikro-computertomografi billedbehandling at afgøre, om rumflyvning induceret skade på okulære strukturer. Protokollen viser mikro-CT-afledt måling af ex vivo gnaver okulære strukturer. Vi demonstrerer evnen til at vurdere okulære morfologiske ændringer efter rumflyvning ved hjælp af en ikke-destruktiv tridimensional teknik til at vurdere øjenskader.

Vurdering af global okulær struktur efter rumflyvning ved hjælp af en mikro-computertomografi (Micro-CT) Imaging metode

Reports show that prolonged exposure to a spaceflight environment produces morphologic and functional ophthalmic changes in astronauts during and after an ...

Her foreslår vi en metode til vurdering af den globale okulære struktur efter rumflyvning ved hjælp af mikro-computer tomografi billeddannelse metode. Rumflyvningsmiljøet, som omfatter paratyngdekraft og stråling, forårsager unikke ændringer i menneskets fysiologi, herunder væskeskift. Disse væskeskift fører til forhøjet intrakranielt tryk og er blevet tilskrevet som en væsentlig årsag til rumflyvning associeret neuro-okulærsyndrom.Den fysiologiske virkning af SANS påvirker flere komponenter i øjet og omfatter optisk disk ødem, kloden udfladning, choroidal og retinale folder, hyperopiske og brydningsfejl skift, og nervefiber lag infracts. Mens de fysiologiske egenskaber af SANS er veldokumenteret, de mekanismer, der driver SANS er stadig dårligt forstået. For at få en bedre forståelse af SANS anvendes gnaveremodeller til ikke-invasive billeddannelsesteknikker.En af disse teknikker er mikro-CT, som med succes er blevet anvendt til evaluering af anatomiske strukturer og patologiske processer hos dyr så små som mus. Micro-CT kan opnå en mikro-størrelse opløsning, og gennem kombinationen med en kontrast agent, kan det give en god kontrast til det bløde væv. Micro-CT giver en klar fordel i forhold til traditionelle metoder, herunder grov anatomi, lys mikroskopi, og histologi undersøgelse for ikke at forårsage skade på den geometriske profil af prøverne og de rumlige relationer mellem strukturerne.I vores nuværende undersøgelse blev mus udsat for rummiljøet i 35 dage ombord på den internationale rumstation for at afgøre, om rummiljøet fremkalder øjenskader ved at kvantificere mikrostrukturen i nethinden, RPE- og choroidlagene ved hjælp af Micro-CT. Her har vi demonstreret, hvordan vi har forberedt prøver til Micro-CT-analyse. Mus blev brugt og øjne inden for 38 plus eller minus fire timer efter splash ned.Øjnene blev enucleated, og venstre øjne blev fastsat i fire procent paraformaldehyd og fosfat buffere saltvand i 24 timer. Efter fiksering blev øjnene dehydreret i ethanol. For at forhindre en yderligere og brat svindning af den faste prøve blev der anvendt en sorteret serie af ethanoiske opløsninger.Først blev prøverne overført til 50% ethanol i en time og derefter øge koncentrationerne i en time hver, 70, 80, 90, 96, og 100%Bagefter, øjnene blev plettet med 10% vægt pr volumen fosfolipid syre i seks dage. Endelig blev prøverne vasket i absolut ethanol og derefter placeret i individuelle to mølle plastbeholdere fyldt med absolut ethanol til scanning. En vatrondel blev også tilføjet for at stabilisere prøven under scanningen.Dernæst blev prøven placeret inde i en desktop x-ray Micro-CT-system SkyScan 1272 scanner til at vurdere retinale skader. Til scanning brugte vi SkyScan 1272-softwaren. Efter åbning af softwaren, centreret vi vores prøve i rammen.I vores protokol bruger vi ikke filter og indstiller matrixen til at øge pixelstørrelsen til fire mikron. Mikropositionering bruges til at holde prøven centreret i rammen. Dernæst kontrollerer vi parametrene for at maksimere kontrastmidlet i vores prøve og for at kalibrere maskinen.For at udføre kalibreringen fjerner vi prøven fra scanneren, og vi indstiller scanningsparametrene. Under kalibreringen kontrolleres også en flad korrektion. Det skal være større end 80%Efter kalibreringer, prøven er genindsættes i scanningskammeret.Før scanning navngives eksempelfilerne. Scanningsparametre er som følger, rotationstrin 0,4, rammer fire, tilfældig bevægelse 30, dobbelttjekke, at pixelstørrelsen er indstillet til 4 mikron. Så er scanningen startet.Efter scanning bruges NRecon til at rekonstruere prøven. Først åbner vi filerne fra scanningen og ser de rå scanningsbilleder. Vi justerer histogrammets bounce, så det passer ind i kurven.Dernæst retter vi for strålen hærdning artefakt. Så justerer vi udjævningsartefaktet. Endelig retter vi for ringen artefakt reduktion.Efter alle de korrektioner, bekræftede vi, at vores prøver passer ind i vores region af interesse. Så kan vi starte genopbygningen. Vi bruger DataViewer-softwaren til at visualisere de rekonstruerede billeder i alle tre felter.Til analyse bruges CTAn-softwaren. De rekonstruerede billeder indlæses i softwaren. Den optiske nerve blev brugt til at afgrænse regionen af interesse for analyse.Ved beregning brugte vi den midterste del af det pågældende område til at udføre alle målinger til analyse. Der blev foretaget tre gentagne målinger for at beregne den lineære måling af området. Følgende målinger blev taget for okulær væv, nethinden, RPE, choroid, og vores Micro-CT analyse viste, at tværsnit områder nethinden, RPE, og choroid lag var betydeligt lavere i rumflyvning prøver i forhold til jorden kontrol.Micro-CT giver en effektiv og ikke-destruktiv teknikker til at beregne størrelsen af ændringer uden manipulation. Ved at bruge kontrastmiddel, forbedrer det kvaliteten af Micro-CT-billeder, som hjælper os med at få et vellykket klart grafisk billede af rekonstruktionen uden den inter-struktur af prøven. Derudover viser det i de oprindelige data er digitalt, hvilket øger tilgængeligheden og reproducerbarheden af resultaterne.Desuden er det grundlæggende formål acceptabelt at anvende tredimensionelle målinger, men segmentering af brutto tredimensionel struktur kan være gavnligt at give specifikke omrids af hele prøven. Vores resultater viser, at rumflyvning betingelser, især gravitationelle ændringer, kan fremkalde akut og kortsigtet respons i øjet. Desuden bør det fremtidige arbejde bruge volumetriske data til at udføre andre analyser, der udnytter mikro-CT-billeddannelse kapaciteter, da det er blevet brugt med succes til at studere mange normale og patologiske væv.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography (Micro-CT) Imaging Method

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

En enkel metode til Imaging Arabidopsis Blade Brug Perfluorodecalin som en infiltrativ Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Omdannelse af en ELISA til en Luminex xMAP assay under anvendelse af en multiplex antistof screeningsmetode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Brug High Resolution Computed Tomography at visualisere de tredimensionelle struktur og funktion af dyrs vaskulatur

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Slice Kultur Metode til følgende udvikling i Tand Bakterier In Eksplantat Kultur

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse af Global RNA-syntese på enkelt celle niveau efter Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering af nukleinsyrer: en enkel og hurtig DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

En vejledning til sektions-, coring- og billedbehandling til indkøb og analyse af kortikale knogleeksempeler med høj overførselshastighed til synkrotronmikro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Strategier for optimering af kryogene Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

Vurdering af global DNA-dobbeltstrenget endresektion ved hjælp af BrdU-DNA-mærkning kombineret med billeddannelse af cellecyklusdiskrimination

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...