Name: assessment of global ocular structure following spaceflight using a micro-computed tomography (micro-ct) imaging method
Uploaded: 2020-10-27T13:00:00
Duration: 9 min 11 s
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Diese Studie wurde unterstützt durch das NASA Space Biology-Stipendium NNX15AB41G und das LLU Department of Basic Sciences. Sungshin Choi, Dennis Leveson und Rebecca Klotz haben maßgeblich zum Erfolg unserer Raumflugstudie beigetragen und wir schätzen ihre Unterstützung sehr. Die Autoren danken auch der gesamten NASA Biospecimen Sharing Program Gruppe für ihre großartige Unterstützung.
Die Autoren danken auch dem Center for Dental Research for Micro-CT Service.

Die Studie folgte den Empfehlungen des Guide for the Care and Use of Laboratory Animals der National Institutes of Health (NIH) und wurde sowohl vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Loma Linda University (LLU) als auch von der National Aeronautics and Space Administration (NASA) genehmigt. Ausführlichere Informationen zu diesem Flugexperiment finden Sie an anderer Stelle9,15.
1. Flug- und Kontrollbedingungen
HINWEIS: Ein 12. Kommerzieller Nachschubdienst (CRS-12) Nutzlast wurde von SpaceX im Kennedy Space Center (KSC) auf einer 35-tägigen Mission im August 2017 gestartet, die an Bord der 10 Wochen alten männlichen C57BL/6-Mäuse (n = 20) für das neunte Nagetierforschungsexperiment (RR-9) der NASA gehörte.
<ol><li>Bevor sie über die Dragon-Kapsel von SpaceX zur Erde zurückkehren, lassen Sie die Mäuse 35 Tage lang in den NAGEtier-Habitaten (RH) der NASA an Bord der ISS bei einer Umgebungstemperatur von 26–28 °C mit einem 12-stündigen Licht-Dunkel-Zyklus während des gesamten Fluges leben.</li>
	<li>Platzieren Sie Ground Control (GC)-Mäuse in die gleiche Gehäusehardware, die im Flug verwendet wird, und stimmen Sie Aufderstraßenwiefern (CO2) auf der Grundlage von Telemetriedaten so genau wie möglich mit Umweltparametern wie Temperatur und Kohlendioxid(CO2)überein.</li>
	<li>Füttern Sie GC-Mäuse die gleiche NASA-Lebensmittelriegel-Diät wie ihre weltraumgestützten Pendants. Bieten Sie sowohl der Raumfahrt als auch den GC-Mäusen den gleichen ad libitum-Zugang zu Wasser und Nahrung.</li>
</ol>2. Bewertung der Mäuse nach dem Flug
<ol><li>Transportieren Sie die Mäuse innerhalb von 28 Stunden nach dem Abschuss auf der Erde zur Loma Linda University (LLU). Dort angekommen, entfernen Sie die Mäuse aus dem Tiergehege Hardware und bewerten für das Überleben und die Gesundheit. HINWEIS: Bei der Beobachtung berichtete das Inspektionspersonal, dass alle Mäuse die 35-tägige Weltraummission überlebt hatten und sich in einem guten Zustand befanden, d. h. keine auffälligen Mängel/Anomalien.</li>
</ol>3. Sezieren und Bewahrung von Mausaugen nach der Raumfahrt
<ol><li>Innerhalb von 38(±4) Stunden nach dem Abspritzen (n=20/Gruppe), einschläfern sie die Mäuse in 100%CO2 und sammeln ihre Augen.</li>
	<li>Sezieren Sie die Netzhaut des rechten Auges und legen Sie sie einzeln in sterile Kryovials, fangen Sie in flüssigem Stickstoff ein und halten Sie sie vor der Anwendung bei 80 °C.</li>
	<li>Fixieren Sie die gesamten linken Augen in 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Saline (PBS) für 24 h und spülen Sie dann mit Phosphatgepufferter Saline (PBS) für Mikro-CT-Assays ab.</li>
</ol>4. Probenvorbereitung für Mikro-CT-Scanning
<ol><li>Nach der Fixierung die Augen der Mäuse in Ethanol dehydrieren. Um eine weitere oder abrupte Schrumpfung der festen Probe zu verhindern, verwenden Sie eine abgestufte Reihe von Ethanollösungen: beginnend mit 50% Ethanol für 1 Stunde und dann Erhöhung der Konzentrationen der Ethanol-Lösungen für jeweils 1 Stunde: 70, 80, 90, 96 und 100%. HINWEIS: Die Augen der Mäuse müssen in einer Kapuzenkammer behandelt werden.</li>
	<li>Phosphomolybdsäure (PMA) Färbung VORSICHT: Da PMA ätzend, krebserregend und für Organe giftig ist, ist eine geeignete persönliche Schutzausrüstung erforderlich, einschließlich der Verwendung einer Dunstabzugshaube.<ol>
<li>Bereiten Sie die Färbelösung vor: 10 mg PMA in 100 ml absolutem Ethanol.</li>
		<li>Die Augen der Mäuse (10 Gew. % Phosphomolybdidsäure - IN absolutem Ethanol gelöstes PMA) 6 Tage lang färben.</li>
		<li>Waschen Sie vor dem Scannen zunächst die Augenproben in absolutem Ethanol und legen Sie dann jedes Auge in einzelne 2 ml Kunststoffbehälter, die mit 100% absolutem Ethanol gefüllt sind. Fügen Sie ein Wattepad zu stabilisierten Proben während des Scans hinzu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Micro-CT-Scannen und -Analyse
HINWEIS: Der SkyScan 1272 Scanner, ein Desktop-Röntgen-Mikro-CT-System, wurde zur Bewertung von Netzhautschäden in den Augen der Mäuse verwendet
<ol><li>Montieren Sie die Weichgewebeprobe an einem geeigneten Probenhalter. Um bewegungen während der Röntgen-CT-Messungen zu vermeiden, stellen Sie eine enge Passform der Probe auf ihren Halter sicher (Abbildung 1).</li>
	<li>Nach sorgfältiger Ausrichtung der einzelnen Proben scannen Sie die Probe einzeln mit Röntgenstrahlen.<ol>
<li>Nach dem Öffnen der Software zentrieren Sie das Beispiel im Rahmen. Verwenden Sie im Protokoll keinen Filter, und legen Sie die Matrix fest, um das Pixel auf 4 m zu erhöhen. Verwenden Sie die Mikropositionierung, um die Probenmitte auf dem Rahmen zu halten.</li>
		<li>Danach überprüfen Sie den Parameter, um den Kontrast-Agent zu maximieren. Um die Kalibrierung durchzuführen, entfernen Sie die Probe, und überprüfen Sie, ob die Flachfeldkorrektur größer als 80 % ist.</li>
		<li>Setzen Sie die Probe nach der Kalibrierung wieder in die Scankammer ein. Verwenden Sie zum Scannen einen Rotationsschritt von 0,400, eine Rahmenmittelwertung von 4, eine zufällige Bewegung von 30, und drehen Sie die Proben um 180°.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie eine Positionierungsvorrichtung für wiederholte Messungen. Durch die wie beschrieben durchgeführte Phasenkontrastverbesserung können Objektdetails von bis zu 4 m durch Röntgenaufnahmen nachgewiesen werden, die von einer versiegelten Mikrofokus-Röntgenröhre (Wolframanode) bei 50 keV und 80 mA mit einer Integrationszeit von 90 Minuten erzeugt werden. HINWEIS: Die Erfassungsparameter, die in diesem Abschnitt zur Auswahl festgelegt sind, um Übersichts-CT-Scans mit höchster Bildqualität zu erstellen.</li>
	<li>Verwenden Sie nach dem Scannen Software (z. B. NRecon), um die Daten zu rekonstruieren.<ol>
<li>Passen Sie das Histogramm an und verwenden Sie den gleichen Bereich (0 – 0,24) für alle Proben. Rekonstruieren Region von Interesse war ein Kreis, und keine Skalen oder Beschriftungen verwendet wurden.</li>
		<li>Um Artefakte während des Scannens zu reduzieren, verwenden Sie eine Strahlhärtekorrektur von 20, eine Glättungskorrektur von 1, eine Ringartefaktreduktion von 6, und führen Sie keine Änderung der Fehlausrichtungskompensation durch. Nach dem Wiederaufbau wurde bestätigt, dass die Stichprobe in der Region von Interesse war.</li>
		<li>Positionieren Sie Bilder mit einer Ebene parallel zum Sehnerv und der Linse der Augen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie nach dem Scannen Software (z. B. DataViewer), um die rekonstruierten Bilder in allen drei Ansichten zu visualisieren. HINWEIS: Bei Bedarf können die Bilder mit dieser Software mit einer Ebene parallel zum Sehnerv und der Augenlinse neu positioniert werden, um eine standardisierte Analyse durchzuführen.</li>
	<li>Beschreibende Analyse<ol>
<li>Messen Sie die Strukturen mit einem Messwerkzeug in der Software (z.B. CTAn). Verwenden Sie den optischen Nerv, um den Bereich des Interesses für die Analyse abzugrenzen. Bei der Berechnung verwendete das Protokoll das mittlere Segment, um die Messungen durchzuführen. Diese Auswertung wurde durch eine beschreibende Analyse durchgeführt (Abbildung 2 und Abbildung 3).</li>
		<li>Führen Sie Messungen der Netzhaut-, Retina-Pigmentepithel (RPE), Der Aderhaut und der Skleraschicht in der sagittalen (Abbildung 2) und der axialen Ansicht (Abbildung 3) durch. Nehmen Sie drei Messungen jeder Struktur vor, um einen Durchschnitt zu berechnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dawson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+New+Space+Race.">The New Space Race.</a> The Politics and Perils of Space Exploration. , 1-24 (2017).</li><li>Mao, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+environment+induces+mitochondrial+oxidative+damage+in+ocular+tissue.">Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue.</a> Radiation Research. 180, 340-350 (2013).</li><li>Overbey, E. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+disc+edema,+globe+flattening,+choroidal+folds,+and+hyperopic+shifts+observed+in+astronauts+after+long+duration+space+flight.">Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight.</a> Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).</li><li>Mao, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+ocular+response+to+a+35-day+spaceflight+mission:+Evidence+of+blood-retinal+barrier+disruption+and+ocular+adaptations.">Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations.</a> Science Reports. 9 (1), 8215 (2019).</li><li>Metscher, B. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+and+Limitations+of+X-Ray+Micro-CT+with+Applications+to+Sandstones+and+Limestones.">Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones.</a> Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).</li><li>Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+limitations+of+X-Ray+micro-computed+tomography+in+arthropod+neuroanatomy:+A+methodological+and+comparative+survey.">Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).</li><li>Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitational+Influence+on+Intraocular+Pressure:+Implications+for+Spaceflight+and+Disease.">Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease.</a> Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).</li><li>Lee, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+associated+neuro-ocular+syndrome+(SANS)+and+the+neuro-ophthalmologic+effects+of+microgravity:+a+review+and+an+update.">Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update.</a> NPJ Microgravity. 6, 7 (2020).</li></ol>

Alle Autoren haben nichts zu verraten.

Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass es strukturelle Veränderungen im Raumflug-Mausauge mit der Mikro-CT-Technik im Vergleich zu GC-Gruppen, insbesondere der Netzhaut, der RPE und den Aderhautschichten des Auges gab, wie ihre verminderte Dicke zeigt. Micro-CT bietet eine effiziente und zerstörungsfreie Technik, um die Veränderungen ohne Manipulation zu charakterisieren. Die Verwendung von PMA-Färbung verbesserte die Qualität der Mikro-CT-Bilder, um nach der Rekonstruktion erfolgreich klare 3D-Tomographiebilder zu erhalten, ohne dass die Struktur der Probe physisch verändert werden musste. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Bilder besteht darin, dass sie die gesamte Interessenregion digital anzeigen und damit die Zugänglichkeit sowie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erhöhen. Durch die mikro-CT-Bilder, die während dieser Studie produziert wurden, zeigte die Zielprobe eine Differenzierung der multiplen Strukturen wie Netzhaut, RPE, Aderhaut und Sklera-Schicht zur Bestimmung der Dicke jeder Schicht.
Ein kritischer Schritt innerhalb des Protokolls ist die Manipulation der Samples aufgrund ihrer Größe und Textur. Die Handhabung der Probe muss sorgfältig erfolgen, ohne die Probe während der Vorbereitung unter Druck zu setzen. Der Micro-CT hat einige Einschränkungen: Auflösung und das Fehlen standardisierter Werte für die Parameter. Während des Scannens können die verschiedenen Mikro-CT-Scanner unterschiedliche Bildverarbeitungsalgorithmen haben; dennoch könnte die Kalibrierung für eine Graustufen-Skala fortgesetzt werden, um jedes Problem zu überwinden. Nach dem Scannen sollte die Rekonstruktion der Bilder auf dem Gewebe und der Analyse basieren, die durchgeführt wird. Es kann kritisch sein, da die Bildqualität vom tomographischen System, den Einstellungen, der Probengröße sowie den Aufbereitungsmethoden16,17abhängt.
Aufgrund seiner erfolgreichen Anwendung bei der Untersuchung verschiedener Arten von normalen und pathologischen Geweben sollten Mikro-CT-Bildgebungsfunktionen in der zukünftigen Forschung verwendet werden, um volumetrische Daten für andere Analysen zu kompilieren. Auf der Grundlage des Zwecks der vorliegenden Studie war es daher akzeptabel, zweidimensionale Messungen zu verwenden, aber die Segmentierung der brutto 3D-Struktur kann auch vorteilhaft sein, um eine genaue Umrisslinie der gesamten Probe zu liefern. Selbst bei allen Vorteilen einer zerstörungsfreien Technik wird micro-CT andere Methoden wie die Immunhistochemie nicht ersetzen, sondern nachfolgende Histologieanalysen ergänzen und auf Wunsch ermöglichen.
Ein längerer Raumflugzustand führt zu einer Reihe struktureller und funktioneller Augenveränderungen bei den Astronauten während und nach der Weltraummission, die als SANS definiert ist. Die Ergebnisse umfassen hyperopic Verschiebungen, Globus-Abflachung, Aderhaut-/Retinafalten und Watteflecken19. Im Gegensatz zur optischen Kohärenztomographie (OCT) der Astronauten wurde in dieser tierischen Mikro-CT-Studie die Erkenntnis der Verdickung der retinalen Nervenfaserschicht, der Ausdünnung der Netzhaut und der Aderhautschicht dokumentiert. Diese Ergebnisse waren unerwartet. Diese Diskrepanz kann auf verwirrende Faktoren zurückzuführen sein. Mäuse haben eine begrenzte Cephalad-Flüssigkeitsverschiebung im Vergleich zum Menschen. Dieser Mangel an Flüssigkeitsverschiebung kann unterschiedliche Reaktionen auf Gravitationsveränderungen heraufbeschworen haben. Zweitens wurden Mäuse innerhalb von 38 Stunden nach dem Splashdown seziert, und eine akute Reaktion auf eine Reanpassung kann auch zu morphologischen Veränderungen in der Netzhaut und Aderhaut beitragen. Die Bestätigung dieser Möglichkeit erfordert weitere Messungen während der Raumfahrt und langfristig nach der Mission.
Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die Bedingungen der Raumfahrt, insbesondere Gravitationsveränderungen, eine akute und kurzfristige Reaktion im Auge hervorrufen können. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Folgen der akuten Veränderungen auf die Netzhautfunktion und den Mechanismus der raumfliegeninduzierten Strukturveränderungen zu bestimmen.

In der Mikrogravitationsumgebung der Raumfahrt kann ein erhöhter intrakranieller Druck (ICP), der durch Flüssigkeitsverschiebung verursacht wird, zum Raumflug-assoziierten neurookulären Syndrom (SANS)1,2,3,4,5beigetragen haben. Tatsächlich haben über 40% der Astronauten SANS während und nach einer Mission der Internationalen Raumstation (ISS)6erlebt, einschließlich des Raumflugthemas der NASA-Zwillingsstudie7. Die aktuelle Pathophysiologie von SANS umfasst physiologische Veränderungen wie optische Sscheibenödeme, Globe-Flattening, Aderoid- und Netzhautfalten, hyperopic refraktive Fehlerverschiebungen und Nervenfaserschichtinfarkte (d.h. Watteflecken) und sind gut dokumentiert5,8. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Veränderungen und Faktoren, die zur Entwicklung von Schäden beitragen, sind jedoch unklar. Um SANS besser verstehen zu können, stehen Tiermodelle zur Verfügung, um die raumfliegenassoziierten Veränderungen in der Netzhautstruktur und -funktion zu charakterisieren.
In einer früheren Untersuchung an denselben Tieren berichteten wir über die Auswirkungen von 35 Tagen Raumfahrt auf die Netzhaut der Maus. Die Ergebnisse erklären, dass die Raumfahrt erhebliche Schäden in der Netzhaut und Netzhautvaskulatur induziert, und einige Proteine/Wege, die mit Zelltod, Entzündungen und metabolischem Stress verbunden sind, wurden nach der Raumfahrt signifikant verändert9.
Derzeit gibt es eine Vielzahl von nichtinvasiven bildgebenden Verfahren zur Überwachung der Krankheitsentwicklung und -progression sowie physiologische Reaktionen auf verschiedene Umweltstressoren, die auch in kleinen Nagetiermodellen weit verbreitet sind. Eine dieser Techniken ist micro-CT, die anatomische Strukturen und pathologische Prozesse bewertet und erfolgreich auf Organismen so klein wie Mäuse10eingesetzt wurde.
Micro-CT kann eine Mikro-Auflösung erreichen, und es kann einen hohen Kontrast für die volumetrische Analyse von Weichteilen mit der Zugabe des geeignetenKontrastmittels 10,11,12,13,14bieten. Die Mikro-CT-Technologie ist im Vergleich zu herkömmlichen Methoden wie Grobanatomie, Lichtmikroskopie und Histologie-Untersuchung von Vorteil, da sie physikalische Schäden am geometrischen Profil der Proben minimiert und das räumliche Verhältnis zwischen Denstrukturen nicht verändert. Darüber hinaus können dreidimensionale (3D) Strukturen aus Mikro-CT-Bildern12,14rekonstruiert werden. Trotz der Hinweise auf Sehbehinderungen nach expositionsunfähiger Weltraumumgebung stehen bisher nur wenige Daten in Tiermodellen zur Verfügung, um die mit der Raumfahrt verbundenen Veränderungen in der Netzhautstruktur und -funktion besser zu verstehen. In der aktuellen Studie wurden Mäuse auf einer 35-tägigen Mission an Bord der ISS geflogen, um die Auswirkungen der Raumflugumgebung auf die Augengewebestrukturen zu bestimmen, indem die Mikrostruktur der Netzhaut, des RPE und der Aderhautschichten mit Mikro-CT quantifiziert wurden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 wt. % phosphomolybdic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12026-57-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute by Baker Analyzed</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80252500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global ocular structure following spaceflight using a micro-computed tomography (micro-ct) imaging method

Berichte zeigen, dass eine längere Exposition gegenüber einer Raumflugumgebung morphologische und funktionelle ophthalmologische Veränderungen bei Astronauten während und nach einer Mission der Internationalen Raumstation (ISS) verursacht. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser durch die Raumfahrt induzierten Veränderungen sind jedoch derzeit unbekannt. Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss der Raumflugumgebung auf die Augenstrukturen zu bestimmen, indem die Dicke der Mausnetzhaut, des retinalen Pigmentepithels (RPE), der Aderhaut und der Skleraschicht mittels Mikro-CT-Bildgebung bewertet wurde. Zehn Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse wurden an Bord der ISS für eine 35-tägige Mission untergebracht und kehrten dann lebend zur Gewebeanalyse zur Erde zurück. Zum Vergleich: Bodenkontrollmäuse (GC) auf der Erde wurden unter identischen Umgebungsbedingungen und Hardware gehalten. Augengewebeproben wurden für Mikro-CT-Analysen innerhalb von 38(±4) Stunden nach dem Splashdown gesammelt. Die Bilder des Querschnitts der Netzhaut, des RPE, der Aderhaut und der Skleraschicht des fixierten Auges wurden in einer axialen und sagittalen Ansicht mit einem Mikro-CT-Bildaufnahmeverfahren aufgezeichnet. Die Mikro-CT-Analyse zeigte, dass die Querschnittsbereiche der Netzhaut, RPE und Der Aderhautschichtdicke in Raumflugproben im Vergleich zu GC verändert wurden, wobei Raumflugproben im Vergleich zu Kontrollen deutlich dünnere Querschnitte und Schichten zeigten. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die Mikro-CT-Evaluierung eine empfindliche und zuverlässige Methode zur Charakterisierung von Veränderungen der Augenstruktur ist. Diese Ergebnisse sollen das Verständnis der Auswirkungen von Umweltbelastungen auf globale Augenstrukturen verbessern.

Die mittlere Dicke der Netzhaut-, RPE-, Aderhaut- und Skleraschicht wurde mit den Mikro-CT-Scans nach dem obigen Protokoll aufgezeichnet (Abbildung 1). Die Technik zeigte eine multiplanare Rekonstruktion der Augen in drei verschiedenen Ansichten. Während der Analyse konnte der Beobachter durch die gesamte Stichprobe scrollen, um die Analyse mitten in der Stichprobe zu standardisieren.
Die Mikro-CT-Analyse zeigte die Querschnittsbereiche der Augen in der sagittalen und axialen Ansicht (Abbildung 2 und Abbildung 3), in denen die linearen Messungen durchgeführt wurden. RPE und Aderhautschicht waren in der Raumfluggruppe signifikant oder im Vergleich zur GC-Gruppe deutlich oder tendenziell niedriger (Abbildung 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Mikro-CT-Verfahren von Weichgewebe. (A) Weichteilprobe (Mausauge). (B) Proben wurden in 4% Formaldehyd in Phosphatpufferlösung (PBS) fixiert. Nach der Fixierung wurden die Augen der Mäuse in Ethanol dehydriert. Um eine weitere und abrupte Schrumpfung der festen Probe zu verhindern, wurde eine abgestufte Reihe von Ethanollösungen verwendet, beginnend mit 50% Ethanol für 1 h und den folgenden Ethanollösungen in den aufgeführten Konzentrationen, jeweils 1 Stunde: 70, 80, 90, 96 und 100%. (C) Die Augen der Mäuse wurden 6 Tage lang in Phosphomolybdinsäure (PMA) gefärbt, in absolutem Ethanol gewaschen und dann in einzelne 2 ml Kunststoffbehälter mit absolutem Ethanol gefüllt. (D) Ein Desktop-Röntgen-Mikro-CT-Systemscanner wurde verwendet, um die Netzhautverletzung bei Mäuseaugen zu bewerten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig02.jpg"> Abbildung 2: Sagittale Ansicht einer Bodenkontrollmaus. Die Augenschichten auf der rechten Seite des Bildes sind kommentiert, von oben nach unten, Netzhaut (0,077 mm), Netzhautpigmentschicht (RPE, 0,038 mm), Aderhaut (0,041 mm), Sklera (0,059 mm). Diese Zahl stammt von Overbey et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig03.jpg"> Abbildung 3: Axialansicht einer Bodenkontrollmaus. Die Augenschichten auf der rechten Seite des Bildes sind kommentiert, von oben nach unten, Netzhaut (0,144 mm), Netzhautpigmentschicht (RPE, 0,051 mm), Aderhaut (0,041 mm), Sklera (0,073 mm). Diese Zahl stammt von Overbey et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig04.jpg"> Abbildung 4: Durchschnittliche Dicke der Netzhautschicht, der RPE-Schicht und der Mithautschicht, die mit micro-CT in den Raumflug- und Kontrollgruppen gemessen wird. Die Anzahl der Zählungen wurde auf fünf Netzhaut pro Gruppe gemittelt. Werte wurden als mittlere Dicke ± Standardfehler (SEM) dargestellt. SEM des Mittelwerts ist mit Fehlerbalken gekennzeichnet. Deutlich niedriger in der Querschnittsdicke in der Raumfluggruppe (FLT) im Vergleich zur Gruppe der Bodenkontrolle (GC) wird "*" (p < 0,05) bezeichnet. Diese Zahl stammt von Overbey et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography Micro-CT Imaging Method

Wir präsentieren ein Protokoll mit hochauflösender Mikro-Computertomographie-Bildgebung, um festzustellen, ob die Raumfahrt Schäden an Augenstrukturen verursacht hat. Das Protokoll zeigt die mikro-CT-abgeleitete Messung von ex vivo Nagetier-Augenstrukturen. Wir zeigen die Fähigkeit, okuläre morphologische Veränderungen nach der Raumfahrt mit einer zerstörungsfreien dreidimensionalen Technik zur Bewertung von Augenschäden zu bewerten.

Bewertung der globalen Augenstruktur nach der Raumfahrt mit einer mikroberechneten Tomographie (Micro-CT) Imaging-Methode

Reports show that prolonged exposure to a spaceflight environment produces morphologic and functional ophthalmic changes in astronauts during and after an ...

Hier schlagen wir eine Methode zur Bewertung der globalen Augenstruktur nach der Raumfahrt mit Mikrocomputer-Tomographie-Bildgebungsmethode vor. Die Raumflugumgebung, die die Exposition von Paragravitation und Strahlung umfasst, bewirkt einzigartige Veränderungen in der menschlichen Physiologie, einschließlich Flüssigkeitsverschiebungen. Diese Flüssigkeitsverschiebungen führen zu erhöhtem intrakraniellen Druck und wurden als Hauptursache für das neurookuläre Syndrom der Raumfahrt zugeschrieben.Die physiologische Auswirkung von SANS wirkt sich auf mehrere Komponenten des Auges aus und umfasst optische Bandscheibenödeme, Globe-Abflachung, Aderhaut- und Netzhautfalten, hyperopic und refraktive Fehlerverschiebungen und Nervenfaserschicht-Infracts. Während die physiologischen Eigenschaften von SANS gut dokumentiert sind, sind die Mechanismen, die SANS antreiben, immer noch schlecht verstanden. Um SANS besser verstehen zu können, werden Nagetiermodelle für nicht-invasive bildgebende Verfahren eingesetzt.Eine dieser Techniken ist micro-CT, die erfolgreich für die Bewertung von anatomischen Strukturen und pathologischen Prozessen bei Tieren eingesetzt wurde, die so klein sind wie Mäuse. Micro-CT kann eine mikrogroße Auflösung erreichen, und durch die Kombination mit einem Kontrastmittel kann es einen guten Kontrast für die Weichgewebe bieten. Micro-CT bietet einen klaren Vorteil im Vergleich zu herkömmlichen Methoden, einschließlich grober Anatomie, Lichtmikroskopie und Histologie-Untersuchung, um das geometrische Profil der Proben und die räumlichen Beziehungen zwischen den Strukturen nicht zu beschädigen.In unserer aktuellen Studie wurden Mäuse 35 Tage lang an Bord der Internationalen Raumstation der Weltraumumgebung ausgesetzt, um festzustellen, ob die Weltraumumgebung Augenschäden verursacht, indem sie die Mikrostruktur der Netzhaut, des RPE und der Aderhautschichten mit Micro-CT quantifizieren. Hier haben wir gezeigt, wie wir Proben für die Mikro-CT-Analyse vorbereitet haben. Mäuse wurden verwendet und Augen innerhalb von 38 plus oder minus vier Stunden nach dem Abspritzen.Die Augen wurden enukleiert, und die linken Augen wurden in vier Prozent Paraformaldehyd und Phosphatpuffern für 24 Stunden saline fixiert. Nach der Fixierung wurden die Augen in Ethanol dehydriert. Um eine weitere und abrupte Schrumpfung der festen Probe zu verhindern, wurde eine abgestufte Reihe von ethanoischen Lösungen verwendet.Zuerst wurden die Proben für eine Stunde auf 50% Ethanol übertragen und dann die Konzentrationen für jeweils eine Stunde erhöhen, 70, 80, 90, 96 und 100%Danach wurden die Augen sechs Tage lang mit 10% Gewicht pro Volumen Phospholipidsäure gefärbt. Schließlich wurden die Proben in absolutem Ethanol gewaschen und dann in einzelne zwei Mühlen-Kunststoffbehälter, die mit absolutem Ethanol gefüllt waren, zum Scannen platziert. Ein Wattepad wurde ebenfalls hinzugefügt, um die Probe während des Scannens zu stabilisieren.Als nächstes wurde die Probe in einem Desktop-Röntgen-Mikro-CT-System SkyScan 1272 Scanner platziert, um die Netzhautschäden zu bewerten. Zum Scannen haben wir die SkyScan 1272 Software verwendet. Nach dem Öffnen der Software haben wir unser Beispiel im Rahmen zentriert.In unserem Protokoll verwenden wir keinen Filter und legen die Matrix fest, um die Pixelgröße auf vier Mikrometer zu erhöhen. Die Mikropositionierung wird verwendet, um die Probe im Rahmen zentriert zu halten. Als Nächstes überprüfen wir die Parameter, um das Kontrastmittel in unserer Probe zu maximieren und die Maschine zu kalibrieren.Um die Kalibrierung durchzuführen, entfernen wir das Sample aus dem Scanner und legen die Scanparameter fest. Während der Kalibrierung wird auch eine flat-filled Korrektur überprüft. Es sollte größer als 80% Nach den Kalibrierungen wird die Probe wieder in die Scankammer eingesetzt.Vor dem Scannen werden die Beispieldateien benannt. Die Scanparameter sind wie folgt, Rotationsschritt 0,4, Frames vier, zufällige Bewegung 30, überprüfen Sie, ob die Pixelgröße auf 4 Mikrometer eingestellt ist. Dann wird der Scan gestartet.Nach dem Scannen wird NRecon verwendet, um das Beispiel zu rekonstruieren. Zuerst öffnen wir die Dateien aus dem Scan und sehen uns die unformatierten Scanbilder an. Wir passen den Sprung des Histogramms so an, dass er in die Kurve passt.Als Nächstes korrigieren wir das Strahlhärteartifaktum. Dann passen wir das Glättungsartefakt an. Schließlich korrigieren wir die Ringartefaktreduktion.Nach all den Korrekturen haben wir bestätigt, dass unsere Proben in unsere Interessensregion passen. Dann können wir mit dem Wiederaufbau beginnen. Wir verwenden die DataViewer Software, um die rekonstruierten Bilder in allen drei Bereichen zu visualisieren.Zur Analyse wird die CTAn-Software verwendet. Die rekonstruierten Bilder werden in die Software geladen. Der optische Nerv wurde verwendet, um die Region von Interesse für die Analyse zu entfernen.Bei der Berechnung haben wir den mittleren Teil des Interessenbereichs verwendet, um alle Messungen für die Analyse durchzuführen. Zur Berechnung der linearen Messung der Fläche wurden drei wiederholte Messungen durchgeführt. Die folgenden Messungen wurden für Augengewebe, Netzhaut, RPE, Aderhaut und unsere Mikro-CT-Analyse durchgeführt, die zeigten, dass die Querschnittsbereiche der Netzhaut, des RPE und der Aderhautschicht in Raumflugproben im Vergleich zu Bodenkontrollen deutlich niedriger waren.Micro-CT bietet eine effiziente und zerstörungsfreie Methode, um die Größe von Änderungen ohne Manipulation zu berechnen. Durch den Einsatz von Kontrastmittel verbessert es die Qualität von Micro-CT-Bildern, die uns helfen, ein erfolgreiches klares grafisches Bild der Rekonstruktion ohne die Zwischenstruktur des Exemplars zu erhalten. Darüber hinaus zeigt es in den Originaldaten, dass die Zugänglichkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erhöht ist.Darüber hinaus, Grundzweck, ist es akzeptabel, dreidimensionale Messungen zu verwenden, aber die Segmentierung der groben dreidimensionalen Struktur kann vorteilhaft sein, um spezifische Umrisse der gesamten Probe zu liefern. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Bedingungen der Raumfahrt, insbesondere Gravitationsveränderungen, eine akute und kurzfristige Reaktion im Auge hervorrufen können. Darüber hinaus sollten zukünftige Arbeiten volumetrische Daten verwenden, um andere Analysen durchzuführen, die die Micro-CT-Bildgebungsfunktionen nutzen, da sie erfolgreich für die Untersuchung vieler normaler und pathologischer Gewebe verwendet wurden.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography (Micro-CT) Imaging Method

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Forschung

Biologie

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

Eine einfache Methode zur Bildgebung Arabidopsis Leaves Mit Perfluordecalin als Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Mit hochauflösenden Computertomographie, die dreidimensionale Struktur und Funktion pflanzlicher Gefäßsystem Visualisieren

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Die Slice-Kultur-Verfahren zur Nach Entwicklung der Zahnkeime In Explantation Kultur

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Strategien zur Optimierung der Datenerfassung in der Kryoelektronentomographie

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

Bewertung der globalen DNA-Doppelstrang-Endsektion mittels BrdU-DNA-Markierung in Verbindung mit Cell Cycle Discrimination Imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...