Name: assessment of global ocular structure following spaceflight using a micro-computed tomography (micro-ct) imaging method
Uploaded: 2020-10-27T13:00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography Micro-CT Imaging Method at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענק נאס"א ביולוגיה בחלל # NNX15AB41G ו LLU המחלקה למדעים בסיסיים. סונגשין צ'וי, דניס לווסון ורבקה קלוץ תרמו באופן משמעותי להצלחת מחקר התעופה בחלל שלנו ואנחנו מעריכים מאוד את תמיכתם. המחברים גם רוצים להודות לכל קבוצת תוכנית שיתוף הביו-פשצימן של נאס"א על עזרתם הגדולה.
המחברים גם רוצים להודות למרכז לחקר השיניים עבור שירות מיקרו-CT.

המחקר עקב אחר ההמלצות המתוארות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ואושר הן על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים והן על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת לומה לינדה (LLU) ומינהל האווירונאוטיקה והחלל הלאומי (נאס"א). מידע מפורט יותר לגבי ניסוי טיסה זה ניתן למצוא במקוםאחר 9,15.
1. תנאי טיסה ובקרה
הערה: מטען שירות אספקה מסחרי 12 (CRS-12) שוגר על ידי SpaceX במרכז החלל קנדי (KSC) במשימה בת 35 יום באוגוסט 2017 שכללה עכברים בני 10 שבועות C57BL/6 (n = 20) לניסוי מחקר המכרסמים התשיעי של נאס"א (RR-9).
<ol><li>לפני החזרה לכדור הארץ באמצעות קפסולת הדרקון של SpaceX, יש העכברים לחיות בבתי גידול מכרסמים של נאס"א (RH) על סיפון ISS במשך 35 ימים בטמפרטורת סביבה של 26-28 ° C עם מחזור אור / כהה של 12 שעות לאורך כל הטיסה.</li>
	<li>מקם עכברי בקרת קרקע (GC) באותה חומרת דיור המשמשת בטיסה והתאמת פרמטרים סביבתיים כגון טמפרטורה ופחמן דו חמצני (CO2) רמות קרובככל האפשר בהתבסס על נתוני טלמטריה.</li>
	<li>להאכיל עכברי GC אותה דיאטת בר מזון נאס"א כמו עמיתיהם מבוססי החלל. ספק הן את הטיסה בחלל והן את עכברי GC עם אותה גישה אד libitum למים ומזון.</li>
</ol>2. הערכה לאחר טיסה של העכברים
<ol><li>בתוך 28 שעות של התזה על כדור הארץ, להעביר את העכברים לאוניברסיטת לומה לינדה (LLU). ברגע שהם שם, הסירו את העכברים ממתחם בעלי החיים והעריכו את ההישרדות והבריאות. הערה: לאחר התצפית, צוות הבדיקה דיווח כי כל העכברים שרדו את משימת החלל 35 יום היו במצב טוב, כלומר אין ליקויים ניכרים / חריגות.</li>
</ol>3. לנתח ושימור של עיני העכבר לאחר spaceflight
<ol><li>בתוך 38 (±4) שעות של splashdown (n = 20/group), המתת דם העכברים ב 100% CO2 ולאסוף את עיניהם.</li>
	<li>לנתח את הרשתיות העין הימנית ולמקם בנפרד cryovials סטרילי, snap-freeze בחנקן נוזלי, ולשמור על $80 °C לפני השימוש.</li>
	<li>לתקן את כל העיניים השמאליות ב 4% paraformaldehyde בתמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) במשך 24 שעות ולאחר מכן לשטוף עם תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) עבור מיקרו-CT assays.</li>
</ol>4. הכנה לדוגמה לסריקת מיקרו-CT
<ol><li>לאחר קיבעון, מייבשים את עיני העכברים באתנול. כדי למנוע התכווצות נוספת או פתאומית של המדגם הקבוע, השתמשו בסדרה מדורגת של פתרונות אתנול: החל מ-50% אתנול למשך שעה אחת ולאחר מכן הגדלת ריכוזי פתרונות האתנול כדלקמן למשך שעה אחת כל אחד: 70, 80, 90, 96 ו-100%. הערה: יש לטפל בעיני העכברים בתא מכסה המנוע.</li>
	<li>חומצה פוספומולי בדיק (PMA) מכתים התראה: על חשבון PMA להיות מאכל, מסרטנים, רעיל לאיברים, ציוד אישי מגן מתאים יש צורך, כולל השימוש בכסה מנוע אדים.<ol>
<li>להכין את פתרון הכתמים: 10 מ"ג של PMA ב 100 מ"ל של אתנול מוחלט.</li>
		<li>הכתים את העיניים של העכברים (10 wt. % חומצה פוספומולי בדיק - PMA מומס אתנול מוחלט) במשך 6 ימים.</li>
		<li>לפני הסריקה, תחילה לשטוף את דגימות העין אתנול מוחלט ולאחר מכן למקם כל עין במיכלי פלסטיק בודדים 2 מ"ל כי הם מלאים 100% אתנול מוחלט. הוסף כרית כותנה לדגימות מיוצבות במהלך הסריקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. סריקה וניתוח מיקרו-CT
הערה: סורק SkyScan 1272, מערכת מיקרו-CT רנטגן שולחנית, שימש להערכת נזק רשתית בעיני העכברים
<ol><li>הר את דגימת הרקמה הרכה למחזיק מדגם מתאים. כדי למנוע תנועה כלשהי במהלך מדידות הרנטגן CT, ודא התאמה הדוקה של הדגימה על מחזיקה(איור 1).</li>
	<li>עם יישור קפדני של כל דגימה, סרוק בנפרד את הדגימה באמצעות צילומי רנטגן.<ol>
<li>לאחר פתיחת התוכנה, מרכז את הדגימה במסגרת. בפרוטוקול, אל תשתמש במסנן והגדר את המטריצה כך להגדיל את הפיקסל ב- 4 μm. השתמש במיקרו-מיקום כדי להשאיר את מרכז הדגימה על המסגרת.</li>
		<li>לאחר מכן, בדוק את הפרמטר כדי למקסם את סוכן הניגודיות. כדי לבצע את הכיול, הסר את הדגימה ובדוק שהתיקון בעל השדה השטוח גדול מ- 80%.</li>
		<li>לאחר הכיול, הכנס מחדש את הדגימה לתא הסריקה. לסריקה, השתמש בשלב סיבוב של 0.400, מסגרת בממוצע של 4, תנועה אקראית של 30 וסובב את הדגימות ב- 180°.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש בג'יג מיקום עבור מידות חוזרות. בשל שיפור ניגודיות שלב שבוצע כמתואר, פרטי אובייקט קטן כמו 4 μm ניתן לזהות מצילומי רנטגן שנוצרו על ידי צינור רנטגן מיקרו מיקוד אטום (אנודה טונגסטן) ב 50 keV ו 80 mA עם זמן אינטגרציה של 90 דקות. הערה: פרמטרי הרכישה המפורטים בסעיף זה לבחירה כדי להפיק סריקות CT מבט כולל עם איכות התמונה הגבוהה ביותר.</li>
	<li>לאחר הסריקה, השתמש בתוכנה (לדוגמה, NRecon) כדי לשחזר את הנתונים.<ol>
<li>התאם את היסטוגרמה והשתמש באותו טווח (0 – 0.24) עבור כל הדגימות. שחזור אזור עניין היה מעגל, ולא נעשה שימוש בקנה מידה או בתוויות.</li>
		<li>כדי להפחית חפצים במהלך הסריקה, השתמש בתיקון הקשחת קרן של 20, תיקון החלקה של 1, הפחתת חפץ טבעת של 6, ולא לבצע שום שינוי בפיצוי אי-היישור. לאחר השיקום, אושר כי הדגימה נמצאת באזור של עניין.</li>
		<li>למקם מחדש תמונות באמצעות מישור במקביל לעצב הראייה ועדשת העיניים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר הסריקה, השתמש בתוכנה (לדוגמה, DataViewer) כדי להמחשה את התמונות הבשוחזרות בכל שלוש התצוגות. הערה: במידת הצורך, עם תוכנה זו, ניתן למקם מחדש את התמונות באמצעות מישור המקביל לעצב הראייה ולעדשה של העיניים כדי לבצע ניתוח מתוקן.</li>
	<li>ניתוח תיאורי<ol>
<li>למדוד את המבנים באמצעות כלי מדידה בתוכנה (למשל, CTAn). השתמש בעצב האופטי כדי לבודד את אזור העניין לניתוח. לפי חישוב, הפרוטוקול השתמש בפרוסה האמצעית כדי לבצע את המידות. הערכה זו בוצעה על ידי ניתוח תיאורי (איור 2 ואיור 3).</li>
		<li>לבצע מדידות של הרשתית, אפיתל פיגמנט רשתית (RPE), כורואיד, ושכבת sclera בשכבת sagittal(איור 2) ותצוגהסיסי(איור 3). יש לבצע שלוש מידות של כל מבנה כדי לחשב ממוצע.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dawson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+New+Space+Race.">The New Space Race.</a> The Politics and Perils of Space Exploration. , 1-24 (2017).</li><li>Mao, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+environment+induces+mitochondrial+oxidative+damage+in+ocular+tissue.">Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue.</a> Radiation Research. 180, 340-350 (2013).</li><li>Overbey, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+Exposed+to+Combined+Chronic+Low-Dose+Irradiation+and+Modeled+Microgravity+Develop+Long-Term+Neurological+Sequelae.">Mice Exposed to Combined Chronic Low-Dose Irradiation and Modeled Microgravity Develop Long-Term Neurological Sequelae.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4094 (2019).</li><li>Nelson, E. S., Mulugeta, L., Myers, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgravity-induced+fluid+shift+and+ophthalmic+changes.">Microgravity-induced fluid shift and ophthalmic changes.</a> Life. 4, 621-665 (2014).</li><li>Lee, A. G., Mader, T. H., Robert Gibson, C., Brunstetter, T. J., Tarver, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space+flight-associated+neuro-ocular+syndrome+(SANS).">Space flight-associated neuro-ocular syndrome (SANS).</a> Eye. 32, 1164-1167 (2018).</li><li>Stenger, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Evidence Report: Risk of Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome (SANS). , (2017).</li><li>Garrett-Bakelman, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NASA+Twins+Study:+A+multidimensional+analysis+of+a+year-long+human+spaceflight.">The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a year-long human spaceflight.</a> Science. 364, (2019).</li><li>Mader, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+disc+edema,+globe+flattening,+choroidal+folds,+and+hyperopic+shifts+observed+in+astronauts+after+long+duration+space+flight.">Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight.</a> Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).</li><li>Mao, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+ocular+response+to+a+35-day+spaceflight+mission:+Evidence+of+blood-retinal+barrier+disruption+and+ocular+adaptations.">Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations.</a> Science Reports. 9 (1), 8215 (2019).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+developmental+biology:+a+versatile+tool+for+high-contrast+3D+imaging+at+histological+resolutions.">MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions.</a> Developmental Dynamics. , 632-640 (2009).</li><li>Silva, J. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+non-destructive+soft-tissue+visualization+with+X-ray+staining+micro-tomography.">Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography.</a> Science Reports. 5, 14088 (2015).</li><li>Descamps, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+tissue+discrimination+with+contrast+agents+using+micro-CT+scanning.">Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-CT scanning.</a> Belgian Journal of Zoology. , 20-40 (2014).</li><li>Wu, J., Yin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+research+of+nasolabial+muscle+structure+in+fetus+with+cleft+lip:+an+iodine+staining+technique+based+on+microcomputed+tomography.">Anatomy research of nasolabial muscle structure in fetus with cleft lip: an iodine staining technique based on microcomputed tomography.</a> Journal of Craniofacial Surgery. 25 (3), 1056-1061 (2014).</li><li>Roque-Torres, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application of Micro-CT in Soft Tissue Specimen Imaging. In: Orhan K. (eds) Micro-computed Tomography (micro-CT) in Medicine and Engineering. , 139-170 (2020).</li><li>Overbey, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+influences+gene+expression,+photoreceptor+integrity,+and+oxidative+stress-related+damage+in+the+murine+retina.">Spaceflight influences gene expression, photoreceptor integrity, and oxidative stress-related damage in the murine retina.</a> Science Reports. 9 (1), 13304 (2019).</li><li>Elkhoury, J. E., Shankar, R., Ramakrishnan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+and+Limitations+of+X-Ray+Micro-CT+with+Applications+to+Sandstones+and+Limestones.">Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones.</a> Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).</li><li>Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+limitations+of+X-Ray+micro-computed+tomography+in+arthropod+neuroanatomy:+A+methodological+and+comparative+survey.">Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).</li><li>Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitational+Influence+on+Intraocular+Pressure:+Implications+for+Spaceflight+and+Disease.">Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease.</a> Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).</li><li>Lee, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+associated+neuro-ocular+syndrome+(SANS)+and+the+neuro-ophthalmologic+effects+of+microgravity:+a+review+and+an+update.">Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update.</a> NPJ Microgravity. 6, 7 (2020).</li></ol>

לכל הסופרים אין מה לחשוף.

תוצאות המחקר הראו כי היו שינויים מבניים בעין העכבר של הטיסה בחלל באמצעות טכניקת מיקרו-CT בהשוואה לקבוצות GC, במיוחד של הרשתית, RPE, ואת שכבות כורואיד של העין, כפי שמעיד על ידי עובים ירד. Micro-CT מספק טכניקה יעילה ולא הרסנית לאפיון השינויים ללא צורך במניפולציה. השימוש בכתמים PMA שיפר את איכות תמונות מיקרו-CT כדי להשיג בהצלחה תמונות רמוגרפיות תלת-ממדיות ברורות לאחר השחזור, ויתור על כל צורך לשנות פיזית את מבנה הדגימה. יתרון נוסף של תמונות אלה הוא שהם מציגים את כל אזור העניין באופן דיגיטלי, ובכך להגדיל את הנגישות, כמו גם לשחזר את הממצאים. באמצעות תמונות מיקרו-CT המיוצר במהלך מחקר זה, הדגימה ממוקדת הראה בידול של מבנים מרובים כמו הרשתית, RPE, choroid, ו שכבת sclera לקביעת העובי של כל שכבה.
שלב קריטי בתוך הפרוטוקול הוא מניפולציה של הדגימות בשל גודלן ומרקםן. הטיפול בדגימה חייב להיעשות בזהירות מבלי להפעיל לחץ על הדגימה במהלך ההכנה. למיקרו-CT יש כמה מגבלות: רזולוציה והיעדר ערכים מתוקנים עבור הפרמטרים. במהלך הסריקה, סורקי מיקרו-CT שונים עשויים להיות אלגוריתמים שונים לעיבוד תמונה; עם זאת, ניתן להמשיך לכיול גווני אפור כדי להתגבר על כל בעיה. לאחר הסריקה, שחזור התמונות צריך להתבסס על הרקמה והניתוח שיבוצע. זה יכול להיות קריטי מאז איכות התמונה תלויה במערכת הטומוגרפית, ההגדרות, גודל הדגימה, כמו גם שיטותההכנה 16,17.
בשל היישום המוצלח שלה בחקר מספר סוגים של רקמות נורמליות ופתולוגיות, יכולות הדמיה מיקרו-CT יש להשתמש במחקר עתידי כדי לאסוף נתונים volumetric לניתוחים אחרים. לפיכך, בהתבסס על מטרת המחקר הנוכחי, היה מקובל להשתמש במדידות דו-ממדיות, אך פילוח מבנה התלת-ממד הגולמי יכול גם להועיל כדי לספק קווי מתאר מדויקים של הדגימה כולה. אפילו עם כל היתרונות של טכניקה לא הרסנית, מיקרו-CT לא יחליף שיטות אחרות כגון אימונוהיסטוכימיה, אבל ישלים ויאפשר ניתוחים היסטולוגיים הבאים אם תרצה.
מצב ממושך של הטיסה בחלל מייצר סדרה של שינויים מבניים ופונקציונליים באסטרונאוטים במהלך ואחרי משימת החלל המוגדרת כ-SANS. הממצאים כוללים משמרות היפראופיות, שיטוח כדור הארץ, קפלי כורואיד/רשתית וכתמי צמר גפן19. בניגוד טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית של אסטרונאוטים (OCT) מציאת של עיבוי שכבת סיבי עצב ברשתית, דילול של רשתית ושכבה כורואידית תועד במחקר זה מיקרו-CT בעלי חיים. תוצאות אלה היו בלתי צפויות. אי-התאמה זו עשויה להיווות כתוצאה מגורמים מבלבלים. לעכברים יש תנוד נוזלי צ'פלאד מוגבל בהשוואה לבני אדם. חוסר זה של שינוי נוזלים אולי עורר תגובות שונות לשינויים כבידתיים. שנית, עכברים נותחו בתוך 38 שעות לאחר ההתזה, ותגובה חריפה לעיבוד מחדש עשויה גם לתרום לשינויים מורפולוגיים ברשתית ובכ'ורואיד. אישור אפשרות זו דורש מדידות נוספות במהלך הטיסה בחלל ולטוח הארוך לאחר המשימה.
תוצאות המחקר מצביעות על כך שתנאי טיסת החלל, במיוחד שינויים כבידתיים, עשויים לגרום לתגובה חריפה וקצרת טווח בעין. דרושה חקירה נוספת כדי לקבוע את ההשלכות של השינויים החריפים על תפקוד רשתית ועל מנגנון השינויים המבניים המושרה על-ידי חלל.

בסביבת microgravity של spaceflight, לחץ תוך גולגולתי מוגבר (ICP) הנגרמת על ידי שינוי נוזלים אולי תרם לתסמונת נוירו-עינית הקשורה לחללית (SANS)1,2,,3,,4,,5. ואכן, יותר מ-40% מהאסטרונאוטים חוו את SANS במהלך משימת תחנת החלל הבינלאומית (ISS)6 ואחריה, כולל נושא הטיסה לחלל של מחקרהתאומים של נאס"א 7. הפתופיזיולוגיה הנוכחית של SANS כוללת שינויים פיזיולוגיים כגון בצקת דיסק אופטי, שיטוח כדור הארץ, קפלי כורואידים ורשתית, שינויי שגיאה שבירה היפראופית, ואוטמי שכבת סיבי עצב (כלומר, כתמי צמר גפן)ומתועדים היטב 5,8. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים של השינויים והגורמים התורמים לפיתוח הנזק אינם ברורים. על מנת לקבל הבנה טובה יותר של SANS, מודלים של בעלי חיים זמינים לאפיון השינויים הקשורים לחללית במבנה ובתפקוד של רשתית.
בחקירה קודמת על אותן חיות, דיווחנו על ההשפעה של 35 ימים של חללית על רשתית העכבר. התוצאות מסיקות כי spaceflight גורם נזק משמעותי ברשתית וסקולטור רשתית, וכמה חלבונים / מסלולים הקשורים למוות תאים, דלקת ומתח חילוף חומרים שונו באופן משמעותי לאחר spaceflight9.
כיום, ישנן מגוון רחב של טכניקות הדמיה לא פולשניות הוקמו כדי לפקח על התפתחות המחלה והתקדמות, כמו גם תגובות פיזיולוגיות לחצים סביבתיים שונים, אשר נמצאים גם בשימוש נרחב במודלים מכרסמים קטנים. אחת הטכניקות הללו היא micro-CT, אשר מעריך מבנים אנטומיים ותהליכים פתולוגיים, ונעשה בו שימוש מוצלח על אורגניזמים קטנים כמו עכברים10.
Micro-CT יכול להשיג רזולוציה microsized, וזה יכול לספק ניגודיות גבוהה לניתוח נפח של רקמות רכות עם תוספת של סוכןהניגודיות המתאים 10,,11,12,,13,,14. טכנולוגיית Micro-CT היא יתרון בהשוואה לשיטות מסורתיות כגון אנטומיה ברוטו, מיקרוסקופיה קלה, ובדיקת היסטולוגיה, כפי שהוא ממזער נזק פיזי לפרופיל הגיאומטרי של הדגימות ואינו משנה את הקשר המרחבי בין מבנים. בנוסף, ניתן לשחזר מודלים תלת מימדיים (תלת-ממדיים) של מבנים מתמונות מיקרו-CT12,14. עד כה, למרות ראיות המציגות ליקוי ראייה בעקבות חשיפה לסביבת החלל, מעט נתונים במודלים של בעלי חיים זמינים להבנה טובה יותר של השינויים הקשורים לחללית במבנה ובתפקוד של רשתית. במחקר הנוכחי, עכברים הוטסו במשימה של 35 יום על סיפון ISS כדי לקבוע את ההשפעה של סביבת הטיסה בחלל על מבני רקמות עינית על ידי כימות המיקרו-מבנה של הרשתית, RPE, ואת שכבות כורואיד באמצעות מיקרו-CT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 wt. % phosphomolybdic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12026-57-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute by Baker Analyzed</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80252500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global ocular structure following spaceflight using a micro-computed tomography (micro-ct) imaging method

על פי הדיווחים, חשיפה ממושכת לסביבת הטיסה בחלל מייצרת שינויים מורולוגיים ואופטלמוסיים פונקציונליים באסטרונאוטים במהלך משימת תחנת החלל הבינלאומית (ISS) ואחריה. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים של שינויים אלה הנגרמים על-ידי חלל אינם ידועים כעת. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לקבוע את ההשפעה של סביבת spaceflight על מבנים עיניים על ידי הערכת עובי רשתית העכבר, אפיתל פיגמנט רשתית (RPE), כורואיד ואת שכבת sclera באמצעות הדמיית מיקרו CT. עכברים זכרים בני עשרה שבועות C57BL/6 שוחזרו על סיפון ה-ISS למשימה בת 35 יום ולאחר מכן חזרו לכדור הארץ בחיים לניתוח רקמות. לשם השוואה, עכברי בקרת קרקע (GC) על פני כדור הארץ נשמרו בתנאים סביבתיים זהים וחומרה. דגימות רקמת עינית נאספו לניתוח מיקרו-CT בתוך 38 (±4) שעות לאחר הנחיתה. התמונות של חתך רוחב של הרשתית, RPE, choroid, ואת שכבת sclera של העין הקבועה נרשם בתצוגה סיסית וקשת באמצעות שיטת רכישת הדמיה מיקרו CT. ניתוח המיקרו-CT הראה כי אזורי הרוחב של הרשתית, RPE ועובי שכבת כורואיד שונו בדגימות טיסה בחלל בהשוואה ל-GC, כאשר דגימות טיסה בחלל מראות חתך רוחב ושכבות דקים יותר באופן משמעותי בהשוואה לפקדים. ממצאי מחקר זה מצביעים על כך שהערכת מיקרו-CT היא שיטה רגישה ואמינה לאפיון שינויים במבנה ה עיני. תוצאות אלה צפויות לשפר את ההבנה של ההשפעה של לחץ סביבתי על מבנים עיניים גלובליים.

העובי הממוצע של הרשתית, RPE, choroid, ושכבת sclera נרשם באמצעות סריקות מיקרו CT לאחר ביצוע הפרוטוקול לעיל(איור 1). הטכניקה הראתה שחזור רב-פלנטרי של העיניים בשלוש השקפות שונות. במהלך הניתוח, הצופה הצליח לגלול דרך כל הדגימה כדי לתקנן את הניתוח ממש באמצע הדגימה.
ניתוח המיקרו-CT הראה את אזורי הרוחב של העיניים בתצוגה הסגית והסיסית (איור 2 ואיור 3 ) שבהם בוצעוהמדידות ליניאריות. RPE ושכבה choroid היו באופן משמעותי או מגמה נמוכה יותר בקבוצת spaceflight בהשוואה לקבוצת GC(איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig01v2.jpg"> איור 1: הליך מיקרו-CT של רקמה רכה. (א)דגימת רקמה רכה (עין עכבר). (ב)דגימות תוקנו ב 4% פורמלדהיד בפתרון מאגר פוספט (PBS). לאחר קיבעון, עיני העכברים היו מיובשים באתנול. כדי למנוע התכווצות נוספת ופתאומית של המדגם הקבוע, נעשה שימוש בסדרה מדורגת של פתרונות אתנוליים, החל מ-50% אתנול לשעה אחת ופתרונות אתנול הבאים בריכוזים המפורטים, למשך שעה אחת כל אחד: 70, 80, 90, 96 ו-100%. (ג)עיני העכברים היו מוכתמות בחומצה פוספומוליבידית (PMA) במשך 6 ימים, נשטפו באתנול מוחלט ולאחר מכן הונחו במיכלי פלסטיק בודדים של 2 מ"ל מלאים באתנול מוחלט. (D)סורק מערכת מיקרו-CT רנטגן שולחני שימש להערכת הפציעה הרשתית בעיני עכברים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig02.jpg"> איור 2: מבט קשת של עכבר בקרת קרקע. שכבות העין בצד ימין של התמונה מבוארות, מלמעלה למטה, רשתית (0.077 מ"מ), שכבת פיגמנט רשתית (RPE, 0.038 מ"מ), כורואיד (0.041 מ"מ), sclera (0.059 מ"מ). נתון זה נלקח מ-Overbey ואח'15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig03.jpg"> איור 3: תצוגה סיסית של עכבר בקרת קרקע. שכבות העין בצד ימין של התמונה מסומנות, מלמעלה למטה, רשתית (0.144 מ"מ), שכבת פיגמנט רשתית (RPE, 0.051 מ"מ), כורואיד (0.041 מ"מ), sclera (0.073 מ"מ). נתון זה נלקח מ-Overbey ואח'15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig04.jpg"> איור 4: עובי ממוצע של שכבת רשתית, שכבת RPE ושכבת כורואיד נמדד על-ידי מיקרו-CT בקבוצות הטיסה והפקדה של החלל. ספירות היו בממוצע על פני חמש רשתיות לכל קבוצה. ערכים הוצגו כעובי ± שגיאה סטנדרטית (SEM). SEM של ממוצע מסומן במ קווי שגיאה. נמוך משמעותית בעובי חתך רוחב בקבוצת הטיסה בחלל (FLT) בהשוואה לקבוצת בקרת הקרקע (GC) מסומן '*' (p < 0.05). נתון זה נלקח מ-Overbey ואח'15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography Micro-CT Imaging Method at JoVE.com

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography Micro-CT Imaging Method

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות הדמיית טומוגרפיה מיקרו-מחושבת ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע אם נגרם נזק לתענות חלל על מבנים עיניים. הפרוטוקול מראה את המדידה הזעירה-CT של מבנים עיניים של מכרסם vivo לשעבר. אנו מדגימים את היכולת להעריך שינויים מורפולוגיים עיניים בעקבות טיסות חלל באמצעות טכניקה תלת-מינדית לא הרסנית כדי להעריך נזק עיני.

הערכת מבנה עיני גלובלי בעקבות Spaceflight באמצעות שיטת הדמיה מיקרו-מחושבת (מיקרו-CT)

Reports show that prolonged exposure to a spaceflight environment produces morphologic and functional ophthalmic changes in astronauts during and after an ...

כאן אנו מציעים שיטה להערכת מבנה העין העולמי בעקבות טיסה בחלל באמצעות שיטת הדמיה טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת. סביבת טיסה בחלל, הכוללת שיתוק וחשיפה לקרינה, גורמת לשינויים ייחודיים בפיזיולוגיה האנושית, כולל שינויים בנוזלים. שינויים נוזליים אלה מובילים ללחץ תוך גולגולתי גבוה ומיוחסים כגורם העיקרי לתסמונת נוירו-עינית הקשורה לטיסה בחלל.ההשפעה הפיזיולוגית של SANS משפיעה על רכיבים מרובים של העין וכוללת בצקת דיסק אופטית, שיטוח גלובוס, קפלי כורואידל ורשת, שינויי שגיאות היפרופיים ושבריתיים, ופגיעה בשכבת סיבי העצב. בעוד המאפיינים הפיזיולוגיים של SANS מתועדים היטב, המנגנונים שמנהנים SANS עדיין מובנים היטב. על מנת לקבל הבנה טובה יותר של SANS, מודלים מכרסמים משמשים עבור טכניקות הדמיה לא פולשניות.אחת הטכניקות הללו היא מיקרו-CT, אשר שימש בהצלחה להערכת מבנים אנטומיים ותהליכים פתולוגיים בבעלי חיים קטנים כמו עכברים. מיקרו-CT יכול להשיג רזולוציה בגודל מיקרו, ודרך השילוב עם סוכן ניגודיות, הוא יכול לספק ניגודיות טובה לרקמות הרכות. מיקרו-CT מספק יתרון ברור בהשוואה לשיטות מסורתיות, כולל אנטומיה ברוטו, מיקרוסקופיה קלה ובדיקת היסטולוגיה כדי לא לגרום נזק לפרופיל הגיאומטרי של הדגימות וליחסים המרחביים בין המבנים.במחקר הנוכחי שלנו, עכברים נחשפו לסביבת החלל במשך 35 ימים על סיפון תחנת החלל הבינלאומית כדי לקבוע אם סביבת החלל גורמת לנזק עיני על ידי כימות המיקרו-מבנה של הרשתית, RPE ושכבות choroid באמצעות מיקרו-CT. כאן הדגמנו כיצד הכנו דגימות לניתוח מיקרו-CT. השתמשו בעכברים ועיניים בתוך 38 פלוס או מינוס ארבע שעות לאחר התזה למטה.העיניים היו מחונכות, והעיניים השמאליות תוקנו בארבעה אחוזים של מאגרי פרפורמלדהיד ופוספט במשך 24 שעות. לאחר קיבעון, העיניים היו מיובשות באתנול. כדי למנוע הצטמקות נוספת ופתאומית של המדגם הקבוע, נעשה שימוש בסדרה מדורגת של פתרונות אתניים.ראשית, הדגימות הועברו 50%אתנול במשך שעה אחת ולאחר מכן הגדלת ריכוזים במשך שעה אחת כל אחד, 70, 80, 90, 96, ו 100% לאחר מכן, העיניים היו מוכתמות עם 10% משקל לכל נפח חומצה פוספוליפיד במשך שישה ימים. לבסוף, דגימות נשטפו באתנול מוחלט ולאחר מכן הונחו בודדים שני מיכלי פלסטיק טחנה מלא אתנול מוחלט לסריקה. כרית כותנה נוספה גם כדי לייצב את המדגם במהלך הסריקה.לאחר מכן, המדגם הונח בתוך שולחן העבודה רנטגן מיקרו CT מערכת SkyScan 1272 סורק כדי להעריך את הנזק הרשתית. לסריקה, השתמשנו בתוכנת SkyScan 1272. לאחר פתיחת התוכנה, רתמנו את הדגימה שלנו במסגרת.בפרוטוקול שלנו, אנחנו לא משתמשים במסנן ומגדירים את המטריצה כדי להגדיל את גודל הפיקסל לארבעה מיקרון. מיקום מיקרו משמש כדי לשמור על המדגם מרוכז במסגרת. לאחר מכן, אנו בודקים את הפרמטרים כדי למקסם את סוכן הניגודיות בתוך המדגם שלנו ולכייל את המכונה.כדי לבצע את הכיול, אנו מסירים את הדגימה מהסורק, ומגדירים את פרמטרי הסריקה. במהלך הכיול נבדק גם תיקון מלא שטוח. זה צריך להיות גדול מ 80% לאחר כיול, המדגם הוא מחדש לתוך תא הסריקה.לפני הסריקה, נקראים הקבצים לדוגמה. פרמטרי הסריקה הם כדלקמן, שלב סיבוב 0.4, מסגרות ארבע, תנועה אקראית 30, בדיקה כפולה שגודל הפיקסל מוגדר ל-4 מיקרון. ואז הסריקה מתחילה.לאחר הסריקה, NRecon משמש לבנייה מחדש של הדגימה. ראשית, אנו פותחים את הקבצים מהסריקה והצגת תמונות הסריקה הגולמיות. אנחנו מתאימים את הקפיצה של ההיסטוגרמה כך שתתאים לתוך העקומה.לאחר מכן, אנו מתקנים את חפץ התקשות הקרן. אז נתאים את חפץ החלקה. לבסוף, אנו מתקנים להפחתת חפץ הטבעת.אחרי כל התיקונים, אישרנו שהדגימות שלנו מתאימות לאזור העניין שלנו. אז נוכל להתחיל בשחזור. אנו משתמשים בתוכנת DataViewer כדי לדמיין את התמונות המשוחזרות בכל שלושת השדות.לניתוח, נעשה שימוש בתוכנת CTAn. התמונות המשוחזרות נטענות לתוכנה. העצב האופטי שימש כדי לדון באזור העניין לניתוח.לפי חישוב, השתמשנו בפרוסה האמצעית של אזור העניין כדי לבצע את כל המדידות לניתוח. שלוש מדידות חוזרות ונשנות נלקחו כדי לחשב את המדידה ליניארית של האזור. המדידות הבאות נלקחו עבור רקמות העין, הרשתית, RPE, choroid, ו שלנו מיקרו CT ניתוח הראה כי האזורים חתך רוחב של רשתית, RPE, שכבת choroid היו נמוכים באופן משמעותי דגימות טיסה בחלל בהשוואה לפקדי הקרקע.מיקרו-CT מספקת טכניקות יעילות ולא הרסניות לחישוב גודל השינויים ללא כל מניפולציה. באמצעות סוכן ניגודיות, זה לשפר את האיכות של תמונות מיקרו-CT, אשר מסייעים לנו לקבל תמונה גרפית ברורה מוצלחת של השחזור ללא מבנה הבין של הדגימה. בנוסף, הוא מראה בנתונים המקוריים הוא דיגיטלי, ובכך להגדיל את הנגישות ואת הרבייה של הממצאים.יתר על כן, מטרה בסיסית, מקובל להשתמש במדידות תלת מימדיות, אבל פילוח של המבנה התלת מימדי ברוטו יכול להיות מועיל כדי לספק מתאר ספציפי של הדגימה כולה. התוצאות שלנו מצביעות על כך שתנאי טיסה בחלל, במיוחד שינויים כבידתיים, עלולים לגרום לתגובה חריפה וקצרת טווח בעין. יתר על כן, עבודה עתידית צריכה להשתמש בנתונים נפחיים כדי לבצע ניתוחים אחרים המנצלים את יכולות הדמיה מיקרו-CT, שכן הוא שימש בהצלחה לחקר רקמות נורמליות ופתולוגיות רבות.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography (Micro-CT) Imaging Method

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene Expression גלובל ניתוח באמצעות פלטפורמה דג הזברה microarray oligonucleotide

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

שימוש ברזולוציה גבוהה טומוגרפיה ממוחשבת כדי להמחיש את המבנה התל ממדים ופונקציה של הצמח vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

מדריך מקטעים, קורינג ועיבוד תמונה לרכש וניתוח מדגם עצם קליפת המוח בעל תפוקה גבוהה עבור מיקרו-CT של Synchrotron

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

אסטרטגיות לאופטימיזציה של רכישת נתונים טומוגרפיה אלקטרוגנית

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...