Name: assessment of global ocular structure following spaceflight using a micro-computed tomography (micro-ct) imaging method
Uploaded: 2020-10-27T13:00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography Micro-CT Imaging Method at JoVE.com

Denne studien ble støttet av NASA Space Biology grant # NNX15AB41G og LLU Department of Basic Sciences. Sungshin Choi, Dennis Leveson og Rebecca Klotz bidro betydelig til suksessen til vår romferdsstudie, og vi setter stor pris på deres støtte. Forfatterne vil også takke hele NASA Biospecimen Sharing Program-gruppen for deres store hjelp.
Forfatterne vil også takke Center for Dental Research for Micro-CT-tjenesten.

Studien fulgte anbefalingene som er skissert i Guide for care and use of Laboratory Animals ved National Institutes of Health (NIH) og ble godkjent av både Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) av Loma Linda University (LLU) og The National Aeronautics and Space Administration (NASA). Mer detaljert informasjon om dette flyeksperimentet finner duandre steder 9,15.
1. Fly- og kontrollforhold
MERK: En 12th Commercial Resupply Service (CRS-12) nyttelast ble lansert av SpaceX på Kennedy Space Center (KSC) på et 35-dagers oppdrag i august 2017 som inkluderte ombord 10 uker gamle mannlige C57BL / 6 mus (n = 20) for NASAs niende Rodent Research eksperiment (RR-9).
<ol><li>Før de vender tilbake til jorden via SpaceX's Dragon kapsel, har musene lever i NASAs Rodent Habitats (RH) ombord ISS i 35 dager ved en omgivelsestemperatur på 26-28 ° C med en 12-timers lys / mørk syklus gjennom hele flyturen.</li>
	<li>Plasser Ground Control (GC) mus i samme husmaskinvare som brukes i flukt, og match miljøparametere som temperatur- og karbondioksid (CO2)nivåer så nært som mulig basert på telemetridata.</li>
	<li>Mate GC mus samme NASA mat bar diett som sine plassbaserte kolleger. Gi både romferds- og GC-musene samme ad libitum tilgang til vann og mat.</li>
</ol>2. Evaluering av musene etter flyturen
<ol><li>Innen 28 timer etter splashdown på jorden, transportere musene til Loma Linda University (LLU). Når du er der, fjern musene fra dyreinnhegningsmaskinvaren og vurder for overlevelse og helse. MERK: Ved observasjon rapporterte inspiserende personell at alle musene hadde overlevd 35-dagers romferd og var i god stand, det vil si ingen merkbare mangler / abnormiteter.</li>
</ol>3. Dissekering og bevaring av museøyne etter romferd
<ol><li>Innen 38 (±4) timer etter splashdown (n = 20 / gruppe), euthanize musene i 100% CO2 og samle øynene.</li>
	<li>Dissekere høyre øye netthinnen og plasser individuelt i sterile kryovialer, snap-fryse i flytende nitrogen, og hold ved -80 °C før bruk.</li>
	<li>Fest hele venstre øyne i 4% paraformaldehyd i fosfatbufret saltvann (PBS) i 24 timer og skyll deretter med fosfatbufret saltvann (PBS) for mikro-CT-analyser.</li>
</ol>4. Prøveforberedelse for mikro-CT-skanning
<ol><li>Etter fiksering dehydrerer musenes øyne i etanol. For å hindre ytterligere eller brå krymping av den faste prøven, bruk en gradert serie etanolløsninger: begynner med 50% etanol i 1 time og deretter øke konsentrasjonene av etanolløsningene som følger i 1 time hver: 70, 80, 90, 96 og 100%. MERK: Musenes øyne må håndteres i et hettekammer.</li>
	<li>Fosfafarsyre (PMA) farging FORSIKTIG: På grunn av at PMA er etsende, kreftfremkallende og giftig for organer, er egnet verneutstyr nødvendig, inkludert bruk av en røykhette.<ol>
<li>Klargjør fargeoppløsningen: 10 mg PMA i 100 ml absolutt etanol.</li>
		<li>Flekk musenes øyne (10 wt. % fosfafarsyre - PMA oppløst i absolutt etanol) i 6 dager.</li>
		<li>Før skanning, først vaske øyeprøvene i absolutt etanol og deretter plassere hvert øye i individuelle 2 ml plastbeholdere som er fylt med 100% absolutt etanol. Legg til en bomullsdott til stabiliserte prøver under skanning.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Micro-CT skanning og analyse
MERK: SkyScan 1272-skanneren, et stasjonært røntgenmikro-CT-system, ble brukt til evaluering av retinal skade i musenes øyne
<ol><li>Monter bløtvevsprøven på en passende prøveholder. For å unngå bevegelse under CT-målingene for røntgen, sørg for en tett tilpasning av prøven på holderen (figur 1).</li>
	<li>Ved omhyggelig justering av hver prøve, individuelt skanne prøven via røntgenstråler.<ol>
<li>Når du har åpnet programvaren, midtstill prøven i rammen. I protokollen bruker du ikke noe filter og angir matrisen for å øke pikselen ved 4 μm. Bruk mikroposisjonering for å holde prøven på rammen.</li>
		<li>Deretter kontrollerer du parameteren for å maksimere kontrastagenten. Hvis du vil utføre kalibreringen, fjerner du prøven og kontrollerer at flatfeltkorrigeringen er større enn 80 %.</li>
		<li>Etter kalibreringen setter du prøven inn i skannekammeret igjen. For skanning, bruk et rotasjonstrinn på 0,400, et rammesnitt på 4, en tilfeldig bevegelse på 30, og roter prøvene 180°.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bruk en posisjoneringsjigg for gjentatte målinger. På grunn av fasekontrastforbedring utført som beskrevet, kan objektdetaljer så små som 4 μm oppdages fra røntgenstråler generert av et forseglet mikrofokus røntgenrør (wolframanode) ved 50 keV og 80 mA med en integrasjonstid på 90 minutter. MERK: Anskaffelsesparametrene som er lagt ut i denne delen for valg for å produsere oversikt ct-skanninger med høyest bildekvalitet.</li>
	<li>Etter skanning bruker du programvare (f.eks. NRecon) til å rekonstruere dataene.<ol>
<li>Juster histogrammet og bruk samme område (0 – 0,24) for alle prøvene. Rekonstrueringsområde var en sirkel, og ingen skalaer eller etiketter ble brukt.</li>
		<li>For å redusere artefakter under skanningen, bruk en stråleherdingskorreksjon på 20, en utjevningskorreksjon på 1, en ringartefaktreduksjon på 6, og utfører ingen endring i feiljusteringskompensasjonen. Etter gjenoppbygging ble det bekreftet at prøven var innenfor interesseområdet.</li>
		<li>Omplasser bilder ved hjelp av et plan parallelt med synsnerven og linsen i øynene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etter skanning bruker du programvare (f.eks. DataViewer) til å visualisere de rekonstruerte bildene i alle tre visningene. MERK: Med denne programvaren kan bildene omplasseringes ved hjelp av et plan parallelt med synsnerven og linsen i øynene for å utføre en standardisert analyse.</li>
	<li>Beskrivende analyse<ol>
<li>Mål strukturene ved hjelp av et måleverktøy i programvaren (f.eks. Bruk den optiske nerven til å avgrense interesseområdet for analyse. Ved beregning brukte protokollen den midterste sektoren til å utføre målingene. Denne evalueringen ble utført ved beskrivende analyse (figur 2 og figur 3).</li>
		<li>Utfør målinger av netthinnen, retinal pigment epitel (RPE), choroid og sclera lag i sagittal (figur 2) og aksial visning (figur 3). Ta tre målinger av hver struktur for å beregne et gjennomsnitt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dawson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+New+Space+Race.">The New Space Race.</a> The Politics and Perils of Space Exploration. , 1-24 (2017).</li><li>Mao, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+environment+induces+mitochondrial+oxidative+damage+in+ocular+tissue.">Spaceflight environment induces mitochondrial oxidative damage in ocular tissue.</a> Radiation Research. 180, 340-350 (2013).</li><li>Overbey, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+Exposed+to+Combined+Chronic+Low-Dose+Irradiation+and+Modeled+Microgravity+Develop+Long-Term+Neurological+Sequelae.">Mice Exposed to Combined Chronic Low-Dose Irradiation and Modeled Microgravity Develop Long-Term Neurological Sequelae.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4094 (2019).</li><li>Nelson, E. S., Mulugeta, L., Myers, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgravity-induced+fluid+shift+and+ophthalmic+changes.">Microgravity-induced fluid shift and ophthalmic changes.</a> Life. 4, 621-665 (2014).</li><li>Lee, A. G., Mader, T. H., Robert Gibson, C., Brunstetter, T. J., Tarver, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space+flight-associated+neuro-ocular+syndrome+(SANS).">Space flight-associated neuro-ocular syndrome (SANS).</a> Eye. 32, 1164-1167 (2018).</li><li>Stenger, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Evidence Report: Risk of Spaceflight Associated Neuro-ocular Syndrome (SANS). , (2017).</li><li>Garrett-Bakelman, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NASA+Twins+Study:+A+multidimensional+analysis+of+a+year-long+human+spaceflight.">The NASA Twins Study: A multidimensional analysis of a year-long human spaceflight.</a> Science. 364, (2019).</li><li>Mader, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+disc+edema,+globe+flattening,+choroidal+folds,+and+hyperopic+shifts+observed+in+astronauts+after+long+duration+space+flight.">Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after long duration space flight.</a> Ophthalmology. 118, 2058-2069 (2011).</li><li>Mao, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+ocular+response+to+a+35-day+spaceflight+mission:+Evidence+of+blood-retinal+barrier+disruption+and+ocular+adaptations.">Characterization of mouse ocular response to a 35-day spaceflight mission: Evidence of blood-retinal barrier disruption and ocular adaptations.</a> Science Reports. 9 (1), 8215 (2019).</li><li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+developmental+biology:+a+versatile+tool+for+high-contrast+3D+imaging+at+histological+resolutions.">MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions.</a> Developmental Dynamics. , 632-640 (2009).</li><li>Silva, J. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+non-destructive+soft-tissue+visualization+with+X-ray+staining+micro-tomography.">Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography.</a> Science Reports. 5, 14088 (2015).</li><li>Descamps, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+tissue+discrimination+with+contrast+agents+using+micro-CT+scanning.">Soft tissue discrimination with contrast agents using micro-CT scanning.</a> Belgian Journal of Zoology. , 20-40 (2014).</li><li>Wu, J., Yin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+research+of+nasolabial+muscle+structure+in+fetus+with+cleft+lip:+an+iodine+staining+technique+based+on+microcomputed+tomography.">Anatomy research of nasolabial muscle structure in fetus with cleft lip: an iodine staining technique based on microcomputed tomography.</a> Journal of Craniofacial Surgery. 25 (3), 1056-1061 (2014).</li><li>Roque-Torres, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application of Micro-CT in Soft Tissue Specimen Imaging. In: Orhan K. (eds) Micro-computed Tomography (micro-CT) in Medicine and Engineering. , 139-170 (2020).</li><li>Overbey, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+influences+gene+expression,+photoreceptor+integrity,+and+oxidative+stress-related+damage+in+the+murine+retina.">Spaceflight influences gene expression, photoreceptor integrity, and oxidative stress-related damage in the murine retina.</a> Science Reports. 9 (1), 13304 (2019).</li><li>Elkhoury, J. E., Shankar, R., Ramakrishnan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+and+Limitations+of+X-Ray+Micro-CT+with+Applications+to+Sandstones+and+Limestones.">Resolution and Limitations of X-Ray Micro-CT with Applications to Sandstones and Limestones.</a> Transport in Porous Media. 129, 413-425 (2019).</li><li>Sombke, A., Lipke, E., Michalik, P., Uhl, G., Harzsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+limitations+of+X-Ray+micro-computed+tomography+in+arthropod+neuroanatomy:+A+methodological+and+comparative+survey.">Potential and limitations of X-Ray micro-computed tomography in arthropod neuroanatomy: A methodological and comparative survey.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (8), 1281-1295 (2015).</li><li>Huang, A. S., Stenger, M. B., Macias, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravitational+Influence+on+Intraocular+Pressure:+Implications+for+Spaceflight+and+Disease.">Gravitational Influence on Intraocular Pressure: Implications for Spaceflight and Disease.</a> Journal of Glaucoma. 28 (8), 756-764 (2019).</li><li>Lee, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spaceflight+associated+neuro-ocular+syndrome+(SANS)+and+the+neuro-ophthalmologic+effects+of+microgravity:+a+review+and+an+update.">Spaceflight associated neuro-ocular syndrome (SANS) and the neuro-ophthalmologic effects of microgravity: a review and an update.</a> NPJ Microgravity. 6, 7 (2020).</li></ol>

Alle forfattere har ingenting å avsløre.

Resultatene av denne studien viste at det var strukturelle endringer i romferdmuseøyet ved hjelp av mikro-CT-teknikken sammenlignet med GC-grupper, spesielt av netthinnen, RPE og choroidlagene i øyet, noe som fremgår av deres reduserte tykkelse. Micro-CT gir en effektiv og ikke-destruktiv teknikk for å karakterisere endringene uten behov for manipulasjon. Bruken av PMA-farging forbedret kvaliteten på mikro-CT-bildene for å kunne oppnå klare 3D-tomografiske bilder etter rekonstruksjon, og forutsagt ethvert behov for å fysisk endre strukturen på prøven. En ekstra fordel med disse bildene er at de viser hele interesseområdet digitalt, og dermed øker tilgjengeligheten samt reproduserbarheten av funnene. Gjennom mikro-CT-bildene som ble produsert i løpet av denne studien, viste den målrettede prøven differensiering av flere strukturer som netthinnen, RPE, choroid og sclera-laget for bestemmelse av tykkelsen på hvert lag.
Et kritisk skritt i protokollen er manipulering av prøvene på grunn av deres størrelse og tekstur. Håndteringen av prøven må gjøres nøye uten å legge press på prøven under tilberedningen. Mikro-CT har noen begrensninger: oppløsning og mangel på standardiserte verdier for parametrene. Under skanningen kan de forskjellige mikro-CT-skannerne ha ulike bildebehandlingsalgoritmer; men kalibrering for en gråtoner kan forfølges for å overvinne ethvert problem. Etter skanning bør rekonstruksjon av bildene være basert på vevet og analysen som skal utføres. Det kan være kritisk siden bildekvaliteten avhenger av det tomografiske systemet, innstillingene, prøvestørrelsen samt tilberedningsmetodene16,,17.
På grunn av sin vellykkede anvendelse i å studere flere typer normale og patologiske vev, bør mikro-CT-bildebehandlingsevner brukes i fremtidig forskning for å kompilere volumetriske data for andre analyser. Basert på den nåværende studiens formål, var det derfor akseptabelt å bruke todimensjonale målinger, men segmentering av brutto 3D-strukturen kan også være gunstig for å gi en nøyaktig oversikt over hele prøven. Selv med alle fordelene med en ikke-destruktiv teknikk, vil mikro-CT ikke erstatte andre metoder som immunohistochemistry, men vil supplere og tillate etterfølgende histologianalyser hvis ønskelig.
En langvarig romferdstilstand produserer en rekke strukturelle og funksjonelle okulære endringer i astronautene under og etter romferden definert som SANS. Funnene inkluderer hyperopiske skift, globusflating, koroide/ retinale folder og bomullsullflekker19. I motsetning til astronautenes optiske sammenhengtomografi (OCT) funn av retinal nervefiber lag fortykning, ble tynning av netthinnen og koroidelaget dokumentert i denne dyremikro-CT-studien. Disse resultatene var uventede. Denne avviket kan skyldes forvirrende faktorer. Mus har begrenset cephalad væskeskift sammenlignet med mennesker. Denne mangelen på væskeskift kan ha fremkalt forskjellige reaksjoner på gravitasjonsendringer. For det andre ble mus dissekert innen 38 timer etter splashdown, og en akutt respons for re-tilpasning kan også bidra til morfologiske endringer i netthinnen og choroid. Bekreftelse av denne muligheten krever ytterligere målinger under romferd og på lang sikt etter oppdraget.
Resultatene av denne studien indikerer at romflyforhold, spesielt gravitasjonsendringer, kan indusere en akutt og kortsiktig respons i øyet. Videre undersøkelser er nødvendig for å bestemme konsekvensene av de akutte endringene på okulær på retinal funksjon og mekanisme for romferd-indusert strukturendringer.

I mikrogravitasjonsmiljøet til romferd kan økt intrakranielt trykk (ICP) forårsaket av væskeskift ha bidratt til romferds-assosiert nevrookulært syndrom (SANS)1,2,3,4,5. Faktisk har over 40% av astronautene opplevd SANS under og etter en internasjonal romstasjon (ISS)oppdrag 6, inkludert romferdsemne i NASA Twins Study7. Den nåværende patofysiologien til SANS inkluderer fysiologiske endringer som optisk skiveødem, globusflating, koroide og netthinnefolder, hyperopisk brytningsfeilskift og nervefiberlag infarkter (det vil vil vil at bomullsullflekker) og er godt dokumentert5,8. De underliggende mekanismene for endringene og faktorene som bidrar til utviklingen av skade er imidlertid uklare. For å få en bedre forståelse av SANS, er dyremodeller tilgjengelige for å karakterisere romfly-tilknyttede endringer i retinal struktur og funksjon.
I en tidligere undersøkelse om de samme dyrene rapporterte vi virkningen av 35 dager med romferd på musens netthinnen. Resultatene belyser at romferd induserer betydelig skade i netthinnen og netthinnens vaskulatur, og noen proteiner/veier forbundet med celledød, betennelse og metabolsk stress ble betydelig endret etterromferd 9.
For tiden finnes det en rekke ikke-invasive bildeteknikker etablert for å overvåke sykdomsutvikling og progresjon, samt fysiologiske reaksjoner på ulike miljøstressorer, som også er mye brukt i små gnagermodeller. En av disse teknikkene er mikro-CT, som evaluerer anatomiske strukturer og patologiske prosesser, og har med hell blitt brukt på organismer så små som mus10.
Micro-CT kan oppnå en mikrosized oppløsning, og det kan gi høy kontrast for volumetrisk analyse av bløtvev med tillegg av riktig kontrastmiddel10,11,12,13,14. Micro-CT-teknologi er en fordel sammenlignet med tradisjonelle metoder som grov anatomi, lett mikroskopi og histologiundersøkelse, da det minimerer fysisk skade på den geometriske profilen til prøvene og endrer ikke det romlige forholdet mellom strukturer. I tillegg kan tredimensjonale (3D) modeller av strukturer rekonstrueres fra mikro-CT-bilder12,,14. Til dags dato, til tross for bevis som viser synshemming etter eksponering for rommiljøet, er det få data i dyremodeller tilgjengelig for en bedre forståelse av romflyvningsrelaterte endringer i retinal struktur og funksjon. I den nåværende studien ble mus fløyet på et 35-dagers oppdrag ombord på ISS for å bestemme virkningen av romferdsmiljøet på okulære vevsstrukturer ved å kvantifisere mikrostrukturen i netthinnen, RPE og choroidlagene ved hjelp av mikro-CT.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 wt. % phosphomolybdic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12026-57-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute by Baker Analyzed</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80252500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global ocular structure following spaceflight using a micro-computed tomography (micro-ct) imaging method

Rapporter viser at langvarig eksponering for et romferdsmiljø produserer morfologiske og funksjonelle oftalmiske endringer i astronauter under og etter et internasjonalt romstasjonsoppdrag (ISS). De underliggende mekanismene for disse romflyvningsinduserte endringene er imidlertid foreløpig ukjente. Formålet med den nåværende studien var å bestemme virkningen av romferdsmiljøet på okulære strukturer ved å evaluere tykkelsen på musehinnen, retinal pigmentepitelet (RPE), choroid og sclera-laget ved hjelp av mikro-CT-avbildning. Ti uker gamle C57BL/6 hannmus ble plassert om bord på ISS for et 35-dagers oppdrag og deretter returnert til jorden i live for vevsanalyse. Til sammenligning ble bakkekontrollmus (GC) på jorden opprettholdt under identiske miljøforhold og maskinvare. Okulære vevsprøver ble samlet inn for mikro-CT-analyse innen 38 (±4) timer etter sprut. Bildene av tverrsnittet av netthinnen, RPE, choroid, og sclera laget av det faste øyet ble registrert i en aksial og sagittal visning ved hjelp av en mikro-CT imaging oppkjøpsmetode. Micro-CT-analysen viste at tverrsnittsområdene i netthinnen, RPE og choroid lagtykkelsen ble endret i romferdsprøver sammenlignet med GC, med romferdsprøver som viser betydelig tynnere tverrsnitt og lag sammenlignet med kontroller. Funnene fra denne studien indikerer at mikro-CT evaluering er en følsom og pålitelig metode for å karakterisere okulære strukturendringer. Disse resultatene forventes å forbedre forståelsen av virkningen av miljøstress på globale okulære strukturer.

Gjennomsnittlig tykkelse på netthinnen, RPE, choroid og sclera laget ble registrert ved hjelp av mikro-CT skanner etter å ha fulgt protokollen ovenfor (Figur 1). Teknikken viste en multiplanar rekonstruksjon av øynene i tre forskjellige visninger. Under analysen var observatøren i stand til å bla gjennom hele prøven for å standardisere analysen midt i prøven.
Mikro-CT-analysen viste tverrsnittsområdene av øynene i sagittal- og aksialvisningen (figur 2 og figur 3) der ble utført de lineære målingene. RPE og choroid laget var betydelig eller trend lavere i romferd gruppen sammenlignet med GC-gruppen (figur 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig01v2.jpg"> Figur 1: Mikro-CT prosedyre av bløtvev. (A)Bløtvevsprøve (museøye). (B) Prøvene ble fastsatt i 4 % formaldehyd i fosfatbufferløsning (PBS). Etter fiksering ble musenes øyne dehydrert i etanol. For å forhindre en ytterligere og brå krymping av den faste prøven, ble det brukt en gradert serie av etanolløsninger, som begynte med 50% etanol i 1 time og følgende etanolløsninger i konsentrasjonene som er oppført, i 1 time hver: 70, 80, 90, 96 og 100%. (C)Musenes øyne ble farget i fosfafatlybdic acid (PMA) i 6 dager, vasket i absolutt etanol og deretter plassert i individuelle 2 ml plastbeholdere fylt med absolutt etanol. (D)En stasjonær røntgen mikro-CT system skanner ble brukt til å evaluere retinal skade i mus øyne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig02.jpg"> Figur 2: Skyttens syn på en bakkekontrollmus. Lag av øyet på høyre side av bildet er kommentert, fra topp til bunn, retina (0,077 mm), retina pigment lag (RPE, 0,038 mm), choroid (0,041 mm), sclera (0,059 mm). Dette tallet er hentet fra Overbey et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig03.jpg"> Figur 3: Aksial visning av en jordkontrollmus. Lag av øyet på høyre side av bildet er kommentert, fra topp til bunn, retina (0,144 mm), retina pigment lag (RPE, 0,051 mm), choroid (0,041 mm), sclera (0,073 mm). Dette tallet er hentet fra Overbey et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61227/61227fig04.jpg"> Figur 4: Gjennomsnittlig tykkelse på netthinnen, RPE-laget og choroidlaget målt ved mikro-CT i romferds- og kontrollgruppene. Antallet ble i gjennomsnitt over fem netthinnen per gruppe. Verdiene ble representert som gjennomsnittlig tykkelse ± standardfeil (SEM). SEM av gjennomsnittet er merket med feilfelt. Signifikant lavere i tverrsnittstykkelsen i romferdsgruppen (FLT) sammenlignet med gc-gruppen (ground control) er merket '*' (p < 0,05). Dette tallet er hentet fra Overbey et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61227/61227fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography Micro-CT Imaging Method at JoVE.com

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography Micro-CT Imaging Method

Vi presenterer en protokoll ved hjelp av høyoppløselig mikro-computertomografiavbildning for å avgjøre om romferd indusert skade på okulære strukturer. Protokollen viser mikro-CT-avledet måling av ex vivo gnager okulære strukturer. Vi viser evnen til å vurdere okulære morfologiske endringer etter romferd ved hjelp av en ikke-destruktiv tridimensjonal teknikk for å evaluere okulær skade.

Vurdering av global okulær struktur etter romferd ved hjelp av en mikro-computertomografi (Micro-CT) bildemetode

Reports show that prolonged exposure to a spaceflight environment produces morphologic and functional ophthalmic changes in astronauts during and after an ...

Her foreslår vi en metode for vurdering av global okulær struktur etter romferd ved hjelp av mikro-datatomografi bildemetode. Romferdsmiljøet, som inkluderer paragravitasjon og strålingseksponering, forårsaker unike endringer i menneskelig fysiologi, inkludert væskeskift. Disse væskeskiftene fører til forhøyet intrakranielt trykk og har blitt tilskrevet som en viktig årsak til romferd assosiert nevrookulært syndrom.Den fysiologiske virkningen av SANS påvirker flere komponenter i øyet og inkluderer optisk skiveødem, globusflating, koroidale og retinale folder, hyperopiske og brytningsdraktive feilskift, og nervefiberlagfracts. Mens de fysiologiske egenskapene til SANS er godt dokumentert, er mekanismene som driver SANS fortsatt dårlig forstått. For å få en bedre forståelse av SANS, brukes gnagermodeller til ikke-invasive bildeteknikker.En av disse teknikkene er mikro-CT, som har blitt brukt til evaluering av anatomiske strukturer og patologiske prosesser hos dyr så små som mus. Micro-CT kan oppnå en mikrostørrelse oppløsning, og gjennom kombinasjonen med et kontrastmiddel, kan det gi en god kontrast for det myke vevet. Micro-CT gir en klar fordel i forhold til tradisjonelle metoder, inkludert grov anatomi, lett mikroskopi og histologi undersøkelse for å ikke forårsake skade på den geometriske profilen til prøvene og de romlige forholdene mellom strukturene.I vår nåværende studie ble mus utsatt for rommiljøet i 35 dager om bord på den internasjonale romstasjonen for å avgjøre om rommiljøet induserer okulær skade ved å kvantifisere mikrostrukturen til netthinnen, RPE og choroidlag ved hjelp av Micro-CT. Her har vi demonstrert hvordan vi har utarbeidet prøver for Micro-CT-analyse. Mus ble brukt og øyne innen 38 pluss eller minus fire timer etter sprut ned.Øynene ble enucleated, og venstre øyne ble festet i fire prosent paraformaldehyd og fosfat buffere saltvann i 24 timer. Etter fiksering ble øynene dehydrert i etanol. For å forhindre en ytterligere og brå krymping av den faste prøven, ble det brukt en gradert serie etanoiske løsninger.Først ble prøvene overført til 50% etanol i en time og deretter øke konsentrasjonene i en time hver, 70, 80, 90, 96 og 100%Etterpå ble øynene farget med 10% vekt per volum fosfolipdsyre i seks dager. Til slutt ble prøvene vasket i absolutt etanol og deretter plassert i individuelle to mølleplastbeholdere fylt med absolutt etanol for skanning. En bomullsdott ble også lagt til for å stabilisere prøven under skanning.Deretter ble prøven plassert inne i et skrivebords røntgen Micro-CT-system SkyScan 1272-skanner for å evaluere retinalskaden. For skanning brukte vi SkyScan 1272-programvaren. Etter å ha åpnet programvaren, sentrerte vi prøven vår i rammen.I vår protokoll bruker vi ikke noe filter og angir matrisen for å øke pikselstørrelsen til fire mikron. Mikroposisjonering brukes til å holde prøven sentrert i rammen. Deretter kontrollerer vi parametrene for å maksimere kontrastmiddelet i prøven vår og for å kalibrere maskinen.For å utføre kalibreringen fjerner vi prøven fra skanneren, og vi angir skanneparametrene. Under kalibreringen kontrolleres også en flatfylt korreksjon. Det bør være større enn 80%Etter kalibreringer settes prøven inn i skannekammeret igjen.Før skanning kalles eksempelfilene. Skanneparametere er som følger, rotasjonstrinn 0,4, rammer fire, tilfeldig bevegelse 30, dobbeltsjekk at pikselstørrelsen er satt til 4 mikron. Deretter startes skanningen.Etter skanning brukes NRecon til å rekonstruere prøven. Først åpner vi filene fra skanningen og viser de rå skannebildene. Vi justerer sprett av histogrammet slik at det passer innenfor kurven.Deretter korrigerer vi for stråleherdingsartefakt. Deretter justerer vi utjevningartefakten. Til slutt korrigerer vi for reduksjon av ringartefakter.Etter alle rettelsene bekreftet vi at våre prøver passer inn i vår interesseregion. Da kan vi starte gjenoppbyggingen. Vi bruker DataViewer-programvaren til å visualisere de rekonstruerte bildene i alle tre feltene.For analyse brukes CTAn-programvaren. De rekonstruerte bildene lastes inn i programvaren. Den optiske nerven ble brukt til å deliminere interesseregionen for analyse.Ved beregning brukte vi den midterste delen av interesseområdet til å utføre alle målingene for analyse. Tre gjentatte målinger ble tatt for å beregne den lineære målingen av området. Følgende målinger ble tatt for okulært vev, netthinnen, RPE, choroid og vår Micro-CT-analyse viste at tverrsnittsområdene i netthinnen, RPE og choroidlaget var betydelig lavere i romferdsprøver sammenlignet med bakkekontroller.Micro-CT gir en effektiv og ikke-destruktiv teknikk for å beregne størrelsen på endringer uten manipulasjon. Ved å bruke kontrastmiddel, forbedrer det kvaliteten på Micro-CT-bilder, noe som hjelper oss med å få vellykket klart grafisk bilde av rekonstruksjonen uten interstrukturen til prøven. I tillegg viser det i de opprinnelige dataene er digitalt, og dermed øke i tilgjengelighet og reproduserbarhet av funnene.Videre, grunnleggende formål, er det akseptabelt å bruke tredimensjonale målinger, men segmentering av brutto tredimensjonal struktur kan være gunstig å gi spesifikk omriss av hele prøven. Våre resultater indikerer at romferdsforhold, spesielt gravitasjonsendringer, kan indusere akutt og kortsiktig respons i øyet. Videre bør fremtidig arbeid bruke volumetriske data til å utføre andre analyser som drar nytte av Micro-CT-bildefunksjonene, siden det har blitt brukt med hell for å studere mange normale og patologiske vev.

Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography (Micro-CT) Imaging Method

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

En enkel metode for Imaging Arabidopsis Gir hjelp Perfluorodecalin som et infiltrerende Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Konvertering av en Capture ELISA til en Luminex xMAP Assay bruker en Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

Ved hjelp av høyoppløselig CT for å visualisere tredimensjonale struktur og funksjon Plant vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

The Slice Kultur Metode for følgende utvikling av Tooth Germs I Eksplantering Kultur

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse av global RNA syntese på celle-nivå etter Hypoksi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering av nukleinsyrer: En enkel og Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

En snittings-, kordings- og bildebehandlingsveiledning for kortikale beinprøveinnkjøp og -analyse for Synchrotron Micro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Strategier for optimalisering av kryogene elektrontomografidatainnhenting

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

Vurdering av global DNA Double-Strand End Resection ved hjelp av BrdU-DNA-merking kombinert med cell cycle diskriminering imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...