Name: longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber
Uploaded: 2020-06-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af det svenske forskningsråd, Det Strategiske Forskningsområde Exodiab, Dnr 2009-1039, Den Svenske Fond for Strategisk Forskning Dnr IRC15-0067 til LUDC-IRC, Royal Physiographic Society i Lund, Diabetesförbundet og Barnbetesförbundet.

Den regionale etiske komité i Lund, Sverige, godkendte undersøgelsen i henhold til loven om etisk gennemgang af forskning, der involverer mennesker. Dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med den svenske etik af dyreforsøg og godkendt af de etiske komitéer i Malmø og Lund. 6 til 8 uger gamle immundefficient NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-tomat. Rag2-/-) modtagermus blev brugt som modtagere til transplantation af m...

<ol>
	<li>Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus:+The+epidemic+of+the+century.">Diabetes mellitus: The epidemic of the century.</a> World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).</li><li>Kanak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+response+in+islet+transplantation.">Inflammatory response in islet transplantation.</a> International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).</li><li>Nanji, S. A., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pancreatic+islet+transplantation+in+humans.">Advances in pancreatic islet transplantation in humans.</a> Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).</li><li>Malaisse, W. J., Maedler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+the+beta+cells+of+the+islets+of+Langerhans.">Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).</li><li>Kim, D., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+of+Transplanted+Pancreatic+Islets.">In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Yang, S. N., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eye+as+a+novel+imaging+site+in+diabetes+research.">The eye as a novel imaging site in diabetes research.</a> Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).</li><li>Schmidt-Christensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamics+of+CD11c(+)+cells+and+Foxp3(+)+cells+in+progressive+autoimmune+insulitis+in+the+NOD+mouse+model+of+type+1+diabetes.">Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).</li><li>Berclaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+three-dimensional+visualisation+of+autoimmune+diabetes+by+functional+optical+coherence+imaging.">Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging.</a> Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).</li><li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+fibroblasts+reconstitute+the+peri-islet+membrane:+a+longitudinal+imaging+study+of+human+islet+grafting+and+revascularisation.">Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation.</a> Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).</li><li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , 11-24 (2013).</li><li>Goto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+the+automated+method+for+human+islet+isolation+and+presentation+of+a+closed+system+for+in+vitro+islet+culture.">Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture.</a> Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).</li><li>Jansson, L., Carlsson, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+vascular+function+after+transplantation+of+pancreatic+islets.">Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets.</a> Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).</li><li>Konstantinova, I., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+development:+learning+from+pancreatic+islets.">Microvascular development: learning from pancreatic islets.</a> Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).</li><li>Fransson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+support+endothelial+cell+interactions+in+an+intramuscular+islet+transplantation+model.">Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model.</a> Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).</li><li>Nyqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+islet+endothelial+cells+in+pancreatic+islet+revascularization.">Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization.</a> Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).</li><li>Nair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+common+anesthetics+on+eye+movement+and+electroretinogram.">Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram.</a> Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).</li><li>Iwasaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+intolerance+during+prolonged+sevoflurane+anaesthesia.">Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia.</a> Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).</li><li>Hamilton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+its+applications+in+fluorescent+microscopy+imaging.">Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging.</a> Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).</li><li>Michelotti, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET/MRI+enables+simultaneous+in+vivo+quantification+of+beta-cell+mass+and+function.">PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function.</a> Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Allogeneic+Islet+Grafts+in+Nonhuman+Primates+Using+MRI.">Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI.</a> Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).</li><li>Gotthardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+beta+cells+by+PET+imaging:+why+clinical+implementation+has+never+been+closer.">Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer.</a> Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).</li><li>Joosten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Pancreatic+beta+Cell+Mass+in+Vivo+with+Exendin+SPECT+during+Hyperglycemia+and+Severe+Insulitis.">Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis.</a> Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).</li><li>Virostko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+mouse+models+quantifies+beta+cell+mass+in+the+pancreas+and+after+islet+transplantation.">Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).</li></ol>

En metode præsenteres for at studere den menneskelige pancreas ø celle podning proces ved at observere inddragelse af modtager og donorvæv. Efter en minimal invasiv kirurgi implantering menneskelige holme i den forreste kammer af en immundefekt museøje, musen genopretter hurtigt inden for få minutter efter operationen. Proceduren udføres på det ene øje. Generelt, fra 5-7 dage efterimplantation og fremefter hornhinden er tilstrækkeligt helbredt til at udføre intravital billeddannelse.
<p class="jove_content"...

Diabetes mellitus beskriver en gruppe af metaboliske sygdomme karakteriseret ved forhøjede niveauer af blodsukker som følge af utilstrækkelig insulinproduktion fra tab eller dysfunktion af pancreas ø betaceller, ofte ledsaget af insulinresistens. Type 1 (T1D) og type 2 diabetes (T2D) er komplekse sygdomme, hvor den progressive dysfunktion af betaceller forårsager sygdomsudvikling. T1D er udfældet af en autoimmun angreb på beta-celler, mens T2D anses for at være drevet af metaboliske faktorer, om end med stigende tegn på lav kvalitet systemisk inflammation1. Transplantation af donor humane holme, især til T1D-patienter, giver mulighed for at give fysiologisk glykæmisk kontrol. Men en mangel på vævdonorer og dårlig ø-indskrivning har forhindret øtransplantation for at blive en almindelig terapeutisk mulighed. En betydelig del af den funktionelle øtransplantat går tabt i den umiddelbare posttransplantationsperiode (24-48 h) på grund af det hypoxiske, inflammatoriske, immungene værtsmiljø2,3. For at vurdere effektiviteten af interventionsmetoder til forbedring af øens overlevelse er det nødvendigt med løbende overvågning af sådanne transplantationer.
In vivo teknikker til at afbilde og spore skæbne transplanterede menneskelige pancreas øer efter transplantation stadig en udfordring for diabetes forskning4,5. Til dato viser ikke-invasive billeddannelsesteknikker, herunder positronemissionstomografi (PET), magnetisk resonansscanning (MR) eller ultralyd (US), potentiale for kvantificering og funktionel evaluering af transplanterede holme under forsøgsbetingelser5. I betragtning af de små østørrelser lider kvantitative målinger af disse modaliteter imidlertid under utilstrækkelig opløsning. Den forreste kammer i øjet (ACE) som en transplantation site for observation er en lovende noninvasive imaging løsning, der tilbyder effektivt højere rumlig opløsning og hyppig overvågning over lange perioder6. Denne metode er blevet udnyttet med succes til at studere museøde biologi (gennemgået i Yang et al.7),autoimmuneimmunrespons 8,samt humane ø podning9,10.
Her er ACE transplantation metode kombineret med en 2-foton billeddannelse tilgang til at undersøge dynamikken i den menneskelige pancreas ø indskrivning proces ved løbende og gentagne optagelser på individuelle øtransplantater i op til 10 måneder efter transplantation. De multifotograferingsegenskaber, der er ved større billeddiaddybder og reduceret samlet fotobleaching og fotoskade, overvinder billedbegrænsningerne ved konfokal mikroskopi11. Kvantificering af fluorescerende billeddannelse omfatter flere faser, herunder forberedelse af øprøve, øtransplantation, billederhvervelse, billedfiltrering for at fjerne østøj eller baggrund, segmentering, kvantificering og dataanalyse. Det mest udfordrende trin er normalt at opdele eller segmentere et billede i flere dele eller områder. Dette kan indebære adskillelse af signal fra baggrundsstøj eller klyngeområder af voxels baseret på ligheder i farve eller form for at detektere og mærke voxels af et 3D-volumen, der repræsenterer f.eks. Når de er segmenteret, er statistik, f.eks. Forudsat er en metode til kvantificering og udtrækning af billeddata, såsom segmentering og datavisualisering. Der lægges særlig vægt på fjernelse af autofluorescens i menneskelige holme og skelnen mellem øvaskulatur og økapsel, der danner recipientceller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8323001</td>
			<td>used for isofluran anasthesia during surgery and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-induction chamber 1.4 L</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8329002</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas routing switch</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8433005</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AngioSense 680 EX</td>
			<td>Percin Elmer</td>
			<td>NEV10054EX</td>
			<td>imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes assemblies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml</td>
			<td>Schering-Plough Europ&#233;</td>
			<td>64022</td>
			<td>fluid, for pain relief</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>321242C</td>
			<td>used together with Aspirator tubes assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Texas Red (TR), 70kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1830</td>
			<td>imaging agent for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cannula, blunt end , 25 G</td>
			<td>BVI Visitec/BD</td>
			<td>BD585107</td>
			<td>custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45&#8304;), tip tapered to 30 G (0.3mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81242</td>
			<td>Plunger type gas-tight syringe for islet injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Head holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-UST-2 Solid Universal Joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>UST-2</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-custom made metal plate for head-holder assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Dumont #5, straight</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>0207-5TI-PS or 0208-5-PS</td>
			<td>attached to UST-2 (custom made)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad, custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>taped to the stereotaxic platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human islet culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-CMRL 1066</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td>cell culture media for human islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HEPES</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-L-glutamin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Gentamycin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Fungizone</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ciproxfloxacin</td>
			<td>Bayer healthcare AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Imaris 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Aquisition software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>ZEN 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1010364937</td>
			<td>used to keep animals warm in the wake-up cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Isoflo</td>
			<td>Abott Scandinavia/Apotek</td>
			<td></td>
			<td>fluid, for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange</td>
			<td>BD</td>
			<td>10442204</td>
			<td>used as scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 90mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Photon/confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-LSM7 MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ti:Sapphire laser Tsunami</td>
			<td>Spectra-Physics, Mai Tai</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET710/40m (Angiosense 680)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>288003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET645/65m-2p (TR)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC528423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET525/50 (GFP)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET610/75 (tomato)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-main beam splitter T680lpxxr</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T680lpxxr</td>
			<td>Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)</td>
			<td>Smiths Medical Danmark</td>
			<td>800/100/120</td>
			<td>to connect with Hamilton syringe and eye canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Model SMZ645, for islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (Flourescence)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for islet graft imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ100 Multizoom</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>wide field and long distance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 1x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 4x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HG Manual New Intensilight</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block TEXAS RED</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>contains EX540-580, DM595 and BA600-660</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block G-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX510-560, DM575 and BA590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block B-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX450-490, DM505 and BA520)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1-ml, Omnitix</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>for Buprenorphine injection, used with 27 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber

Imaging betaceller er et vigtigt skridt i retning af at forstå ø-transplantation. Selv om forskellige billedplatforme til optagelse af betacellebiologi er blevet udviklet og udnyttet in vivo, er de begrænsede med hensyn til at tillade enkeltcelleopløsning og kontinuerlige indspilninger i længderetningen. På grund af gennemsigtigheden af hornhinden, den forreste kammer i øjet (ACE) i mus er velegnet til at studere mennesker og mus pancreas ø cellebiologi. Her er en beskrivelse af, hvordan denne fremgangsmåde kan bruges til at udføre kontinuerlige langsgående optagelser af podning og revaskularisering af de enkelte menneskelige øtransplantater. Humane øtransplantater indsættes i ACE ved hjælp af NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mus som modtagere. Dette giver mulighed for undersøgelse af udvidelsen af recipient versus donorceller og bidrag fra modtagerceller i at fremme indkapsling og vaskularisering af transplantatet. Endvidere skitseres en trinvis tilgang til billedanalyse og kvantificering af øvolumen eller segmenteret vaskulatur og økapsel, der danner recipientceller.

Ikke-mærkede menneskelige holme blev transplanteret ind i ACE af 8-ugers gamle kvindelige NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-tomat. Rag2−/−) modtagermus. For at forhindre afstødning af humant væv blev immundefetødere Rag2 knockoutmus valgt som modtagere. I disse transgene mus udtrykte alle celler og væv et membran målrettet tomatfluorescensprotein (mT), der muliggør klar identifikation af recipienten og donorvævet. Gentage...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Målet med denne protokol er løbende at overvåge dynamikken i den menneskelige pancreas ø-indskrivning proces og den bidragende vært versus donorceller. Dette opnås ved at transplantere menneskelige holme ind i forreste kammer i øjet (ACE) af en NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-musmodtager efterfulgt af gentagen 2-fotonbilledbilleder.

Langsgående i Vivo Imaging og kvantificering af humane pancreas ø Podning og bidragende værtsceller i forreste øjenkammer

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

ACE er en optimal billeddannelse seværdigheder. Det understøtter at gentage det i langsigtet in vivo imaging af ø-celler med henblik på at studere deres funktion og levedygtighed i en podning situation. Det kan også udvides til at undersøge andre aspekter under fysiologiske og patologiske forhold i realtid.Fordelen ved ACE-teknikken ligger i det faktum, at de samme individuelle menneskelige pancreas holme kan følges noninvasively med sub-cellulære opløsning i en længere periode. Succesraterne for betacelle substitutionsterapi fortsætte med at forbedre. Men, vurdere effektiviteten af ø podning og overlevelse in vivo, er stadig udfordrende.Denne metode kan hjælpe med at vurdere og optimere resultaterne af ø-transplantationer. Denne fremgangsmåde er ikke begrænset til pancreas øer alene. Det er også velegnet til at studere væv påvirket.For eksempel, i diabetiske komplikationer, ligesom nyre glomeruli eller lever stykker, bare for at nævne nogle få. Til at begynde placere musen på en varm varmepude placere den i hovedholderen og sat på næsemasken. Brug tommelfingeren og pegefingeren til at løfte hovedet en smule.Fastgør den med de metalliske stykker på siderne. Sørg for, at ørestykkerne fastgør hovedet direkte under ørerne. Subkutanet injicere buprenorphin opløsning i bagsiden af musen.Træk forsigtigt øjenlågene i øjet tilbage, så de kan transplanteres ved hjælp af stumpe scener. Pop øjet ud og løst ordne det med et par pincet dækket med en polyethylen rør. Efter overførsel af øjenlågene til en petriskål med PBS, afhentes ca. 20 til 30 holme i øjenhøjde.Ved hjælp af en 25 gauge nål niveau opad, forsigtigt indsætte spidsen i hornhinden og gøre en enkelt lateral snit. Løft forsigtigt hornhinden med kanylen forinstalleret med holme, og slip langsomt holmene i øjet. Langsomt trække kanylen og anvende øjet gel til øjet.Efter 10 minutter fjernes forr forcer, holder øjenlåget og sætter øjet tilbage til sin normale position. Til billeddannelse af implanterede menneskeøer med to fotonmikroskopi skal hovedholderplatformen være under mikroskopet og give øjengelen på øjet som en nedsænkningsvæske mellem hornhinden og linsen. Placer øjet under målsætningen, og billede de implanterede menneske holme som beskrevet i tekstmanuskriptet.Hvis du vil fjerne autofluorescensen, skal du gå til fanen Billedbehandling, vælge kanalaritmetik og skrive kanal et minus kanal to. Dette skaber en ny kanal fire. Omdøb det vaskulatur.Gentag denne proces, og skriv kanal tre minus kanal to for at oprette en ny kanal fem og omdøbe den til at tomat alle. Hvis du vil definere øen manuelt, skal du oprette en ny overflade og vælge rediger manuelt i guiden. Hold markøren i valgtilstand og i 3D-visning.Og klik på lydstyrke for at visualisere sektioner. Vælg kontur under tegningsfanen, og klik på Tegn for at begynde at tegne konturer rundt om økanten og begynde i udsnitsposition en. Flyt derefter til en ny udsnitsposition, og gentag tegningsprofiler.Afslut med det sidste udsnit øverst på øen og afslut ved at klikke på fanen Opret overflade. Næste segment, ø vaskulatur og ø tomat fluorescens ved hjælp af ømaske. Vælg det tidligere definerede objekt til objekt med objekt med objekt, gå til fanen Redigering, og klik på fanen masken alle, som åbner et nyt vindue.Vælg den beregnede kanal i rullemenuen kanalvalg, og aktivér indstillingerne for dubletkanal, før du anvender maske. Konstant inde, udenfor og sæt voxels udvendig overflade til 0,000, som skaber en ny kanal seks. Omdøb denne kanal ø vaskulatur.Gentag de foregående trin, og vælg tomaten i rullemenuen kanalvalg for at oprette den nye kanal, omdøbe den, ø-tomat. Opret derefter en ny overflade i scenemenuen, og vælg automatisk oprettelse i guiden. Indstil kildekanalen til den tidligere oprettede ø-vaskulatur, og vælg baggrundsindtraktion.Eventuelt bruge filtre. For eksempel vælge volumen og justere filteret i vinduet, som kan fjerne udvalgte serviceobjekter. Afslut guiden, og navnd navnet på det nye overfladeobjekt, øens vaskulatur.I lervaskemiddeltjenesteobjektet skal du gå til fanen Redigering og klikke på fanen Maske alle, som åbner et nyt vindue. Vælg tomatkanalen for tomat på øen i rullemenuen for kanalvalg, og indstil voxels's udvendige overflade til 10.000, hvilket opretter en ny kanal. Omdøb denne kanal ø tomat vaskulatur.At segment tomat kapsel fluorescerende signal vælge kanal aritmetik i billedbehandling fanen og type kanal syv minus kanal otte skabe den nye kanal. Omdøb den tomat kapsel. Opret en ny overflade som tidligere beskrevet og vælg kildekanaler, ø tomat vaskulatur eller tomat kapsel i guiden.Udfør derefter baggrunds subtraktion. Åbn filen bag sprøjt, og opret en ny overflade. Vælg automatisk oprettelse i guiden, og definer interesseområde.Hvis det er nødvendigt, skal du justere tærsklen i absolut intensitet. Overfladeobjektet kan klikkes til eller fra for at krydstjekke med tilsvarende kanalintensitet. Når guiden er færdig.Endelig skal du udføre kvantificering, vælge et oprettet overfladeobjekt i scenemenuen og gå til fanen Statistik. Hvis du vil hente detaljerede mængdedata, skal du vælge den detaljerede fane og vælge bestemte værdier og lydstyrke i rullemenuen. Hvis du vil hente den samlede volumenværdi, skal du gå til den detaljerede fane og vælge gennemsnitsværdier.Denne protokol blev brugt til at transplantere ikke-mærkede menneskelige holme ind i det indre kammer i øjet af otte uger gamle kvindelige røde fluorescerende modtager mus. Interaktiv billedbehandlingssoftware blev derefter brugt til at udtrække kvantitative data fra billederne. I vivo fluorescens billeddannelse blev humane øtransplantater kompromitteret af signifikant interferens fra vævs autofluorescens, som ikke blev observeret i museødeplantater.For at forbedre signal-støjforholdet blev autofluorescencekanalen trukket fra. Derefter blev den øgrænse, der kaldes ømaske, og de tilsvarende kanaler defineret manuelt. Endelig blev segmenteringen af tomatsignalet ind i øjenlågets vaskulatur og øjenlågkapsel og endelig overfladegengivelse anvendt til at udtrække kvantitative data.Her som en repræsentativ langsgående billeddannelse session af samme menneskelige ø graft på to uger, to måneder, fem måneder og otte måneder efter transplantation. MIP-billeder af oprindeligt optagede rådata, behandlede billeder efter automatisk fjernelse af ø-oplevelsen og der vises et segmenteret øobjekter. Når du udfører indsprøjtningen af øjenlåget, skal du sørge for at preloade holmene i et lille volumen og bruge fleksible dobbelte lysarme på dit stereomikroskop for at fremhæve øjenkammerrummet for at kunne injicere holmene i ACE.Efter in vivo billeddannelse øjnene kan fastsættes og yderligere undersøgt for antistof farvning og konventionel histologi. Denne teknik er meget nyttig til funktionelle undersøgelser af individuelle menneskelige holme i realtid og under fysiologiske forhold, især i forbindelse med vaskularisering, levedygtighed og metaboliske undersøgelser.

Research

JoVE Journal

Medicine

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Subretinal injektion af genterapivektorer og stamceller i mus Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation ind i det forreste kammer i øjet til langsgående, ikke-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging med Single-celle Opløsning i realtid

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolation, Kultur og Imaging for Human Føtal pankreascelle Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging af hjernetumorer og Gigt Brug Fluorescent SAPC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mus Model af type 2 diabetes: Pancreas Islet Isolering og live-cell 2-Photon Imaging af intakte Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In vivo-billeddannelse og sporing af technetium-99m-mærkede Bone Marrow mesenchymale stamceller i Equine tendinopati

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studere i bugspytkirtlen Kræft stamceller Karakteristik for udvikling af nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Udtømning af Mouse Celler fra Humane tumorxenoplantater Markant Forbedrer Downstream Analyse af Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging af Cerebrovasculature: Relevans til CNS-sygdomme

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: Et værktøj til måling af pancreas Islet mikrovaskulære hjerte In Vivo

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...