Name: longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber
Uploaded: 2020-06-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de Zweedse Onderzoeksraad, Strategisch Onderzoeksgebied Exodiab, Dnr 2009-1039, de Zweedse Stichting voor Strategisch Onderzoek Dnr IRC15-0067 aan LUDC-IRC, de Royal Physiographic Society in Lund, Diabetesförbundet en Barndiabetesförbundet.

De Regionale Ethische Commissie in Lund, Zweden, keurde de studie volgens de Wet betreffende de Ethische Overzicht van Onderzoek in het betreffen van Mensen goed. Dierproeven werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Zweedse ethiek van dierproeven en goedgekeurd door de ethische commissies van Malmö en Lund. 6 tot 8 weken oude immunodeficiënte NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-tomaat. Rag2-/-ontvangende muizen werden geb...

<ol>
	<li>Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus:+The+epidemic+of+the+century.">Diabetes mellitus: The epidemic of the century.</a> World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).</li><li>Kanak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+response+in+islet+transplantation.">Inflammatory response in islet transplantation.</a> International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).</li><li>Nanji, S. A., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pancreatic+islet+transplantation+in+humans.">Advances in pancreatic islet transplantation in humans.</a> Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).</li><li>Malaisse, W. J., Maedler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+the+beta+cells+of+the+islets+of+Langerhans.">Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).</li><li>Kim, D., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+of+Transplanted+Pancreatic+Islets.">In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Yang, S. N., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eye+as+a+novel+imaging+site+in+diabetes+research.">The eye as a novel imaging site in diabetes research.</a> Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).</li><li>Schmidt-Christensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamics+of+CD11c(+)+cells+and+Foxp3(+)+cells+in+progressive+autoimmune+insulitis+in+the+NOD+mouse+model+of+type+1+diabetes.">Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).</li><li>Berclaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+three-dimensional+visualisation+of+autoimmune+diabetes+by+functional+optical+coherence+imaging.">Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging.</a> Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).</li><li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+fibroblasts+reconstitute+the+peri-islet+membrane:+a+longitudinal+imaging+study+of+human+islet+grafting+and+revascularisation.">Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation.</a> Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).</li><li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , 11-24 (2013).</li><li>Goto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+the+automated+method+for+human+islet+isolation+and+presentation+of+a+closed+system+for+in+vitro+islet+culture.">Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture.</a> Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).</li><li>Jansson, L., Carlsson, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+vascular+function+after+transplantation+of+pancreatic+islets.">Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets.</a> Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).</li><li>Konstantinova, I., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+development:+learning+from+pancreatic+islets.">Microvascular development: learning from pancreatic islets.</a> Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).</li><li>Fransson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+support+endothelial+cell+interactions+in+an+intramuscular+islet+transplantation+model.">Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model.</a> Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).</li><li>Nyqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+islet+endothelial+cells+in+pancreatic+islet+revascularization.">Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization.</a> Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).</li><li>Nair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+common+anesthetics+on+eye+movement+and+electroretinogram.">Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram.</a> Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).</li><li>Iwasaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+intolerance+during+prolonged+sevoflurane+anaesthesia.">Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia.</a> Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).</li><li>Hamilton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+its+applications+in+fluorescent+microscopy+imaging.">Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging.</a> Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).</li><li>Michelotti, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET/MRI+enables+simultaneous+in+vivo+quantification+of+beta-cell+mass+and+function.">PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function.</a> Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Allogeneic+Islet+Grafts+in+Nonhuman+Primates+Using+MRI.">Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI.</a> Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).</li><li>Gotthardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+beta+cells+by+PET+imaging:+why+clinical+implementation+has+never+been+closer.">Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer.</a> Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).</li><li>Joosten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Pancreatic+beta+Cell+Mass+in+Vivo+with+Exendin+SPECT+during+Hyperglycemia+and+Severe+Insulitis.">Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis.</a> Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).</li><li>Virostko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+mouse+models+quantifies+beta+cell+mass+in+the+pancreas+and+after+islet+transplantation.">Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).</li></ol>

Een methode wordt gepresenteerd om het menselijke alvleesklier eilandjeceltransplantatieproces te bestuderen door de betrokkenheid van ontvanger en donorweefsel te observeren. Na een minimale invasieve operatie die menselijke eilandjes implanteert in de voorkamer van een immunodeficiënt muizenoog, herstelt de muis snel binnen enkele minuten na de operatie. De procedure wordt uitgevoerd op één oog. Over het algemeen is het hoornvlies vanaf 5-7 dagen na de implantatie voldoende genezen om intravital beeldvorming uit te ...

Diabetes mellitus beschrijft een groep van metabole ziekten gekenmerkt door verhoogde niveaus van bloedglucose als resultaten van onvoldoende insulineproductie van verlies of disfunctie van pancreas islet bètacellen, vaak vergezeld van insulineresistentie. Type 1 (T1D) en type 2 diabetes (T2D) zijn complexe ziekten waarbij de progressieve disfunctie van de bètacellen ziekteontwikkeling veroorzaakt. T1D wordt neergeslagen door een auto-immuunaanval op de bètacellen, terwijl T2D wordt beschouwd als aangedreven door metabole factoren, zij het met toenemend bewijs van low-grade systemische ontsteking1. Transplantatie van donor menselijke eilandjes, met name voor T1D-patiënten, biedt het potentieel voor het verstrekken van fysiologische glycemische controle. Echter, een tekort aan weefseldonoren en slechte eilandjes engraftment heeft voorkomen dat eilandjetransplantatie uitgegroeid tot een mainstream therapeutische optie. Een aanzienlijk deel van het functionele eilandjetransplantatie gaat verloren in de onmiddellijke posttransplantatieperiode (24-48 uur) als gevolg van de hypoxische, inflammatoire, immunogene gastheeromgeving2,3. Om de efficiëntie van interventiemethoden voor de verbetering van de overleving van eilandjes te evalueren, is continue monitoring van dergelijke transplantaties noodzakelijk.
In vivo technieken om beeld en het lot van getransplanteerde menselijke alvleesklier eilandjes na transplantatie blijft nog steeds een uitdaging voor diabetes onderzoek4,5. Tot op heden tonen niet-invasieve beeldvormingstechnieken, waaronder positronemissietomografie (PET), magnetic resonance imaging (MRI) of echografie (VS) potentieel voor de kwantificering en functionele evaluatie van getransplanteerde eilandjes in experimentele omstandigheden5. Gezien de kleine eilandjesgroottes hebben kwantitatieve metingen op deze modaliteiten echter onvoldoende resolutie. De voorste oogkamer (ACE) als transplantatielocatie voor observatie is een veelbelovende niet-invasieve beeldvormingsoplossing die effectief een hogere ruimtelijke resolutie en frequente monitoring over lange periodenbiedt 6. Deze methode is met succes benut om muis eilandje biologie te bestuderen (beoordeeld in Yang et al.7), auto-immuunreacties 8 ,evenalsmenselijk eilandje enten9,10.
Hier wordt de ACE-transplantatiemethode gecombineerd met een 2-fotonbeeldvormingsbenadering om de dynamiek van het menselijke alvleesklierenteletproces te onderzoeken door continue en herhaalde opnames op individuele eilandjestransplantaten tot 10 maanden na transplantatie. De multifoton beeldvormingseigenschappen van grotere beelddiepten en verminderde algehele fotobleaching en fotoschade overwinnen de beeldvormingsbeperkingen van confocale microscopie11. Kwantificering van fluorescerende beeldvorming omvat verschillende fasen, waaronder het voorbereiden van eilandjesvoorbeelden, eilandjestransplantatie, beeldverwerving, beeldfiltering om eilandjesruis of achtergrond, segmentatie, kwantificering en gegevensanalyse te verwijderen. De meest uitdagende stap is meestal het partitioneren of segmenteren van een afbeelding in meerdere delen of regio's. Dit kan het scheiden van signaal van achtergrondgeluid, of clustering regio's van voxels op basis van gelijkenissen in kleur of vorm te detecteren en labelvoxels van een 3D-volume dat eilandje vasculatuur vertegenwoordigt, bijvoorbeeld. Eenmaal gesegmenteerd, statistieken zoals object volume maten zijn meestal eenvoudig te extraheren. Voorzien is een methode voor de kwantificering en extractie van de beeldgegevens, zoals segmentatie en datavisualisatie. Bijzondere aandacht wordt besteed aan het verwijderen van autofluorescentie in menselijke eilandjes en onderscheid tussen eilandje vasculatuur en eilandje capsule vormen ontvanger cellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8323001</td>
			<td>used for isofluran anasthesia during surgery and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-induction chamber 1.4 L</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8329002</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas routing switch</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8433005</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AngioSense 680 EX</td>
			<td>Percin Elmer</td>
			<td>NEV10054EX</td>
			<td>imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes assemblies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml</td>
			<td>Schering-Plough Europ&#233;</td>
			<td>64022</td>
			<td>fluid, for pain relief</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>321242C</td>
			<td>used together with Aspirator tubes assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Texas Red (TR), 70kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1830</td>
			<td>imaging agent for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cannula, blunt end , 25 G</td>
			<td>BVI Visitec/BD</td>
			<td>BD585107</td>
			<td>custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45&#8304;), tip tapered to 30 G (0.3mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81242</td>
			<td>Plunger type gas-tight syringe for islet injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Head holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-UST-2 Solid Universal Joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>UST-2</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-custom made metal plate for head-holder assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Dumont #5, straight</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>0207-5TI-PS or 0208-5-PS</td>
			<td>attached to UST-2 (custom made)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad, custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>taped to the stereotaxic platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human islet culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-CMRL 1066</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td>cell culture media for human islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HEPES</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-L-glutamin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Gentamycin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Fungizone</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ciproxfloxacin</td>
			<td>Bayer healthcare AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Imaris 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Aquisition software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>ZEN 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1010364937</td>
			<td>used to keep animals warm in the wake-up cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Isoflo</td>
			<td>Abott Scandinavia/Apotek</td>
			<td></td>
			<td>fluid, for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange</td>
			<td>BD</td>
			<td>10442204</td>
			<td>used as scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 90mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Photon/confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-LSM7 MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ti:Sapphire laser Tsunami</td>
			<td>Spectra-Physics, Mai Tai</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET710/40m (Angiosense 680)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>288003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET645/65m-2p (TR)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC528423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET525/50 (GFP)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET610/75 (tomato)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-main beam splitter T680lpxxr</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T680lpxxr</td>
			<td>Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)</td>
			<td>Smiths Medical Danmark</td>
			<td>800/100/120</td>
			<td>to connect with Hamilton syringe and eye canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Model SMZ645, for islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (Flourescence)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for islet graft imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ100 Multizoom</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>wide field and long distance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 1x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 4x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HG Manual New Intensilight</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block TEXAS RED</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>contains EX540-580, DM595 and BA600-660</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block G-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX510-560, DM575 and BA590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block B-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX450-490, DM505 and BA520)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1-ml, Omnitix</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>for Buprenorphine injection, used with 27 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber

Imaging bètacellen is een belangrijke stap in de richting van inzicht in eilandjestransplantatie. Hoewel verschillende beeldvormingsplatforms voor de registratie van bètacelbiologie in vivozijn ontwikkeld en gebruikt, zijn ze beperkt in termen van het toestaan van eencellige resolutie en continue longitudinale opnames. Vanwege de transparantie van het hoornvlies is de voorkamer van het oog (ACE) bij muizen zeer geschikt om de biologie van menselijke en muizenalvleeskliercelen te bestuderen. Hier is een beschrijving van hoe deze aanpak kan worden gebruikt om continue longitudinale opnames van enten en revitalisering van individuele menselijke eilandjes enten uit te voeren. Menselijke eilandjestransplantaties worden in de ACE ingebracht met behulp van NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-muizen als ontvangers. Dit maakt het mogelijk om de uitbreiding van ontvanger versus donorcellen en de bijdrage van de ontvangende cellen bij het bevorderen van de inkapseling en vascularisatie van het transplantaat mogelijk te maken. Verder wordt een stapsgewijze benadering geschetst voor beeldanalyse en kwantificering van het eilandjevolume of gesegmenteerde vasculatuur en eilandjescapsule die ontvangende cellen vormt.

Niet-gelabelde menselijke eilandjes werden getransplanteerd in de ACE van 8 weken oude vrouwelijke NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-tomaat. Rag2−/−) ontvanger muizen. Om afstoting van menselijk weefsel te voorkomen, werden immunodeficiënte Rag2 knock-out muizen gekozen als ontvangers. In deze transgene muizen, alle cellen en weefsels uitgedrukt een membraan-gerichte tomaat fluorescentie eiwit (mT) dat een duidelijke identificat...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Het doel van dit protocol is om continu de dynamiek van het menselijke alvleesklier eilandje engraftment proces en de bijdragende gastheer versus donorcellen te controleren. Dit wordt bereikt door het transplanteren van menselijke eilandjes in de voorste kamer van het oog (ACE) van een NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-muisontvanger gevolgd door herhaalde 2-foton beeldvorming.

Longitudinale In Vivo Beeldvorming en kwantificering van menselijke alvleesklier eilandjes en bijdragende gastheercellen in de oogkamer van het voorste oog

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

De ACE is een optimale beeldvorming bezienswaardigheden. Het ondersteunt om het te herhalen in de lange termijn in vivo beeldvorming van eilandjecellen om hun functie en levensvatbaarheid in een enting situatie te bestuderen. Het kan ook worden uitgebreid om andere aspecten onder fysiologische en pathologische omstandigheden in real time te bestuderen.Het voordeel van de ACE-techniek ligt in het feit dat dezelfde individuele menselijke alvleeskliereilandjes gedurende een langere periode niet-invasief kunnen worden gevolgd met subcellulaire resolutie. Slagingspercentages van bètacelvervangende therapie blijven verbeteren. De evaluatie van de efficiëntie van eilandjes en overleving in vivo blijft echter nog steeds een uitdaging.Deze methode kan helpen bij het beoordelen en optimaliseren van de resultaten van eilandjestransplantaties. Deze aanpak is niet beperkt tot alvleesklier eilandjes alleen. Het is ook zeer geschikt om onderzocht weefsels getroffen.Bijvoorbeeld, bij diabetische complicaties, zoals nierglomeruli of leverstukken, om er maar een paar te noemen. Om te beginnen plaats de muis op een warme verwarmingskussen positie in de hoofdhouder en zet op de neus masker. Gebruik de duim en wijsvinger om het hoofd iets op te tillen.Maak het vast met de metalen stukken aan de zijkanten. Zorg ervoor dat de oorstukken het hoofd direct onder de oren bevestigen. Onderhuids buprenorfine-oplossing injecteren in de achterkant van de muis.Trek voorzichtig de oogleden van het oog in om te worden getransplanteerd met behulp van stompe tangen. Pop het oog uit en losjes repareren met een pincet bedekt met een polyethyleen buis. Na het overbrengen van de oogleden naar een petrischaaltje met PBS, pak ongeveer 20 tot 30 eilandjes in de oogblikvorm.Met behulp van een 25-meter naald niveau naar boven, zorgvuldig steek de tip in het hoornvlies en maak een enkele laterale incisie. Til het hoornvlies voorzichtig op met de canule die vooraf is geladen met eilandjes en laat de eilandjes langzaam los in het oog. Trek de canule langzaam in en breng ooggel aan op het oog.Verwijder na 10 minuten de tangen, houd het ooglid vast en zet het oog terug naar zijn normale positie. Voor beeldvorming van geïmplanteerde menselijke eilandjes met twee fotonmicroscopie, plaats het hoofdhouderplatform onder de microscoop en toedien ooggel op het oog als een onderdompelingsvloeistof tussen het hoornvlies en de lens. Plaats het oog onder het doel en beeld de geïmplanteerde menselijke eilandjes zoals beschreven in het tekstmanuscript.Als u de automatischefluorescentie wilt verwijderen, gaat u naar het tabblad afbeeldingsverwerking, kiest u kanaalrekenkundige en typt u kanaal één minkanaal twee. Dit creëert een nieuw kanaal vier. Hernoem het vasculatuur.Herhaal dit proces en typ kanaal drie min kanaal twee om een nieuw kanaal vijf te maken en de naam tomaat alles te hernoemen. Als u het eilandje handmatig een nieuw oppervlak wilt definiëren en handmatig bewerken in de wizard wilt kiezen. Houd de aanwijzer in de selecteertmodus en in de 3D-weergave.En klik op volume om secties te visualiseren. Kies op het tabblad tekenen contour en klik op tekenen om contouren rond de eilandjesrand te tekenen, te beginnen in slicepositie één. Ga vervolgens naar een nieuwe segmentpositie en herhaal tekencontouren.Werk af met het laatste segment boven aan de eilandje en klik door op het tabblad Oppervlakte maken te klikken. Volgende segment, islet vasculature en islet tomaat fluorescentie met behulp van eilandje masker. Kies het eerder gedefinieerde object eilandjesmasker, ga naar het tabblad bewerken en klik op het tabblad Masker, dat een nieuw venster opent.Kies het vasculaturekanaal in het vervolgkeuzemenu kanaalselectie en activeer opties duplicaatkanaal voordat u masker toepast. Constant binnen, buiten en stel voxels buitenoppervlak aan 0.000 die een nieuw kanaal zes leidt. Wijzig de naam van dit kanaaleiland vasculature.Herhaal de vorige stappen en kies de tomaat in het vervolgkeuzemenu kanaalselectie, om het nieuwe kanaal te maken, de naam ervan te wijzigen, islettomaat te is. Maak vervolgens een nieuw oppervlak in het scènemenu en kies automatische creatie in de wizard. Stel het bronkanaal in op de eerder gemaakte islet vasculature en kies achtergrondaftrekken.Gebruik optioneel filters. Kies bijvoorbeeld volume en pas het filter in het venster aan, waarmee geselecteerde serviceobjecten kunnen worden verwijderd. Maak de wizard af en geef het nieuwe oppervlakobject, eilandje vasculatuur, een naam.Ga in het serviceobject islaatatuur naar het tabblad bewerken en klik op het tabblad Masker, dat een nieuw venster opent. Kies het islettomaatkanaal in het vervolgkeuzemenu kanaalselectie en stel voxels buitenoppervlak in op 10.000, waardoor een nieuw kanaal wordt gemaakt. Hernoem dit kanaal eilandje tomaat vasculatuur.Voor het segmenteren tomaat capsule fluorescerend signaal kies kanaal rekenkunde in de beeldverwerking tabblad en type kanaal zeven minus kanaal acht het creëren van het nieuwe kanaal. Hernoem het tomatencapsule. Maak een nieuw oppervlak zoals eerder beschreven en kies bronkanalen, islet tomaat vasculatuur of tomaat capsule in de wizard.Voer vervolgens achtergrondaftrekken uit. Open het backscatterbestand van de eilandjes en maak een nieuw oppervlak. Kies in de wizard automatische creatie en definieer interessegebied.Pas indien nodig de drempel in absolute intensiteit aan. Het oppervlakobject kan aan of uit worden geklikt om te kruisen met de bijbehorende kanaalintensiteit. Als u klaar bent, sluit u de wizard.Voer ten slotte kwantificering uit, selecteer een gemaakt oppervlakteobject in het scènemenu en ga naar het tabblad Statistieken. Als u gedetailleerde volumegegevens wilt ophalen, kiest u het gedetailleerde tabblad en selecteert u specifieke waarden en volume in het vervolgkeuzemenu. Als u de totale volumewaarde wilt ophalen, gaat u naar het gedetailleerde tabblad en kiest u gemiddelde waarden.Dit protocol werd gebruikt om niet-gelabelde menselijke eilandjes te transplanteren in de binnenkamer van het oog van acht weken oude vrouwelijke rode fluorescerende ontvanger muizen. Interactieve imaging software werd vervolgens gebruikt om kwantitatieve gegevens uit de beelden te halen. In vivo fluorescens beeldvorming, de menselijke eilandjes grafts werd aangetast door aanzienlijke interferentie van weefsel autofluorescentie die niet werd waargenomen in muizen eilandje grafts.Om de signaal-ruisverhouding te verbeteren, werd het autofluorescentiekanaal afgetrokken. Vervolgens werden de eilandjesgrens met de naam eilandjesmasker en de bijbehorende kanalen handmatig gedefinieerd. Ten slotte werd de segmentatie van het tomatensignaal in de vasculatuur van het ooglid en de ooglidcapsule en de uiteindelijke oppervlakteweergave gebruikt om kwantitatieve gegevens te extraheren.Hier als een representatieve longitudinale beeldvorming sessie van dezelfde menselijke eilandje graft op twee weken, twee maanden, vijf maanden en acht maanden na transplantatie. MIP-beelden van oorspronkelijk opgenomen ruwe gegevens, verwerkte afbeeldingen na het verwijderen van autofluorescentie van islet en een gesegmenteerde eilandjeobjecten worden weergegeven. Bij het uitvoeren van de ooglidinjectie moet u de eilandjes in een klein volume voorladen en flexibele dubbele lichtarmen op uw stereomicroscoop gebruiken om de ruimte van de oogkamer te markeren om de eilandjes met succes in de ACE te injecteren.Na de in vivo beeldvorming kunnen de ogen worden vastgesteld en verder worden onderzocht op antilichaamvlekken en conventionele histologie. Deze techniek is zeer nuttig voor functionele studies van individuele menselijke eilandjes in real time en onder fysiologische omstandigheden, vooral in de context van vascularisatie, levensvatbaarheid en metabole studies.

Research

JoVE Journal

Medicine

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Subretinale Injectie van gentherapievectoren en stamcellen in de Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantatie in de voorste kamer van het oog voor Longitudinaal, niet-invasieve<em&gt; In vivo</em&gt; Beeldvorming met Single-cell resolutie in real-time

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolatie, cultuur en beeldvorming van humane foetale Alvleesklierkanker celclusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In vivo optische beeldvorming van hersentumoren en artritis met fluorescerende SAPC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

LepR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In vivo beeldvorming en bijhouden van Technetium-99m gelabelde beenmerg mesenchymale stamcellen in Equine tendinopathie

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Uitputting van de Muis Cellen van geënte, humane tumoren verbetert Downstream Analyse van Target Cellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

lengte-<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging van de Cerebrovasculature: Relevantie voor CNS ziekten

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: Een instrument voor het meten alvleesklier Islet microvasculaire Vasomotion In Vivo

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...