Name: longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber
Uploaded: 2020-06-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

Diese Studie wurde vom Schwedischen Forschungsrat, Strategic Research Area Exodiab, Dnr 2009-1039, der Schwedischen Stiftung für Strategische Forschung Dnr IRC15-0067 an LUDC-IRC, der Royal Physiographic Society in Lund, Diabetesförbundet und Barndiabetesförbundet unterstützt.

Die regionale Ethikkommission in Lund, Schweden, genehmigte die Studie gemäß dem Gesetz über die ethische Überprüfung von Forschung unter Einbeziehung von Menschen. Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit der schwedischen Ethik der Tierversuche durchgeführt und von den Ethikkommissionen von Malmö und Lund genehmigt. 6 bis 8 Wochen alte immundefiziver NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-Tomate. Rag2-/-) Empfängerm?...

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	<li>Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus:+The+epidemic+of+the+century.">Diabetes mellitus: The epidemic of the century.</a> World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).</li><li>Kanak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+response+in+islet+transplantation.">Inflammatory response in islet transplantation.</a> International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).</li><li>Nanji, S. A., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pancreatic+islet+transplantation+in+humans.">Advances in pancreatic islet transplantation in humans.</a> Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).</li><li>Malaisse, W. J., Maedler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+the+beta+cells+of+the+islets+of+Langerhans.">Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).</li><li>Kim, D., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+of+Transplanted+Pancreatic+Islets.">In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Yang, S. N., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eye+as+a+novel+imaging+site+in+diabetes+research.">The eye as a novel imaging site in diabetes research.</a> Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).</li><li>Schmidt-Christensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamics+of+CD11c(+)+cells+and+Foxp3(+)+cells+in+progressive+autoimmune+insulitis+in+the+NOD+mouse+model+of+type+1+diabetes.">Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).</li><li>Berclaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+three-dimensional+visualisation+of+autoimmune+diabetes+by+functional+optical+coherence+imaging.">Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging.</a> Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).</li><li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+fibroblasts+reconstitute+the+peri-islet+membrane:+a+longitudinal+imaging+study+of+human+islet+grafting+and+revascularisation.">Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation.</a> Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).</li><li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , 11-24 (2013).</li><li>Goto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+the+automated+method+for+human+islet+isolation+and+presentation+of+a+closed+system+for+in+vitro+islet+culture.">Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture.</a> Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).</li><li>Jansson, L., Carlsson, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+vascular+function+after+transplantation+of+pancreatic+islets.">Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets.</a> Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).</li><li>Konstantinova, I., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+development:+learning+from+pancreatic+islets.">Microvascular development: learning from pancreatic islets.</a> Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).</li><li>Fransson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+support+endothelial+cell+interactions+in+an+intramuscular+islet+transplantation+model.">Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model.</a> Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).</li><li>Nyqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+islet+endothelial+cells+in+pancreatic+islet+revascularization.">Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization.</a> Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).</li><li>Nair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+common+anesthetics+on+eye+movement+and+electroretinogram.">Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram.</a> Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).</li><li>Iwasaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+intolerance+during+prolonged+sevoflurane+anaesthesia.">Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia.</a> Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).</li><li>Hamilton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+its+applications+in+fluorescent+microscopy+imaging.">Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging.</a> Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).</li><li>Michelotti, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET/MRI+enables+simultaneous+in+vivo+quantification+of+beta-cell+mass+and+function.">PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function.</a> Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Allogeneic+Islet+Grafts+in+Nonhuman+Primates+Using+MRI.">Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI.</a> Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).</li><li>Gotthardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+beta+cells+by+PET+imaging:+why+clinical+implementation+has+never+been+closer.">Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer.</a> Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).</li><li>Joosten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Pancreatic+beta+Cell+Mass+in+Vivo+with+Exendin+SPECT+during+Hyperglycemia+and+Severe+Insulitis.">Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis.</a> Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).</li><li>Virostko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+mouse+models+quantifies+beta+cell+mass+in+the+pancreas+and+after+islet+transplantation.">Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).</li></ol>

Eine Methode wird vorgestellt, um den Prozess der Pfropfzelltransplantation der menschlichen Pankreas-Islet-Zell-Transplantation zu untersuchen, indem die Beteiligung von Empfänger- und Spendergewebe beobachtet wird. Nach einer minimalinvasiven Operation, bei der menschliche Inselchen in die vordere Kammer eines immungeschwächten Mausauges implantiert wurden, erholt sich die Maus innerhalb weniger Minuten nach der Operation schnell. Das Verfahren wird auf einem Auge durchgeführt. In der Regel wird die Hornhaut ab 5–...

Diabetes mellitus beschreibt eine Gruppe von Stoffwechselerkrankungen, die durch erhöhte Blutzuckerwerte gekennzeichnet sind, als Ergebnis unzureichender Insulinproduktion durch Verlust oder Dysfunktion von Betazellen der Pankreas-Islet, oft begleitet von Insulinresistenz. Typ-1 -Diabetes (T1D) und Typ-2-Diabetes (T2D) sind komplexe Krankheiten, bei denen die fortschreitende Dysfunktion der Betazellen die Entwicklung von Krankheiten verursacht. T1D wird durch einen Autoimmunangriff auf die Beta-Zellen gefällt, während T2D als durch metabolische Faktoren angetrieben wird, wenn auch mit zunehmenden Beweisen für eine niedriggradige systemische Entzündung1. Die Transplantation von menschlichen Spenderinseln, insbesondere für T1D-Patienten, bietet das Potenzial zur physiologischen glykämischen Kontrolle. Ein Mangel an Gewebespendern und eine mangelhafte Islet-Transplantation haben jedoch verhindert, dass die Letentransplantation zu einer gängigen therapeutischen Option wird. Ein erheblicher Teil des funktionellen Islettransplantats geht in der unmittelbaren Posttransplantationsphase (24–48 h) aufgrund der hypoxischen, entzündlichen, immunogenen Wirtsumgebung2,3verloren. Um die Effizienz der Interventionsmethoden zur Verbesserung des Überlebens der Leten zu bewerten, ist eine kontinuierliche Überwachung solcher Transplantationen erforderlich.
In-vivo-Techniken, um das Schicksal transplantierter menschlicher Pankreasinseln nach der Transplantation abzubilden und zu verfolgen, bleibt für die Diabetesforschung nachwie voreine Herausforderung 4,5. Bislang zeigen nichtinvasive bildgebende Verfahren, einschließlich Positronenemissionstomographie (PET), Magnetresonanztomographie (MRT) oder Ultraschall (US), Potenzial für die Quantifizierung und funktionelle Bewertung transplantierter Inselchen unter experimentellen Bedingungen5. Angesichts der geringen Isätsgrößen leiden quantitative Messungen nach diesen Modalitäten jedoch unter unzureichender Auflösung. Die Vorderkammer des Auges (ACE) als Transplantationsstelle zur Beobachtung ist eine vielversprechende nichtinvasive bildgebende Lösung, die eine effektiv höhere räumliche Auflösung und häufige Überwachung über lange Zeiträumebietet 6. Diese Methode wurde erfolgreich genutzt, um Maus Inselbiologie zu studieren (überprüft in Yang et al.7), Autoimmunimmunreaktionen8, sowie menschliche Insel Pfropfung9,10.
Hier beiderageniert wird die ACE-Transplantationsmethode mit einem 2-Photon-Bildgebungsansatz, um die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantatprozesses durch kontinuierliche und wiederholte Aufnahmen an einzelnen Islettransplantaten bis zu 10 Monate nach der Transplantation zu untersuchen. Die Multiphotonen-Bildgebungseigenschaften größerer Bildtiefe und reduzierter Photobleich- und Fotoschäden überwinden die bildgebenden Grenzen der konfokalen Mikroskopie11. Die Quantifizierung der fluoreszierenden Bildgebung umfasst mehrere Phasen, einschließlich der Vorbereitung von Inselproben, der Inseltransplantation, der Bildaufnahme, der Bildfilterung zur Entfernung von Inselrauschen oder -hintergrund, der Segmentierung, Quantifizierung und Datenanalyse. Der schwierigste Schritt ist in der Regel die Partitionierung oder Segmentierung eines Bildes in mehrere Teile oder Regionen. Dies kann die Trennung von Signal und Hintergrundrauschen oder Clustering-Bereiche von Voxeln auf der Grundlage von Ähnlichkeiten in Farbe oder Form beinhalten, um Voxel eines 3D-Volumens zu erkennen und zu kennzeichnen, das beispielsweise die Vaskulatur der Islet darstellt. Nach der Segmentierung sind Statistiken wie Objektvolumengrößen in der Regel einfach zu extrahieren. Zur Verfügung gestellt wird eine Methode zur Quantifizierung und Extraktion der Bilddaten, wie Segmentierung und Datenvisualisierung. Besonderes Augenmerk wird auf die Entfernung der Autofluoreszenz bei menschlichen Inselchen und die Unterscheidung zwischen Inselvaskulatur und Inselkapsel bildenden Empfängerzellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8323001</td>
			<td>used for isofluran anasthesia during surgery and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-induction chamber 1.4 L</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8329002</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas routing switch</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8433005</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AngioSense 680 EX</td>
			<td>Percin Elmer</td>
			<td>NEV10054EX</td>
			<td>imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes assemblies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml</td>
			<td>Schering-Plough Europ&#233;</td>
			<td>64022</td>
			<td>fluid, for pain relief</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>321242C</td>
			<td>used together with Aspirator tubes assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Texas Red (TR), 70kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1830</td>
			<td>imaging agent for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cannula, blunt end , 25 G</td>
			<td>BVI Visitec/BD</td>
			<td>BD585107</td>
			<td>custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45&#8304;), tip tapered to 30 G (0.3mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81242</td>
			<td>Plunger type gas-tight syringe for islet injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Head holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-UST-2 Solid Universal Joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>UST-2</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-custom made metal plate for head-holder assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Dumont #5, straight</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>0207-5TI-PS or 0208-5-PS</td>
			<td>attached to UST-2 (custom made)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad, custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>taped to the stereotaxic platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human islet culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-CMRL 1066</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td>cell culture media for human islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HEPES</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-L-glutamin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Gentamycin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Fungizone</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ciproxfloxacin</td>
			<td>Bayer healthcare AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Imaris 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Aquisition software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>ZEN 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1010364937</td>
			<td>used to keep animals warm in the wake-up cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Isoflo</td>
			<td>Abott Scandinavia/Apotek</td>
			<td></td>
			<td>fluid, for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange</td>
			<td>BD</td>
			<td>10442204</td>
			<td>used as scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 90mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Photon/confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-LSM7 MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ti:Sapphire laser Tsunami</td>
			<td>Spectra-Physics, Mai Tai</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET710/40m (Angiosense 680)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>288003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET645/65m-2p (TR)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC528423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET525/50 (GFP)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET610/75 (tomato)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-main beam splitter T680lpxxr</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T680lpxxr</td>
			<td>Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)</td>
			<td>Smiths Medical Danmark</td>
			<td>800/100/120</td>
			<td>to connect with Hamilton syringe and eye canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Model SMZ645, for islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (Flourescence)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for islet graft imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ100 Multizoom</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>wide field and long distance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 1x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 4x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HG Manual New Intensilight</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block TEXAS RED</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>contains EX540-580, DM595 and BA600-660</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block G-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX510-560, DM575 and BA590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block B-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX450-490, DM505 and BA520)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1-ml, Omnitix</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>for Buprenorphine injection, used with 27 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber

Die Bildgebung von Betazellen ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Letentransplantation. Obwohl verschiedene Bildgebungsplattformen für die Aufzeichnung der Beta-Zellbiologie entwickelt und in vivogenutzt wurden, sind sie in Bezug auf die Zulassung von Einzelzellauflösung und kontinuierlichen Längsaufnahmen begrenzt. Aufgrund der Transparenz der Hornhaut eignet sich die vordere Augenkammer (ACE) bei Mäusen gut, um die Biologie der menschlichen und Mauspankreasinsel zu untersuchen. Hier ist eine Beschreibung, wie dieser Ansatz verwendet werden kann, um kontinuierliche Längsschnittaufnahmen von Transplantationen und Revaskularisation enterblichen menschlichen Islettransplantaten durchzuführen. Menschliche Islettransplantate werden mit NOD in den ACE eingeführt. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-Mäuse als Empfänger. Dies ermöglicht die Untersuchung der Expansion von Empfänger- gegen Spenderzellen und den Beitrag von Empfängerzellen zur Förderung der Verkapselung und Vaskularisation des Transplantats. Darüber hinaus wird ein Schritt-für-Schritt-Ansatz für die Bildanalyse und Quantifizierung des Ischenvolumens oder der segmentierten Vaskulatur und der Isletkapsel bildenden Empfängerzellen skizziert.

Nicht gekennzeichnete menschliche Inselchen wurden in den ACE der 8 Wochen alten Hündin NOD transplantiert. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-Tomate. Rag2-Empfängermäuse. Um eine Abstoßung menschlichen Gewebes zu verhindern, wurden immundefiziende Rag2-Knockout-Mäuse als Empfänger ausgewählt. Bei diesen transgenen Mäusen exprimierten alle Zellen und Gewebe ein membranspezifisches Tomatenfluoreszenzprotein (mT), das eine klare Iden...

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Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Ziel dieses Protokolls ist es, die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantierungsprozesses und des beitragenden Wirts- und Spenderzellen kontinuierlich zu überwachen. Dies wird durch die Transplantation menschlicher Inselchen in die vordere Augenkammer (ACE) eines NOD erreicht. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-Mausempfänger gefolgt von wiederholter 2-Photonen-Bildgebung.

Längsschnitt in Vivo Bildgebung und Quantifizierung der menschlichen Pankreas-Islet-Grafting- und Beitragenden Wirtszellen in der Vorderen Augenkammer

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

Der ACE ist eine optimale Bildgebung. Es unterstützt, es in der langfristigen In-vivo-Bildgebung von Isletzellen zu wiederholen, um ihre Funktion und Lebensfähigkeit in einer Transplantationssituation zu untersuchen. Es kann auch erweitert werden, um andere Aspekte unter physiologischen und pathologischen Bedingungen in Echtzeit zu untersuchen.Der Vorteil der ACE-Technik liegt darin, dass die gleichen einzelnen menschlichen Pankreasinseln über einen längeren Zeitraum nicht invasiv mit subzellulärer Auflösung verfolgt werden können. Die Erfolgsraten der Beta-Zellersatztherapie verbessern sich weiter. Die Bewertung der Effizienz der Islettransplantation und des Überlebens in vivo bleibt jedoch eine Herausforderung.Diese Methode könnte helfen, die Ergebnisse von Letentransplantationen zu bewerten und zu optimieren. Dieser Ansatz ist nicht nur auf Pankreasinseln beschränkt. Es ist auch gut geeignet, um betroffene Gewebe zu untersuchen.Zum Beispiel bei diabetischen Komplikationen, wie Nierenglomeruli oder Leberstücken, um nur einige zu nennen. Um die Maus auf ein warmes Heizkissen zu stellen, positionieren Sie sie im Kopfhalter und setzen Sie sie auf die Nasenmaske. Verwenden Sie Daumen und Zeigefinger, um den Kopf leicht zu heben.Befestigen Sie es mit den Metallteilen an den Seiten. Stellen Sie sicher, dass die Ohrstücke den Kopf direkt unter den Ohren fixieren. Subkutane Buprenorphin-Lösung in den Rücken der Maus injizieren.Ziehen Sie vorsichtig die Augenlider des Auges zurück, um mit stumpfer Zange transplantiert zu werden. Das Auge herausstecken und locker mit einer Pinzette fixieren, die mit einem Polythenrohr bedeckt ist. Nach der Übertragung der Augenlider auf eine Petrischale mit PBS, nehmen Sie etwa 20 bis 30 Inselchen in den Augenkantoular.Mit einem 25-Grad-Nadelstand nach oben, legen Sie die Spitze vorsichtig in die Hornhaut und machen Sie einen einzigen seitlichen Schnitt. Heben Sie die Hornhaut vorsichtig mit der mit Inselchen vorinstallierten Kanüle an und geben Sie die Inselchen langsam ins Auge. Ziehen Sie die Kanüle langsam zurück und tragen Sie Augengel auf das Auge auf.Nach 10 Minuten entfernen Sie die Zange, halten Sie das Augenlid und setzen Sie das Auge wieder in seine normale Position. Zur Abbildung von implantierten menschlichen Inselchen mit zwei Photonenmikroskopie die Kopfhalterplattform unter das Mikroskop stellen und Augengel als Tauchflüssigkeit zwischen Hornhaut und Linse auf das Auge verabreichen. Positionieren Sie das Auge unter dem Objektiv und bildnisieren Sie die implantierten menschlichen Inselchen, wie im Textmanuskript beschrieben.Um die Autofluoreszenz zu entfernen, gehen Sie zur Registerkarte Bildverarbeitung, wählen Sie Kanalarithmetik und geben Sie Kanal einminus Kanal zwei ein. Dadurch wird ein neuer Kanal vier erstellt. Benennen Sie es vasculature um.Wiederholen Sie diesen Vorgang und geben Sie Kanal drei minus Kanal zwei ein, um einen neuen Kanal fünf zu erstellen und ihn alle Tomate umzubenennen. Um die Fläche zu definieren, erstellen Sie manuell eine neue Oberfläche, und wählen Sie manuell bearbeiten im Assistenten aus. Halten Sie den Zeiger im Auswahlmodus und in der 3D-Ansicht.Klicken Sie auf Lautstärke, um Abschnitte zu visualisieren. Wählen Sie auf der Registerkarte Zeichnung Kontur aus, und klicken Sie auf Zeichnen, um konturen um den Rahmen der kleinen Einzelze zu zeichnen, beginnend mit Segmentposition 1. Wechseln Sie dann zu einer neuen Slice-Position, und wiederholen Sie Zeichnungskonturen.Beenden Sie das Segment mit dem letzten Slice oben auf der Kleinen und dem Ende, indem Sie auf die Registerkarte Oberfläche erstellen klicken. Nächstes Segment, Islet Vaskulatur und Islet Tomatenfluoreszenz mit Islet Maske. Wählen Sie das zuvor definierte Islet-Maskenobjekt aus, wechseln Sie zur Registerkarte Bearbeiten und klicken Sie auf die Registerkarte Maske alle, die ein neues Fenster öffnet.Wählen Sie den Vaskulaturkanal im Dropdown-Menü der Kanalauswahl aus und aktivieren Sie den doppelten Kanal der Optionen, bevor Sie die Maske anwenden. Konstante innen, außen und setzen Voxel Außenfläche auf 0.000, die einen neuen Kanal sechs schafft. Benennen Sie diese Kanalinsel Vaskulatur um.Wiederholen Sie die vorherigen Schritte und wählen Sie die Tomate alle im Dropdown-Menü der Kanalauswahl aus, um den neuen Kanal zu erstellen, ihn umzubenennen, Inseltomate. Erstellen Sie dann eine neue Oberfläche im Szenenmenü, und wählen Sie im Assistenten die automatische Erstellung aus. Legen Sie den Quellkanal auf die zuvor erstellte Inselvaskulatur fest, und wählen Sie die Hintergrundsubtraktion aus.Optional Filter verwenden. Wählen Sie z. B. Volume aus, und passen Sie den Filter im Fenster an, wodurch ausgewählte Serviceobjekte entfernt werden können. Beenden Sie den Assistenten, und benennen Sie das neue Oberflächenobjekt, die Fläche Vaskulatur.Gehen Sie im Islet Vaskulature-Serviceobjekt zur Registerkarte Bearbeiten und klicken Sie auf die Registerkarte "Maske alle", die ein neues Fenster öffnet. Wählen Sie den Inseltomatenkanal im Dropdown-Menü der Kanalauswahl aus und stellen Sie die Voxel außerhalb der Oberfläche auf 10.000 ein, wodurch ein neuer Kanal entsteht. Benennen Sie diese Kanal Insel Tomaten Vaskulatur um.Um Tomatenkapsel-Fluoreszenzsignal zu segmentieren, wählen Sie Kanalarithmetik in der Registerkarte Bildverarbeitung und geben Sie Kanal sieben minus Kanal acht ein, um den neuen Kanal zu erstellen. Benennen Sie es Tomatenkapsel um. Erstellen Sie eine neue Oberfläche, wie zuvor beschrieben, und wählen Sie Quellkanäle, Islet Tomatenvaskulatur oder Tomatenkapsel im Assistenten.Führen Sie dann eine Hintergrundsubtraktion durch. Öffnen Sie die Rückstreudatei der Islet, und erstellen Sie eine neue Oberfläche. Wählen Sie im Assistenten die automatische Erstellung aus, und definieren Sie den Interessenbereich.Passen Sie bei Bedarf den Schwellenwert in absoluter Intensität an. Das Oberflächenobjekt kann angeklickt oder deaktiviert werden, um es mit der entsprechenden Kanalintensität abzuhaken. Schließen Sie nach Abschluss des Assistenten.Führen Sie schließlich die Quantifizierung durch, wählen Sie ein erstelltes Oberflächenobjekt im Szenenmenü aus, und wechseln Sie zur Registerkarte Statistik. Um detaillierte Volumendaten abzurufen, wählen Sie die detaillierte Registerkarte aus und wählen Sie bestimmte Werte und Volumen aus dem Dropdown-Menü aus. Um den Gesamtvolumenwert abzurufen, wechseln Sie zur detaillierten Registerkarte, und wählen Sie Durchschnittswerte aus.Dieses Protokoll wurde verwendet, um nicht gekennzeichnete menschliche Inselchen in die innere Kammer des Auges von acht Wochen alten weiblichen roten fluoreszierenden Empfängermäusen zu transplantieren. Interaktive Bildgebungssoftware wurde dann verwendet, um quantitative Daten aus den Bildern zu extrahieren. In vivo fluoreszens Bildgebung, die menschlichen Islet Transplantate wurde durch erhebliche Interferenzen von Gewebe-Autofluoreszenz, die nicht bei Mäuse-Islet-Transplantate beobachtet wurde kompromittiert.Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, wurde der Autofluoreszenzkanal subtrahiert. Dann wurden die Islet-Grenze namens Islet-Maske und die entsprechenden Kanäle manuell definiert. Schließlich wurde die Segmentierung des Tomatensignals in die Augenlidvaskulatur und Die Augenlidkapsel und die endgültige Oberflächenwiedergabe verwendet, um quantitative Daten zu extrahieren.Hier als repräsentative Längsbildgebungssitzung des gleichen menschlichen Islettransplantats nach zwei Wochen, zwei Monaten, fünf Monaten und acht Monaten nach der Transplantation. MIP-Bilder von ursprünglich aufgezeichneten Rohdaten, verarbeitete Bilder nach der automatischen Fluoreszenzentfernung der Islet und eine segmentierte Islet-Objekte werden angezeigt. Achten Sie bei der Einführung der Augenlidinjektion darauf, die Inselchen in einem kleinen Volumen vorzuladen und verwenden Sie flexible Doppellichtarme auf Ihrem Stereomikroskop, um den Augenkammerraum hervorzuheben, um die Inselchen erfolgreich in den ACE zu injizieren.Nach der In-vivo-Bildgebung können die Augen fixiert und weiter auf Antikörperfärbung und konventionelle Histologie untersucht werden. Diese Technik ist sehr nützlich für funktionelle Studien einzelner menschlicher Inseln in Echtzeit und unter physiologischen Bedingungen, insbesondere im Rahmen von Vaskularisations-, Lebensfähigkeits- und Stoffwechselstudien.

Research

JoVE Journal

Medicine

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Subretinalen Injektion von Vektoren für die Gentherapie und Stammzellen in die Maus Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Forschung

Medizin

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

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Transplantation in die Vorderkammer des Auges für Längs-, Non-invasive<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging mit Single-cell Auflösung in Echtzeit

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolierung, Kultur und Imaging von humanen fötalen Pankreas-Zellhaufen

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

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In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

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In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

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In-vivo-Imaging und Verfolgung von Technetium-99m markierten Knochenmark mesenchymale Stammzellen in Equine Tendinopathie

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Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

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Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

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in Längsrichtung<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging des Cerebrovasculature: Bedeutung für ZNS-Erkrankungen

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Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

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Laser-Doppler: Ein Instrument zur Messung der Pankreas Islet mikrovaskuläre Vasomotion In Vivo

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