Name: longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber
Uploaded: 2020-06-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מועצת המחקר השבדית, אזור המחקר האסטרטגי Exodiab, Dnr 2009-1039, הקרן השוודית למחקר אסטרטגי Dnr IRC15-0067 לLUDC-IRC, האגודה הפיזיוגרפית המלכותית בלונד, סוכרת ו Barndiabetesförbundet.

ועדת האתיקה האזורית בלונד, שוודיה, אישרה את המחקר על פי החוק הנוגע לביקורת האתית של מחקרים הקשורים לבני אדם. ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לאתיקה השבדית של ניסויים בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדות האתיקה של מאלמו ולונד. 6 עד 8 שבועות של אף פעם לא חיסוני. (Cg)-Gt(ROSA)26סורtm4-Rag2-/-...

<ol>
	<li>Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus:+The+epidemic+of+the+century.">Diabetes mellitus: The epidemic of the century.</a> World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).</li><li>Kanak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+response+in+islet+transplantation.">Inflammatory response in islet transplantation.</a> International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).</li><li>Nanji, S. A., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pancreatic+islet+transplantation+in+humans.">Advances in pancreatic islet transplantation in humans.</a> Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).</li><li>Malaisse, W. J., Maedler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+the+beta+cells+of+the+islets+of+Langerhans.">Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).</li><li>Kim, D., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+of+Transplanted+Pancreatic+Islets.">In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Yang, S. N., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eye+as+a+novel+imaging+site+in+diabetes+research.">The eye as a novel imaging site in diabetes research.</a> Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).</li><li>Schmidt-Christensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamics+of+CD11c(+)+cells+and+Foxp3(+)+cells+in+progressive+autoimmune+insulitis+in+the+NOD+mouse+model+of+type+1+diabetes.">Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).</li><li>Berclaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+three-dimensional+visualisation+of+autoimmune+diabetes+by+functional+optical+coherence+imaging.">Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging.</a> Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).</li><li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+fibroblasts+reconstitute+the+peri-islet+membrane:+a+longitudinal+imaging+study+of+human+islet+grafting+and+revascularisation.">Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation.</a> Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).</li><li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , 11-24 (2013).</li><li>Goto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+the+automated+method+for+human+islet+isolation+and+presentation+of+a+closed+system+for+in+vitro+islet+culture.">Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture.</a> Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).</li><li>Jansson, L., Carlsson, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+vascular+function+after+transplantation+of+pancreatic+islets.">Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets.</a> Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).</li><li>Konstantinova, I., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+development:+learning+from+pancreatic+islets.">Microvascular development: learning from pancreatic islets.</a> Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).</li><li>Fransson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+support+endothelial+cell+interactions+in+an+intramuscular+islet+transplantation+model.">Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model.</a> Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).</li><li>Nyqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+islet+endothelial+cells+in+pancreatic+islet+revascularization.">Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization.</a> Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).</li><li>Nair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+common+anesthetics+on+eye+movement+and+electroretinogram.">Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram.</a> Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).</li><li>Iwasaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+intolerance+during+prolonged+sevoflurane+anaesthesia.">Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia.</a> Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).</li><li>Hamilton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+its+applications+in+fluorescent+microscopy+imaging.">Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging.</a> Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).</li><li>Michelotti, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET/MRI+enables+simultaneous+in+vivo+quantification+of+beta-cell+mass+and+function.">PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function.</a> Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Allogeneic+Islet+Grafts+in+Nonhuman+Primates+Using+MRI.">Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI.</a> Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).</li><li>Gotthardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+beta+cells+by+PET+imaging:+why+clinical+implementation+has+never+been+closer.">Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer.</a> Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).</li><li>Joosten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Pancreatic+beta+Cell+Mass+in+Vivo+with+Exendin+SPECT+during+Hyperglycemia+and+Severe+Insulitis.">Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis.</a> Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).</li><li>Virostko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+mouse+models+quantifies+beta+cell+mass+in+the+pancreas+and+after+islet+transplantation.">Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).</li></ol>

שיטה מוצגת כדי לחקור את תהליך השתלת תאי איון הלבלב האנושי על ידי התבוננות המעורבות של הנמען ורקמות התורם. לאחר ניתוח פולשני מינימלי השתלת איונים אנושיים לתוך התא הקדמי של עין עכבר immunodeficient, העכבר מתאושש במהירות בתוך דקות לאחר הניתוח. ההליך מתבצע בעין אחת. בדרך כלל, מ 5-7 ימים לאחר השתלה ואילך...

סוכרת מתאר קבוצה של מחלות מטבוליות המאופיינת ברמות גבוהות של גלוקוז בדם כתוצאה של ייצור אינסולין לא מספיק מאובדן או תפקוד לקוי של תאי ביתא איון הלבלב, לעתים קרובות מלווה תנגודת לאינסולין. סוג 1 (T1D) וסוכרת מסוג 2 (T2D) הן מחלות מורכבות שבהן התפקוד הפרוגרסיבי של תאי הביתא גורם להתפתחות מחלות. T1D הוא זירז על ידי התקפה אוטואימונית על תאי בטא, בעוד T2D נחשב מונע על ידי גורמים מטבוליים, אם כי עם ראיות גוברות של דלקת מערכתית בדרגה נמוכה1. השתלת איונים אנושיים תורמים, במיוחד לחולים T1D, מציע את הפוטנציאל לספק שליטה גליקמית פיזיולוגית. עם זאת, מחסור של תורמי רקמות וחינוך איון עני מנע השתלת איון להפוך לאפוביה טיפולית הזרם המרכזי. חלק ניכר של שתל האי הפונקציונלי אובד בתקופה שלאחר השתלה מיידית (24-48 שעות) בשל הסביבה המארח היפוקסית, דלקתית, אימונוגנית2,,3. כדי להעריך את היעילות של שיטות התערבות לשיפור הישרדות איון, ניטור מתמשך של השתלות כאלה הוא הכרחי.
בטכניקות vivo כדי למצוא את גורלם של איונים הלבלב האנושי מושתלים לאחר השתלה עדיין נשאר אתגר עבור סוכרת מחקר4,5. עד כה, טכניקות הדמיה לא פולשניות, כולל טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET), הדמיית תהודה מגנטית (MRI), או אולטרסאונד (ארה"ב) להראות פוטנציאל לכמת והערכה פונקציונלית של איים מושתלים בתנאיםניסיוניים 5. עם זאת, בהתחשב בגדלים הקטנים של איון, מדידות כמותיות על ידי אותם מודאליות סובלות מרזולוציה לא מספקת. התא הקדמי של העין (ACE) כאתר השתלה לתצפית הוא פתרון הדמיה מבטיח שאינו פולשני המציע רזולוציה מרחבית גבוהה יותר ביעילות וניטור תכופים על פני תקופותארוכות 6. שיטה זו נוצלה בהצלחה כדי ללמוד ביולוגיה איון העכבר (נבדק ביאנג ואח'. 7), תגובות חיסוניותאוטואימוניות 8, כמו גםהשתלת איוןאנושי 9,10.
כאן שיטת השתלת ACE משולבת עם גישה 2-פוטן הדמיה לחקור את הדינמיקה של תהליך הלבלב האנושי הלבלב engraftment על ידי הקלטות רציפות וחוזרות על עצמן על שתלי אי בודדים עד 10 חודשים לאחר ההשתלה. תכונות הדמיה multiphoton של עומקי הדמיה גדולים יותר והפחתת פוטו-בליך הכולל ונזק לצילום להתגבר על מגבלות ההדמיה של מיקרוסקופ confocal11. כימות של הדמיית פלורסנט כרוכה במספר שלבים, כולל הכנת מדגם איון, השתלת איון, רכישת תמונה, סינון תמונות להסרת רעש איון או רקע, פילוח, כימות וניתוח נתונים. השלב המאתגר ביותר הוא בדרך כלל חלוקה למחיצות או פילוח של תמונה לחלקים או לאזורים מרובים. הדבר עשוי לכלול הפרדת אות מרעש רקע, או אזורי קיבוץ באשכולות של voxels בהתבסס על קווי דמיון בצבע או צורה כדי לזהות ולתייג voxels של אמצעי אחסון תלת-מית-מיוידי המייצג כלי דם של איון, לדוגמה. לאחר המקטע, סטטיסטיקה כגון גדלי אמצעי אחסון של אובייקט היא בדרך כלל פשוטה לחילוץ. מסופקת שיטה לכמת ולחילוץ של נתוני ההדמיה, כגון פילוח ופריט חזותי של נתונים. תשומת לב מיוחדת משולמת להסרת autofluorescence איונים אנושיים והבחנה בין כלי דם איון כמוסה איון ויוצרים תאים נמען.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8323001</td>
			<td>used for isofluran anasthesia during surgery and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-induction chamber 1.4 L</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8329002</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas routing switch</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8433005</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AngioSense 680 EX</td>
			<td>Percin Elmer</td>
			<td>NEV10054EX</td>
			<td>imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes assemblies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml</td>
			<td>Schering-Plough Europ&#233;</td>
			<td>64022</td>
			<td>fluid, for pain relief</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>321242C</td>
			<td>used together with Aspirator tubes assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Texas Red (TR), 70kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1830</td>
			<td>imaging agent for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cannula, blunt end , 25 G</td>
			<td>BVI Visitec/BD</td>
			<td>BD585107</td>
			<td>custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45&#8304;), tip tapered to 30 G (0.3mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81242</td>
			<td>Plunger type gas-tight syringe for islet injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Head holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-UST-2 Solid Universal Joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>UST-2</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-custom made metal plate for head-holder assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Dumont #5, straight</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>0207-5TI-PS or 0208-5-PS</td>
			<td>attached to UST-2 (custom made)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad, custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>taped to the stereotaxic platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human islet culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-CMRL 1066</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td>cell culture media for human islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HEPES</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-L-glutamin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Gentamycin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Fungizone</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ciproxfloxacin</td>
			<td>Bayer healthcare AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Imaris 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Aquisition software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>ZEN 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1010364937</td>
			<td>used to keep animals warm in the wake-up cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Isoflo</td>
			<td>Abott Scandinavia/Apotek</td>
			<td></td>
			<td>fluid, for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange</td>
			<td>BD</td>
			<td>10442204</td>
			<td>used as scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 90mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Photon/confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-LSM7 MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ti:Sapphire laser Tsunami</td>
			<td>Spectra-Physics, Mai Tai</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET710/40m (Angiosense 680)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>288003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET645/65m-2p (TR)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC528423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET525/50 (GFP)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET610/75 (tomato)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-main beam splitter T680lpxxr</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T680lpxxr</td>
			<td>Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)</td>
			<td>Smiths Medical Danmark</td>
			<td>800/100/120</td>
			<td>to connect with Hamilton syringe and eye canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Model SMZ645, for islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (Flourescence)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for islet graft imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ100 Multizoom</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>wide field and long distance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 1x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 4x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HG Manual New Intensilight</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block TEXAS RED</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>contains EX540-580, DM595 and BA600-660</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block G-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX510-560, DM575 and BA590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block B-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX450-490, DM505 and BA520)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1-ml, Omnitix</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>for Buprenorphine injection, used with 27 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber

הדמיה תאי בטא הוא צעד מפתח לקראת הבנת השתלת איון. למרות פלטפורמות הדמיה שונות להקלטה של ביולוגיה תא בטא פותחו ומנוצלים vivo, הם מוגבלים במונחים של מתן רזולוציה תא יחיד והקלטות אורכיות רציפות. בגלל השקיפות של הקרנית, התא הקדמי של העין (ACE) בעכברים מתאים היטב ללמוד ביולוגיה של תאי אי הלבלב האנושי והעכבר. הנה תיאור של איך גישה זו יכולה לשמש לביצוע הקלטות אורכיות רציפות של השתלה ו revascularization של שתלים בודדים איון אנושי. שתלי אייון אנושיים מוכנסים לתוך ACE, באמצעות NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26סורtm4-Rag2-/- עכבריםנממענים. הדבר מאפשר חקירה של הרחבת תאי הנמען לעומת תאי התורם ותרומתם של תאי הנמען בקידום האנקפולציה וסקולריזציה של השתל. יתר על כן, גישה שלב אחר שלב לניתוח תמונה וכמת של נפח האי או כלי דם מחולקים וקפסולת איון ויוצרים תאים נמען מתואר.

איונים אנושיים לא מתויגים הושתלו ב-ACE של ה-NOD הנשי בן ה-8 שבועות. (Cg)-Gt(ROSA)26סורtm4-Rag2-/-(NOD. רוזה- עגבניה. עכברי נמען Rag2./). כדי למנוע דחיית רקמות אנושיות, עכברי נוקאאוט של Rag2 לא חיסוניים נבחרו נמעני. בעכברים טרנסגניים אלה, כל התאים והרקמות הביעו חלבון פלואור...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

מטרת הפרוטוקול היא לעקוב באופן רציף אחר הדינמיקה של תהליך הלבלב האנושי ועל הפונדקאי התורם לעומת תאי התורם. זה מושגת על ידי השתלת איונים אנושיים לתוך התא הקדמי של העין (ACE) של NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-נמען העכבר ואחריו הדמיה חוזרת של 2 פוטין.

אורכי בהדמיית Vivo וכמת של השתלת אי הלבלב האנושי ותורם תאים מארחים בתא העין הקדמית

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

ה- ACE הוא אתר הדמיה אופטימלי. הוא תומך לחזור על זה בהדמיה ארוכת טווח של ויוו של תאי איון על מנת ללמוד את תפקודם ואת הכדאיות שלהם במצב השתלה. זה יכול גם להיות מורחב ללמוד היבטים אחרים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים בזמן אמת.היתרון של טכניקת ACE טמון בעובדה כי אותם איונים אנושיים בודדים הלבלב ניתן לעקוב באופן לא פולשני עם רזולוציה תת תאית לתקופה ממושכת של זמן. שיעורי ההצלחה של טיפול בתחליפי תאי בטא ממשיכים להשתפר. עם זאת, הערכת היעילות של השתלת איון והישרדות ב vivo, עדיין מאתגר.שיטה זו יכולה לעזור להעריך ולמטב את התוצאות של השתלות איון. גישה זו אינה מוגבלת לאיים בלבלב בלבד. זה גם מתאים ללמוד רקמות מושפעות.לדוגמה, בסיבוכים סוכרתיים, כמו גלומרולי כליות או חתיכות כבד, רק שם כמה. כדי להתחיל למקם את העכבר על כרית חימום חמה למקם אותו במחזיק הראש ולשים על מסכת האף. השתמש באגודל ובאצבע המורה כדי להרים מעט את הראש.הדקו אותו עם החלקים המתכתיים בצדדים. מוודא כי חתיכות האוזן לתקן את הראש ישירות מתחת לאוזניים. תת עורית להזריק פתרון buprenorphine לתוך החלק האחורי של העכבר.בעדינות לסגת העפעפיים של העין להיות מושתל באמצעות מדפים קהים. פופ את העין החוצה באופן רופף לתקן את זה עם זוג פינצטה מכוסה צינור פוליאתן. לאחר העברת העפעפיים לצלחת פטרי עם PBS, להרים כ 20 עד 30 איונים ב cannular העין.באמצעות 25 מד המחט רמה כלפי מעלה, בזהירות להכניס את הקצה לתוך הקרנית ולעשות חתך אחד לאורך. בזהירות להרים את הקרנית עם cannula טעון מראש עם איונים, ולאט לאט לשחרר את איונים לתוך העין. לאט לסגת cannula ולהחיל ג'ל עיניים על העין.לאחר 10 דקות, להסיר את המדפים, מחזיק את העפעף והחזר את העין למצבו הרגיל. להדמיה של איונים אנושיים מושתלים עם שני מיקרוסקופ פוטון, מניחים את פלטפורמת מחזיק הראש מתחת למיקרוסקופ ומנהלים ג'ל לעיניים על העין כנוזל טבילה בין הקרנית לעדשה. מקם את העין מתחת למטרה ודמיין את איי האדם המושתלים כמתואר בכתב היד של הטקסט.להסרת השפע האוטומטי, עבור אל הכרטיסיה עיבוד תמונה, בחר אריתמטיקה של ערוץ והקלד ערוץ אחד פחות ערוץ 2. פעולה זו יוצרת ערוץ חדש 4. שנה את שמו לסקולטורה.חזור על תהליך זה והקלד ערוץ 3 מינוס ערוץ 2 כדי ליצור ערוץ חדש חמש ולשנות את שמו עגבניות כל. כדי להגדיר את האיום באופן ידני ליצור משטח חדש ולבחור לערוך באופן ידני באשף. שמרו על המצביע במצב בחירה ובתצוגת תלת-מימד.ולחץ על עוצמה כדי להמחיש מקטעים. בכרטיסיה ציור בחר מיתאר ולחץ על צייר כדי להתחיל לצייר קווי מתאר סביב גבול איון, החל ממיקום פרוסה אחד. לאחר מכן עברו למיקום פרוסה חדש וחזרו על קווי המתאר של הציור.סיים עם הפרוסה האחרונה בחלק העליון של איון וסוף על ידי לחיצה על הכרטיסיה ליצור משטח. הקטע הבא, כלי הדם של איון ונוהורסצנטיות עגבניות איון באמצעות מסכת איון. בחרו בעצם מסיכת איון שהוגדר קודם לכן, עברו ללשונית העריכה ולחצו על הכרטיסייה 'מסיכה סך הכל', שפותחת חלון חדש.בחרו בערוץ כלי הדם בתפריט הנפתח לבחירת ערוצים והפעילו אפשרויות ערוץ כפול לפני החלת המסיכה. קבוע בפנים, בחוץ ולהגדיר voxels מחוץ לפני השטח כדי 0.000 אשר יוצר ערוץ חדש שש. שנה את שם כלי הדם של איון הערוץ הזה.חזור על השלבים הקודמים ובחר את העגבניות הכל בתפריט הנפתח של בחירת הערוץ, כדי ליצור את הערוץ החדש, לשנות את שמו, עגבניית איון. לאחר מכן צרו משטח חדש בתפריט הסצנה ובחרו יצירה אוטומטית באשף. הגדר את ערוץ המקור כלי הדם של איון שנוצר בעבר ובחר חיסור רקע.באופן אופציונלי, השתמש במסננים. לדוגמה, בחר עוצמה וכוונן את המסנן בחלון, שיכול להסיר אובייקטי שירות נבחרים. סיים את האשף ותן שם לעצם פני השטח החדש, כלי הדם של איון.באובייקט שירות כלי הדם של איון עבור אל כרטיסיית העריכה ולחץ על הכרטיסיה מסיכת הכל, הפותחת חלון חדש. בחרו בערוץ עגבניות איון בתפריט הנפתח לבחירת ערוצים והגדירו את הווקסלים מחוץ למשטח ל-10.000 שיוצר ערוץ חדש. שנה את שמו של כלי הדם עגבניות איון ערוץ זה.כדי למקטע אות פלואורסצנטי של כמוסת עגבניות, בחרו אריתמטיקה של ערוץ בכרטיסיית עיבוד התמונה והקלדו ערוץ 7 מינוס ערוץ 8 היוצר את הערוץ החדש. שנה את שמה לכמוסת עגבניות. צור משטח חדש כפי שתואר בעבר ובחר ערוצי מקור, כלי דם עגבניות איון או כמוסה עגבניות באשף.לאחר מכן בצע חיסור רקע. פתח את קובץ ה- backscatter של האיון וצור משטח חדש. באשף, בחר יצירה אוטומטית והגדר אזור עניין.במידת הצורך, התאימו את הסף בעוצמה מוחלטת. ניתן ללחוץ או לכבות את עצם פני השטח, כדי להצליב בעוצמת הערוץ המתאימה. לאחר שתסיים, סגור את האשף.לבסוף, בצע כימות, בחר אובייקט משטח שנוצר בתפריט הסצנה ועבור אל הכרטיסיה סטטיסטיקה. כדי לאחזר נתוני אמצעי אחסון מפורטים, בחר את הכרטיסיה המפורטת ובחר ערכים ואמצעי אחסון ספציפיים מהתפריט הנפתח. כדי לאחזר ערך אמצעי אחסון כולל עבור אל הכרטיסיה המפורטת ובחר ערכים ממוצעים.פרוטוקול זה שימש להשתלת איונים אנושיים שאינם מסומנים בתא הפנימי של העין של עכברים נמען פלואורסצנטי אדום בן שמונה שבועות. תוכנת הדמיה אינטראקטיבית שימשה אז כדי לחלץ נתונים כמותיים מהתמונות. בהדמיית ויבו פלואורסנס, שתלי איון האדם נפגעו על ידי הפרעה משמעותית משפעת אוטומטית של רקמות שלא נצפתה בעכברים שתלי איון.כדי לשפר את יחס האות לרעש, ערוץ השפע האוטומטי הוחסך. לאחר מכן הוגדר ידנית גבול איון הנקרא מסיכת איון והערוצים המתאימים. לבסוף, פילוח אות העגבניות לתוך כלי הדם העפעפיים ואת קפסולת העפעפיים ואת עיבוד פני השטח הסופי שימש כדי לחלץ נתונים כמותיים.כאן כמפגש הדמיה אורך מייצג של אותו שתל איון אנושי בשבועיים, חודשיים, חמישה חודשים ושמונה חודשים לאחר ההשתלה. תמונות MIP של נתונים גולמיים שהוקלטו במקור, תמונות מעובדות לאחר הסרת שפעת אוטומטית של איון ואובייקטי איון מקופלים מוצגים. בעת ביצוע הזרקת העפעפיים, הקפד לטעון מראש את איונים בנפח קטן ולהשתמש בזרועות אור תאומות גמישות במיקרוסקופ הסטריאו שלך, כדי להדגיש את שטח תא העין על מנת להזריק בהצלחה את איונים לתוך ACE.בעקבות ההדמיה in vivo ניתן לתקן את העיניים ולתחקר עוד יותר על כתמי נוגדנים והיסטולוגיה קונבנציונלית. טכניקה זו שימושית מאוד למחקרים תפקודיים של איונים אנושיים בודדים בזמן אמת ובתנאים פיזיולוגיים, במיוחד בהקשר של כלי דם, כדאיות ומחקרים מטבוליים.

Research

JoVE Journal

Medicine

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

השתלה ללשכה הקדמית של העין לאורך, לא פולשני<em&gt; בחי</em&gt; הדמיה ברזולוצית תא בודד בזמן אמת

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

בדימות אופטי Vivo של גידולים במוח ודלקת פרקים באמצעות פלורסנט SapC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In vivo ההדמיה ומעקב של טכנציום-99m תווית תאי גזע מח העצם mesenchymal בסוסי Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

אֹרכִּי<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

לייזר דופלר: כלי למדידת הלבלב איון Microvascular Vasomotion In Vivo

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...