Name: longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber
Uploaded: 2020-06-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dal Consiglio svedese per la ricerca, dall'Area strategica di ricerca Exodiab, dal Dnr 2009-1039, dalla Fondazione svedese per la ricerca strategica Dnr IRC15-0067 alla LUDC-IRC, alla Royal Physiographic Society di Lund, Al diabetesf-rbundet e Barndiabetesf-rbundet.

Il Comitato Etico Regionale di Lund, Svezia, ha approvato lo studio secondo la legge riguardante la revisione etica della ricerca che coinvolge gli esseri umani. Esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in stretta conformità con l'etica svedese degli esperimenti sugli animali e approvati dai comitati etici di Malma e Lund. NOD immunodeficiente di 6-8 settimane. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-pomodoro. Rag2-/-) topi ricevente son...

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Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).</li><li>Iwasaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+intolerance+during+prolonged+sevoflurane+anaesthesia.">Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia.</a> Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).</li><li>Hamilton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+its+applications+in+fluorescent+microscopy+imaging.">Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging.</a> Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).</li><li>Michelotti, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET/MRI+enables+simultaneous+in+vivo+quantification+of+beta-cell+mass+and+function.">PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function.</a> Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Allogeneic+Islet+Grafts+in+Nonhuman+Primates+Using+MRI.">Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI.</a> Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).</li><li>Gotthardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+beta+cells+by+PET+imaging:+why+clinical+implementation+has+never+been+closer.">Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer.</a> Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).</li><li>Joosten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Pancreatic+beta+Cell+Mass+in+Vivo+with+Exendin+SPECT+during+Hyperglycemia+and+Severe+Insulitis.">Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis.</a> Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).</li><li>Virostko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+mouse+models+quantifies+beta+cell+mass+in+the+pancreas+and+after+islet+transplantation.">Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).</li></ol>

Viene presentato un metodo per studiare il processo di innesto delle cellule dell'isolotto pancreatico umano osservando il coinvolgimento del tessuto del ricevente e del donatore. Dopo un intervento chirurgico mini-invasivo che impianta isolotti umani nella camera anteriore di un occhio di topo immunodeficiente, il topo si riprende rapidamente pochi minuti dopo l'intervento chirurgico. La procedura viene eseguita su un occhio. Generalmente, da 5-7 giorni dopo la postimplantazione in poi la cornea è sufficientemente guar...

Il diabete mellito descrive un gruppo di malattie metaboliche caratterizzate da livelli elevati di glucosio nel sangue come risultato di una produzione insufficiente di insulina da perdita o disfunzione delle cellule beta delle isole pancreatiche, spesso accompagnate da insulino-resistenza. Il diabete di tipo 1 (T1D) e il diabete di tipo 2 (T2D) sono malattie complesse in cui la progressiva disfunzione delle cellule beta causa lo sviluppo della malattia. T1D è precipitato da un attacco autoimmune sulle cellule beta, mentre T2D è considerato guidato da fattori metabolici, anche se con crescente evidenza di infiammazione sistemica di bassogrado 1. Il trapianto di isolotti umani donati, in particolare ai pazienti affetti da T1D, offre il potenziale per fornire un controllo glicemico fisiologico. Tuttavia, la carenza di donatori di tessuti e la scarsa innesto di isoloti ha impedito che il trapianto di isolotto diventasse un'opzione terapeutica tradizionale. Una parte sostanziale dell'innesto dell'isolotto funzionale viene persa nell'immediato periodo post-trapianto (24-48 h) a causa dell'ambiente di ospite ipossico, infiammatorio e immunogenico2,3. Per valutare l'efficienza dei metodi di intervento per il miglioramento della sopravvivenza delle isore, è necessario un monitoraggio continuo di tali trapianti.
Tecniche in vivo per immaginiare e tracciare il destino delle isole pancreatiche umane trapiantate dopo il trapianto rimane ancora una sfida per la ricerca suldiabete 4,5. Ad oggi, le tecniche di imaging non invasive, tra cui la tomografia a emissione di positroni (PET), la risonanza magnetica (RTI) o gli ultrasuoni (US) mostrano il potenziale per la quantificazione e la valutazione funzionale delle isole trapiantate in condizionisperimentali 5. Tuttavia, date le piccole dimensioni degli isocchi, le misurazioni quantitative di tali modalità soffrono di una risoluzione insufficiente. La camera anteriore dell'occhio (ACE) come sito di trapianto per l'osservazione è una promettente soluzione di imaging non invasivo che offre una risoluzione spaziale efficace e un monitoraggio frequente per lunghi periodidi tempo 6. Questo metodo è stato sfruttato con successo per studiare la biologia delle isole dei topi (recensito in Yang et al.7), le risposte immunitarie autoimmuni8, così come l'innesto dell'isolottoumano 9,10.
Qui il metodo di trapianto ACE si combina con un approccio di imaging a 2 fotoni per studiare la dinamica del processo di innesto dell'isolotto pancreatico umano mediante registrazioni continue e ripetute su singoli innesti di isolotto fino a 10 mesi dopo il trapianto. Le proprietà di imaging multifoto di maggiori profondità di imaging e riduzione del fotobleaching complessivo e dei danni fotografici superano i limiti di imaging della microscopia confocale11. La quantificazione dell'imaging fluorescente comporta diverse fasi, tra cui la preparazione del campione di isolotto, il trapianto di isolotto, l'acquisizione di immagini, il filtraggio delle immagini per rimuovere il rumore o lo sfondo delle isole, la segmentazione, la quantificazione e l'analisi dei dati. Il passaggio più impegnativo è in genere il partizionamento o la segmentazione di un'immagine in più parti o aree. Ciò potrebbe comportare la separazione del segnale dal rumore di fondo o il raggruppamento di regioni di voxel in base a somiglianze di colore o forma per rilevare ed etichettare i voxel di un volume 3D che rappresenta la vascolatura dell'isolotto, ad esempio. Una volta segmentate, le statistiche, ad esempio le dimensioni del volume degli oggetti, sono in genere semplici da estrarre. Fornito è un metodo per la quantificazione e l'estrazione dei dati di imaging, ad esempio la segmentazione e la visualizzazione dei dati. Particolare attenzione è prestata alla rimozione dell'autofluorescenza negli isolotti umani e alla distinzione tra vascolatura dell'isolotto e capsula isolotta che forma le cellule riceventi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8323001</td>
			<td>used for isofluran anasthesia during surgery and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-induction chamber 1.4 L</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8329002</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas routing switch</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8433005</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AngioSense 680 EX</td>
			<td>Percin Elmer</td>
			<td>NEV10054EX</td>
			<td>imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes assemblies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml</td>
			<td>Schering-Plough Europ&#233;</td>
			<td>64022</td>
			<td>fluid, for pain relief</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>321242C</td>
			<td>used together with Aspirator tubes assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Texas Red (TR), 70kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1830</td>
			<td>imaging agent for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cannula, blunt end , 25 G</td>
			<td>BVI Visitec/BD</td>
			<td>BD585107</td>
			<td>custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45&#8304;), tip tapered to 30 G (0.3mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81242</td>
			<td>Plunger type gas-tight syringe for islet injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Head holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-UST-2 Solid Universal Joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>UST-2</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-custom made metal plate for head-holder assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Dumont #5, straight</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>0207-5TI-PS or 0208-5-PS</td>
			<td>attached to UST-2 (custom made)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad, custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>taped to the stereotaxic platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human islet culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-CMRL 1066</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td>cell culture media for human islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HEPES</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-L-glutamin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Gentamycin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Fungizone</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ciproxfloxacin</td>
			<td>Bayer healthcare AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Imaris 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Aquisition software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>ZEN 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1010364937</td>
			<td>used to keep animals warm in the wake-up cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Isoflo</td>
			<td>Abott Scandinavia/Apotek</td>
			<td></td>
			<td>fluid, for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange</td>
			<td>BD</td>
			<td>10442204</td>
			<td>used as scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 90mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Photon/confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-LSM7 MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ti:Sapphire laser Tsunami</td>
			<td>Spectra-Physics, Mai Tai</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET710/40m (Angiosense 680)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>288003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET645/65m-2p (TR)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC528423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET525/50 (GFP)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET610/75 (tomato)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-main beam splitter T680lpxxr</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T680lpxxr</td>
			<td>Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)</td>
			<td>Smiths Medical Danmark</td>
			<td>800/100/120</td>
			<td>to connect with Hamilton syringe and eye canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Model SMZ645, for islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (Flourescence)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for islet graft imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ100 Multizoom</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>wide field and long distance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 1x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 4x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HG Manual New Intensilight</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block TEXAS RED</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>contains EX540-580, DM595 and BA600-660</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block G-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX510-560, DM575 and BA590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block B-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX450-490, DM505 and BA520)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1-ml, Omnitix</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>for Buprenorphine injection, used with 27 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber

L'imaging delle cellule beta è un passo fondamentale verso la comprensione del trapianto di islet. Anche se diverse piattaforme di imaging per la registrazione della biologia delle cellule beta sono state sviluppate e utilizzate in vivo,sono limitate in termini di possibilità di risoluzione a singola cellula e registrazioni longitudinali continue. A causa della trasparenza della cornea, la camera anteriore dell'occhio (ACE) nei topi è adatta a studiare la biologia delle cellule dell'isolotto pancreatico umano e topo. Ecco una descrizione di come questo approccio può essere utilizzato per eseguire registrazioni longitudinali continue di innesto e revascolarizzazione di singoli innesti di isolotto umano. Gli innesti di isolotto umano vengono inseriti nell'ACE, utilizzando NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-topi come destinatari. Ciò consente di sondare l'espansione delle cellule del ricevente rispetto a quelle del donatore e il contributo delle cellule riceventi nella promozione dell'incapsulamento e della vascolarizzazione dell'innesto. Inoltre, viene delineato un approccio passo-passo per l'analisi delle immagini e la quantificazione del volume dell'isolotto o della vascolatura segmentata e della capsula dell'isolotto che formano le cellule riceventi.

Le isole umane non etichettate sono state trapiantate nell'ACE di NOD femmina di 8 settimane. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA- pomodoro. Rag2- / )topi destinatari. Per prevenire il rigetto del tessuto umano, sono stati scelti come destinatari i topi da urlo Rag2 immunodeficienti. In questi topi transgenici, tutte le cellule e i tessuti hanno espresso una proteina di fluorescenza di pomodoro mirata alla membrana (mT) che consente una chi...

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Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

L'obiettivo di questo protocollo è quello di monitorare continuamente le dinamiche del processo di innesto dell'isolotto pancreatico umano e delle cellule che contribuiscono tra l'ospite e il donatore. Ciò si ottiene trapiantando isolotti umani nella camera anteriore dell'occhio (ACE) di un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-destinatario del mouse seguito da ripetute immagini a 2 fotoni.

Longitudinale in Vivo Imaging e quantificazione dell'isolotto pancreatico umano Innesto e contribuendo cellule ospitanti nella camera occhio anteriore

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

L'ACE è un mirino di imaging ottimale. Supporta di ripeterlo nell'imaging in vivo a lungo termine di cellule isolotti al fine di studiarne la funzione e la vitalità in una situazione di innesto. Può anche essere esteso per studiare altri aspetti in condizioni fisiologiche e patologiche in tempo reale.Il vantaggio della tecnica ACE sta nel fatto che gli stessi singoli isolotti pancreatici umani possono essere seguiti in modo non invasivo con risoluzione subcellulare per un lungo periodo di tempo. I tassi di successo della terapia sostitutiva delle cellule beta continuano a migliorare. Tuttavia, valutare l'efficienza dell'innesto di isolotto e la sopravvivenza in vivo, rimane ancora impegnativo.Questo metodo potrebbe aiutare a valutare e ottimizzare i risultati dei trapianti di isolotto. Questo approccio non si limita solo agli isolotti pancreatici. È anche adatto per studiare i tessuti colpiti.Ad esempio, nelle complicanze diabetiche, come glomeruli renali o pezzi di fegato, solo per citane alcuni. Per iniziare posizionare il mouse su una calda pastiglia riscaldante posizionarlo nel supporto della testa e indossare la maschera del naso. Utilizzare il pollice e l'indice per sollevare leggermente la testa.Fissalo con i pezzi metallici sui lati. Assicurarsi che gli auricolari fissino la testa direttamente sotto le orecchie. Iniettare per via sottocutanea la soluzione di buprenorfina nella parte posteriore del mouse.Ritrarre delicatamente le palpebre dell'occhio da trapiantare con force contundenti. Fai uscire l'occhio e fissalo liberamente con un paio di pinzette coperte da un tubo di polietilene. Dopo aver trasferito le palpebre in una piastra di Petri con PBS, raccogliere circa 20-30 isolotti nell'occhio cannular.Utilizzando un livello dell'ago calibro 25 verso l'alto, inserire con cura la punta nella cornea e fare una singola incisione laterale. Sollevare con cura la cornea con la cannula precaricata con isolotti e rilasciare lentamente gli isolotti nell'occhio. Ritrarre lentamente la cannula e applicare il gel per gli occhi sull'occhio.Dopo 10 minuti, rimuovere le forcep, tenendo la palpebra e rimettere l'occhio nella sua posizione normale. Per l'imaging di isolotti umani impiantati con due microscopia fotonica, posizionare la piattaforma portacapo al microscopio e somministrare gel per gli occhi sull'occhio come liquido ad immersione tra la cornea e l'obiettivo. Posizionare l'occhio sotto l'obiettivo e l'immagine degli isolotti umani impiantati come descritto nel manoscritto testuale.Per rimuovere l'autofluorescenza, passare alla scheda elaborazione immagini, scegliere aritmetica dei canali e digitare il canale uno meno il canale due. Questo crea un nuovo canale quattro. Rinominarlo vasculature.Ripetere questo processo e digitare il canale tre meno canale due per creare un nuovo canale cinque e rinominarlo pomodoro tutto. Per definire manualmente l'isolotto, creare una nuova superficie e scegliere Modifica manualmente nella procedura guidata. Mantenere il puntatore in modalità di selezione e in visualizzazione 3D.E fai clic sul volume per visualizzare le sezioni. Nella scheda disegno scegliete il contorno e fate clic su Disegna per iniziare a disegnare i contorni attorno al bordo dell'isolotto, a partire dalla posizione di una sezione. Quindi spostate in una nuova posizione della fetta e ripetete i contorni del disegno.Completate con l'ultima fetta nella parte superiore dell'isolotto e terminate facendo clic sulla scheda Crea superficie. Segmento successivo, vascucolatura isolotto e fluorescenza del pomodoro isolotto utilizzando maschera isolotto. Scegliere l'oggetto maschera isolotto definito in precedenza, passare alla scheda di modifica e fare clic sulla maschera tutta la scheda, che apre una nuova finestra.Scegliete il canale di vascucolatura nel menu a discesa selezione canale e attivate il canale duplicato delle opzioni prima di applicare la maschera. Costante all'interno, all'esterno e impostare i voxel fuori dalla superficie su 0,000 che crea un nuovo canale sei. Rinominare questa vascucolatura dell'isolotto del canale.Ripetete i passaggi precedenti e scegliete il pomodoro tutto nel menu a discesa selezione canale, per creare il nuovo canale, rinominarlo, pomodoro isolotto. Create quindi una nuova superficie nel menu scena e scegliete creazione automatica nella procedura guidata. Impostate il canale di origine sulla vascucolatura isolotto creata in precedenza e scegliete la sottrazione di sfondo.Facoltativamente, utilizzare i filtri. Ad esempio, scegliere volume e regolare il filtro nella finestra, che può rimuovere gli oggetti servizio selezionati. Completate la procedura guidata e denominate il nuovo oggetto superficie, la vascucolatura isolotto.Nell'oggetto servizio vasculature isolotto passare alla scheda di modifica e fare clic sulla scheda maschera tutta, che apre una nuova finestra. Scegliete il canale del pomodoro isolotto nel menu a discesa selezione canale e impostate voxel fuori superficie su 10.000 che crea un nuovo canale. Rinominare questa vascucolatura di pomodoro isolotto del canale.Per segmentare il segnale fluorescente della capsula di pomodoro, scegliete le aritmetiche dei canali nella scheda di elaborazione delle immagini e digitate il canale sette meno il canale otto creando il nuovo canale. Rinominarlo capsula di pomodoro. Create una nuova superficie come descritto in precedenza e scegliete i canali sorgente, la vascucolatura di pomodoro isolotto o la capsula di pomodoro nella procedura guidata.Quindi eseguire la sottrazione di sfondo. Aprite il file di backscatter isolotto e create una nuova superficie. Nella procedura guidata scegliere creazione automatica e definire l'area di interesse.Se necessario, regolare la soglia in intensità assoluta. L'oggetto superficie può essere cliccato su o fuori, per eseguire il crosscheck con l'intensità del canale corrispondente. Al termine della chiusura della procedura guidata.Infine, eseguire la quantificazione, selezionare un oggetto superficie creato nel menu della scena e passare alla scheda statistiche. Per recuperare i dati dettagliati del volume, scegliete la scheda dettagliata e selezionate valori e volume specifici dal menu a discesa. Per recuperare il valore totale del volume, passare alla scheda dettagliata e scegliere i valori medi.Questo protocollo è stato utilizzato per trapiantare isolotti umani non etichettati nella camera interna dell'occhio di topi riceventi fluorescenti rossi di otto settimane. Il software di imaging interattivo è stato quindi utilizzato per estrarre dati quantitativi dalle immagini. Imaging a fluorescens in vivo, gli innesti di isolotto umano sono stati compromessi da interferenze significative dall'autofluorescenza tissutale che non sono state osservate negli innesti di isolotto dei topi.Per migliorare il rapporto segnale/rumore, il canale di autofluorescenza è stato sottratto. Quindi il limite dell'isolotto chiamato maschera di isolotto e i canali corrispondenti sono stati definiti manualmente. Infine, la segmentazione del segnale del pomodoro nella vascolarizzazione delle palpebre e nella capsula delle palpebre e nella resa superficiale finale è stata utilizzata per estrarre dati quantitativi.Qui come sessione di imaging longitudinale rappresentativo dello stesso innesto di isolotto umano a due settimane, due mesi, cinque mesi e otto mesi dopo il trapianto. Vengono visualizzate immagini MIP di dati grezzi originariamente registrati, immagini elaborate dopo la rimozione dell'autofluorescenza dell'isolotto e un isolotto segmentato. Quando si esegue l'iniezione palpebrale, assicurarsi di precaricare gli isolotti in un piccolo volume e utilizzare bracci di luce doppia flessibili sul microscopio stereo, per evidenziare lo spazio della camera degli occhi al fine di iniettare con successo gli isolotti nell'ACE.Dopo l'imaging in vivo gli occhi possono essere fissati e ulteriormente studiati per la colorazione degli anticorpi e l'istologia convenzionale. Questa tecnica è molto utile per studi funzionali di singoli isolotti umani in tempo reale e in condizioni fisiologiche, specialmente nel contesto della vascolarizzazione, della vitalità e degli studi metabolici.

Research

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