Name: longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber
Uploaded: 2020-06-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

Denne studien ble støttet av Det svenske forskningsrådet, Strategic Research Area Exodiab, Dnr 2009-1039, Det svenske stiftelsen for strategisk forskning Dnr IRC15-0067 til LUDC-IRC, Royal Physiographic Society i Lund, Diabetesförbundet og Barndiabetesförbundet.

Den regionale etikkkomiteen i Lund i Sverige godkjente studien etter loven om etisk gjennomgang av forskning som involverer mennesker. Dyreforsøk ble utført i henhold til den svenske etikken til dyreforsøk og godkjent av etikkkomiteene i Malmö og Lund. 6 til 8 uker gamle immunsviktede NOD. (Cg)-Gt (ROSA) 26Sortm4-Rag2-/- (NIKK. ROSA- tomat. Rag2-/-) mottakermus ble brukt som mottakere for transplantasjon av menneskelige holmer<sup class="xr...

<ol>
	<li>Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus:+The+epidemic+of+the+century.">Diabetes mellitus: The epidemic of the century.</a> World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).</li><li>Kanak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+response+in+islet+transplantation.">Inflammatory response in islet transplantation.</a> International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).</li><li>Nanji, S. A., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pancreatic+islet+transplantation+in+humans.">Advances in pancreatic islet transplantation in humans.</a> Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).</li><li>Malaisse, W. J., Maedler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+the+beta+cells+of+the+islets+of+Langerhans.">Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).</li><li>Kim, D., Jun, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+of+Transplanted+Pancreatic+Islets.">In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).</li><li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+high-resolution+in+vivo+imaging+of+cell+biology+in+the+anterior+chamber+of+the+mouse+eye.">Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye.</a> Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).</li><li>Yang, S. N., Berggren, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eye+as+a+novel+imaging+site+in+diabetes+research.">The eye as a novel imaging site in diabetes research.</a> Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).</li><li>Schmidt-Christensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamics+of+CD11c(+)+cells+and+Foxp3(+)+cells+in+progressive+autoimmune+insulitis+in+the+NOD+mouse+model+of+type+1+diabetes.">Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes.</a> Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).</li><li>Berclaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+three-dimensional+visualisation+of+autoimmune+diabetes+by+functional+optical+coherence+imaging.">Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging.</a> Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).</li><li>Nilsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+fibroblasts+reconstitute+the+peri-islet+membrane:+a+longitudinal+imaging+study+of+human+islet+grafting+and+revascularisation.">Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation.</a> Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).</li><li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , 11-24 (2013).</li><li>Goto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+of+the+automated+method+for+human+islet+isolation+and+presentation+of+a+closed+system+for+in+vitro+islet+culture.">Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture.</a> Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).</li><li>Jansson, L., Carlsson, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+vascular+function+after+transplantation+of+pancreatic+islets.">Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets.</a> Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).</li><li>Konstantinova, I., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+development:+learning+from+pancreatic+islets.">Microvascular development: learning from pancreatic islets.</a> Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).</li><li>Fransson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+support+endothelial+cell+interactions+in+an+intramuscular+islet+transplantation+model.">Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model.</a> Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).</li><li>Nyqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+islet+endothelial+cells+in+pancreatic+islet+revascularization.">Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization.</a> Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).</li><li>Nair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+common+anesthetics+on+eye+movement+and+electroretinogram.">Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram.</a> Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).</li><li>Iwasaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+intolerance+during+prolonged+sevoflurane+anaesthesia.">Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia.</a> Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).</li><li>Hamilton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+its+applications+in+fluorescent+microscopy+imaging.">Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging.</a> Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).</li><li>Michelotti, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET/MRI+enables+simultaneous+in+vivo+quantification+of+beta-cell+mass+and+function.">PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function.</a> Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Allogeneic+Islet+Grafts+in+Nonhuman+Primates+Using+MRI.">Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI.</a> Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).</li><li>Gotthardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+beta+cells+by+PET+imaging:+why+clinical+implementation+has+never+been+closer.">Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer.</a> Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).</li><li>Joosten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Pancreatic+beta+Cell+Mass+in+Vivo+with+Exendin+SPECT+during+Hyperglycemia+and+Severe+Insulitis.">Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis.</a> Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).</li><li>Virostko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+mouse+models+quantifies+beta+cell+mass+in+the+pancreas+and+after+islet+transplantation.">Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).</li></ol>

En metode presenteres for å studere den menneskelige pankreasevevecelletransplantingsprosessen ved å observere involvering av mottaker og donorvev. Etter en minimal invasiv kirurgi implanterer menneskelige holmer inn i fremre kammer av et immunsviktfullt museøye, gjenoppretter musen raskt i løpet av minutter etter operasjonen. Prosedyren utføres på ett øye. Vanligvis, fra 5-7 dager postimplantasjon og utover hornhinnen er tilstrekkelig helbredet til å utføre intravital avbildning.
I d...

Diabetes mellitus beskriver en gruppe metabolske sykdommer preget av forhøyede nivåer av blodsukker som følge av utilstrekkelig insulinproduksjon fra tap eller dysfunksjon av bukspyttkjertelens betaceller, ofte ledsaget av insulinresistens. Type 1 (T1D) og type 2 diabetes (T2D) er komplekse sykdommer der den progressive dysfunksjonen av betacellene forårsaker sykdomsutvikling. T1D utløses av et autoimmunt angrep på betacellene, mens T2D anses å være drevet av metabolske faktorer, om enn med økende bevis på lavgradig systemisk betennelse1. Transplantasjon av donormenneskelige holmer, spesielt til T1D-pasienter, gir mulighet for å gi fysiologisk glykemisk kontroll. Mangel på vevsdonorer og dårlig holmegraftment har imidlertid forhindret at holmetransplantasjon blir et vanlig terapeutisk alternativ. En betydelig andel av det funksjonelle holmetransplantatet går tapt i den umiddelbare ettertransplantasjonsperioden (24–48 timer) på grunn av det hypoksiske, inflammatoriske, immunogene vertsmiljøet2,3. For å evaluere effektiviteten av intervensjonsmetoder for forbedring av holmeoverlevelse, er kontinuerlig overvåking av slike transplantasjoner nødvendig.
In vivo teknikker for å bilde og spore skjebnen til transplanterte menneskelige bukspyttkjertel holmer etter transplantasjon fortsatt en utfordring for diabetes forskning4,5. Hittil viser ikke-invasive bildeteknikker, inkludert positronutslippstomografi (PET), magnetisk resonansavbildning (MR) eller ultralyd (US) potensial for kvantifisering og funksjonell evaluering av transplanterte holmer under eksperimentelleforhold 5. Men gitt de små holmestørrelsene lider kvantitative målinger av disse modalitetene av utilstrekkelig oppløsning. Det fremre kammeret i øyet (ACE) som et transplantasjonssted for observasjon er en lovende ikke-invasiv bildebehandlingsløsning som tilbyr effektivt høyere romlig oppløsning og hyppig overvåking over lange tidsperioder6. Denne metoden har blitt vellykket utnyttet til å studere mus holme biologi (gjennomgått i Yang et al.7),autoimmuneimmunresponser 8, samt menneskelig holme pode9,10.
Her kombineres ACE-transplantasjonsmetoden med en 2-foton imaging tilnærming for å undersøke dynamikken i den menneskelige bukspyttkjertelen engraftment prosessen ved kontinuerlige og gjentatte opptak på individuelle holme grafts i opptil 10 måneder etter transplantasjon. Multiphoton bildeegenskaper av større bildedybder og redusert generell fotobleaching og fotoskade overvinne bildebegrensningene av konfokal mikroskopi11. Kvantifisering av fluorescerende bildebehandling innebærer flere stadier, inkludert preparat av holmeprøve, holmetransplantasjon, bildeinnsamling, bildefiltrering for å fjerne holmetøy eller bakgrunn, segmentering, kvantifisering og dataanalyse. Det mest utfordrende trinnet er vanligvis partisjonering eller segmentering av et bilde i flere deler eller regioner. Dette kan innebære å skille signal fra bakgrunnsstøy, eller klyngeområder av voxels basert på likheter i farge eller form for å oppdage og merke voxels av et 3D-volum som representerer holmevaskulatur, for eksempel. Når den er segmentert, er statistikk som objektvolumstørrelser vanligvis enkle å trekke ut. Forutsatt er en metode for kvantifisering og ekstraksjon av bildedata, for eksempel segmentering og datavisualisering. Spesiell oppmerksomhet er betalt for fjerning av autofluorescence i menneskelige holmer og skille mellom holme vaskulatur og holme kapsel danner mottakerceller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8323001</td>
			<td>used for isofluran anasthesia during surgery and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-induction chamber 1.4 L</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8329002</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas routing switch</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8433005</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AngioSense 680 EX</td>
			<td>Percin Elmer</td>
			<td>NEV10054EX</td>
			<td>imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes assemblies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml</td>
			<td>Schering-Plough Europ&#233;</td>
			<td>64022</td>
			<td>fluid, for pain relief</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>321242C</td>
			<td>used together with Aspirator tubes assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Texas Red (TR), 70kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1830</td>
			<td>imaging agent for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cannula, blunt end , 25 G</td>
			<td>BVI Visitec/BD</td>
			<td>BD585107</td>
			<td>custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45&#8304;), tip tapered to 30 G (0.3mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81242</td>
			<td>Plunger type gas-tight syringe for islet injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Head holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-UST-2 Solid Universal Joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>UST-2</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-custom made metal plate for head-holder assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Dumont #5, straight</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>0207-5TI-PS or 0208-5-PS</td>
			<td>attached to UST-2 (custom made)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad, custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>taped to the stereotaxic platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human islet culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-CMRL 1066</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td>cell culture media for human islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HEPES</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-L-glutamin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Gentamycin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Fungizone</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ciproxfloxacin</td>
			<td>Bayer healthcare AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Imaris 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Aquisition software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>ZEN 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1010364937</td>
			<td>used to keep animals warm in the wake-up cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Isoflo</td>
			<td>Abott Scandinavia/Apotek</td>
			<td></td>
			<td>fluid, for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange</td>
			<td>BD</td>
			<td>10442204</td>
			<td>used as scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 90mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Photon/confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-LSM7 MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ti:Sapphire laser Tsunami</td>
			<td>Spectra-Physics, Mai Tai</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET710/40m (Angiosense 680)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>288003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET645/65m-2p (TR)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC528423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET525/50 (GFP)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET610/75 (tomato)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-main beam splitter T680lpxxr</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T680lpxxr</td>
			<td>Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)</td>
			<td>Smiths Medical Danmark</td>
			<td>800/100/120</td>
			<td>to connect with Hamilton syringe and eye canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Model SMZ645, for islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (Flourescence)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for islet graft imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ100 Multizoom</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>wide field and long distance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 1x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 4x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HG Manual New Intensilight</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block TEXAS RED</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>contains EX540-580, DM595 and BA600-660</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block G-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX510-560, DM575 and BA590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block B-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX450-490, DM505 and BA520)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1-ml, Omnitix</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>for Buprenorphine injection, used with 27 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber

Imaging betaceller er et viktig skritt mot å forstå holmetransplantasjon. Selv om ulike bildeplattformer for registrering av betacellebiologi er utviklet og benyttet in vivo,er de begrenset når det gjelder å tillate enkeltcelleoppløsning og kontinuerlige langsgående opptak. På grunn av gjennomsiktigheten av hornhinnen, er øyets fremre kammer (ACE) hos mus godt egnet til å studere menneskelig og mus bukspyttkjertelenseindøm. Her er en beskrivelse av hvordan denne tilnærmingen kan brukes til å utføre kontinuerlige langsgående opptak av pode og revaskularisering av individuelle menneskelige holmetransplantater. Menneskelige holmetransplantater settes inn i ACE ved hjelp av NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mus som mottakere. Dette gjør det mulig for undersøkelse av utvidelse av mottaker versus donorceller og bidrag fra mottakerceller i å fremme innkapsling og vaskularisering av transplantatet. Videre er en trinnvis tilnærming for bildeanalyse og kvantifisering av holmevolumet eller segmentert vaskulatur og holmekapseldannende mottakerceller skissert.

Ikke-merkede menneskelige holmer ble transplantert inn i ACE av 8 uker gamle kvinnelige NOD. (Cg)-Gt (ROSA) 26Sortm4-Rag2-/-(NIKK. ROSA-tomat. Rag2−/−) mottakermus. For å forhindre menneskelig vevsavvisning ble immunsviktulære Rag2 knockout-mus valgt som mottakere. I disse transgene musene uttrykte alle celler og vev et membranmålrettet tomatfluorescensprotein (mT) som muliggjør klar identifisering av mottakeren og donorvevet. Gjentatt ...

Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

Målet med denne protokollen er å kontinuerlig overvåke dynamikken i den menneskelige bukspyttkjertelen og den medvirkende verten versus donorceller. Dette oppnås ved å transplantere menneskelige holmer inn i øyets fremre kammer (ACE) av et NOD. (Cg)-Gt (ROSA) 26Sortm4-Rag2-/-mus mottaker etterfulgt av gjentatt 2-foton bildebehandling.

Langsgående In Vivo Imaging og kvantifisering av humane pankreas holme pode og medvirkende vertsceller i fremre øyekammer

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

ACE er en optimal bildebehandling severdigheter. Den støtter å gjenta det i langsiktig in vivo avbildning av holmeceller for å studere deres funksjon og levedyktighet i en pode situasjon. Det kan også utvides til å studere andre aspekter under fysiologiske og patologiske forhold i sanntid.Fordelen med ACE-teknikken ligger i det faktum at de samme individuelle menneskelige bukspyttkjerteløyene kan følges ikke-invasivt med subcellulær oppløsning i lengre tid. Suksessratene for betacelleerstatningsterapi fortsetter å forbedre seg. Men å evaluere effektiviteten av holmepode og overlevelse in vivo, er fortsatt utfordrende.Denne metoden kan bidra til å vurdere og optimalisere resultatene av holmetransplantasjoner. Denne tilnærmingen er ikke bare begrenset til bukspyttkjerteløyer. Det er også godt egnet til å studere vev berørt.For eksempel, i diabetiske komplikasjoner, som nyreglomeruli eller leverbiter, bare for å nevne noen. For å begynne å plassere musen på en varm varmepute, plasser den i hodeholderen og sett på nesemasken. Bruk tommelen og pekefingeren til å løfte hodet litt.Fest den med metallbitene på sidene. Pass på at ørestykkene fikser hodet rett under ørene. Subkutant injisere buprenorfin løsning i baksiden av musen.Trekk forsiktig tilbake øyelokkene i øyet for å bli transplantert ved hjelp av stumpe tang. Pop øyet ut og løst fikse det med et par pinsett dekket med en polyeten rør. Etter å ha overført øyelokkene til en petriskål med PBS, plukk opp ca 20 til 30 holmer i øyet kanyte.Ved hjelp av en 25 gauge nål nivå oppover, forsiktig sette spissen inn i hornhinnen og gjøre en enkelt lateral snitt. Løft forsiktig hornhinnen med kanylen forhåndslastet med holmer, og slipp langsomt holmene inn i øyet. Trekk kanylen langsomt tilbake og påfør øyegel på øyet.Etter 10 minutter, fjern tangen, hold øyelokket og sett øyet tilbake til sin normale posisjon. For avbildning av implanterte menneskelige holmer med to fotonmikroskopi, plasser hodeholderplattformen under mikroskopet og administrer øyegelen på øyet som en nedsenkingsvæske mellom hornhinnen og linsen. Plasser øyet under målet og bilde de implanterte menneskelige holmene som beskrevet i tekstmanuskriptet.Hvis du vil fjerne autofluorescence, går du til bildebehandlingsfanen, velger kanalaritmetikk og skriver kanal én minus kanal to. Dette oppretter en ny kanal fire. Gi det nytt navn til vaskulaturen.Gjenta denne prosessen og skriv kanal tre minus kanal to for å opprette en ny kanal fem og endre navn på det tomat alle. Hvis du vil definere holmen manuelt, oppretter du en ny overflate og velger rediger manuelt i veiviseren. Hold pekeren i valgmodus og i 3D-visning.Og klikk volum for å visualisere inndelinger. Velg kontur og klikk tegne i tegnefanen for å starte tegnekonturer rundt holmekantlinjen, fra og med stykkeposisjon én. Deretter går du over til en ny skiveposisjon og gjentar tegnekonturer.Avslutt med det siste stykket øverst på holmen og avslutt ved å klikke på opprett overflatefanen. Neste segment, holmevaskulatur og holme tomatfluorescens ved hjelp av holmemaske. Velg det tidligere definerte isletmaskeobjektet, gå til redigeringsfanen og klikk på fanen alle, som åpner et nytt vindu.Velg vaskulaturkanalen i rullegardinmenyen for kanalvalg og aktiver alternativer duplisere kanal før du bruker maske. Konstant inne, ute og sett voxels utenfor overflaten til 0.000 som skaper en ny kanal seks. Gi nytt navn til denne kanaltelevaskulaturen.Gjenta de forrige trinnene og velg tomat alt i kanalen utvalg rullegardinmenyen, for å opprette den nye kanalen, endre navn på den, holme tomat. Deretter oppretter du en ny overflate i scenemenyen og velger automatisk oppretting i veiviseren. Sett kildekanalen til den tidligere opprettede holmevaskulaturen, og velg subtraksjon i bakgrunnen.Du kan eventuelt bruke filtre. Velg for eksempel volum og juster filteret i vinduet, som kan fjerne valgte serviceobjekter. Fullfør veiviseren og gi navn til det nye overflateobjektet, holmevaskulaturen.I serviceobjektet for holmevaskulatur går du til redigeringsfanen og klikker på masken alle kategoriene, som åpner et nytt vindu. Velg holme tomat kanal i kanalen utvalg dropdown menyen og sette voxels utenfor overflaten til 10.000 som skaper en ny kanal. Gi nytt navn til denne kanalen holme tomat vaskulatur.For å segmentere tomatkapsel fluorescerende signal velg kanal aritmetikk i bildebehandling kategorien og type kanal syv minus kanal åtte opprette den nye kanalen. Gi den nytt navn til tomatkapselen. Lag en ny overflate som tidligere beskrevet og velg kildekanaler, holmetovasulatur eller tomatkapsel i veiviseren.Utfør deretter subtraksjon i bakgrunnen. Åpne islet backscatter-filen og opprett en ny overflate. Velg automatisk oppretting i veiviseren, og definer interesseområde.Juster om nødvendig terskelen i absolutt intensitet. Overflateobjektet kan klikkes på eller av, for å krysssjekke med tilsvarende kanalintensitet. Når du er ferdig lukke veiviseren.Til slutt utfører du kvantifisering, velger et opprettet overflateobjekt i scenemenyen og går til statistikkfanen. Hvis du vil hente detaljerte volumdata, velger du den detaljerte fanen og velger bestemte verdier og volum fra rullegardinmenyen. Hvis du vil hente total volumverdi, går du til den detaljerte kategorien og velger gjennomsnittsverdier.Denne protokollen ble brukt til å transplantere ikke-merkede menneskelige holmer inn i det indre kammeret i øyet til åtte uker gamle kvinnelige røde fluorescerende mottakermus. Interaktiv bildebehandlingsprogramvare ble deretter brukt til å trekke ut kvantitative data fra bildene. In vivo fluorescens imaging, ble de menneskelige holme grafts kompromittert av betydelig interferens fra vev autofluorescence som ikke ble observert i mus holme grafts.For å forbedre signal-til-støy-forholdet ble autofluorescence-kanalen trukket fra. Deretter ble holmegrensen kalt holmemaske og de tilsvarende kanalene definert manuelt. Til slutt ble segmenteringen av tomatsignalet inn i øyelokkvaskulaturen og øyelokkkapselen og endelig overflategjengivelse brukt til å trekke ut kvantitative data.Her som en representativ langsgående bildebehandling økt av samme menneskelige holme pode på to uker, to måneder, fem måneder og åtte måneder etter transplantasjon. MIP-bilder av opprinnelig innspilte rådata, behandlede bilder etter fjerning av holme autofluorescence og et segmentert holmeobjekt vises. Når du utfører øyelokkinjeksjonen, må du passe på å forhåndslaste holmene i et lite volum og bruke fleksible tvillinglysarmer på stereomikroskopet, for å markere øyekammerrommet for å kunne injisere holmene i ACE.Etter in vivo-avbildningen kan øynene festes og undersøkes videre for antistofffarging og konvensjonell histologi. Denne teknikken er svært nyttig for funksjonelle studier av individuelle menneskelige holmer i sanntid og under fysiologiske forhold, spesielt i sammenheng med vaskularisering, levedyktighet og metabolske studier.

Research

JoVE Journal

Medicine

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Subretinal Injeksjon av Gene Therapy Vektorer og stamceller i mus Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Transplantasjon i fremre kammer av øyet for Longitudinal, Ikke-invasive<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging med encellede oppløsning i sanntid

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolasjon, Kultur, og Imaging of Human Fetal Bukspyttkjertelen Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

I Vivo Optisk Imaging av hjernesvulster og leddgikt Bruke Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mus Modell av Type 2 Diabetes: Bukspyttkjertel Islet Isolasjon og Live-celle 2-Photon Imaging av intakte holmer

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

In vivo avbilding og sporing av Technetium-99m Merket Bone Marrow stamceller i Equine tendinopati

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studerer Bukspyttkjertelkreft Stem Cell Kjennetegn for å utvikle nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Nedbryting av museceller fra menneske tumorxenotransplantater forbedrer Nedstrøms Analyse av Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

longitudinal<em&gt; I Vivo</em&gt; Imaging av Cerebrovasculature: Relevans til CNS sykdommer

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular ...

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo

Laser Doppler: Et verktøy for måling bukspyttkjertelen Holme mikrovaskulær Vasomotion i Vivo

As a functional status of microcirculation, microvascular vasomotion is important for the delivery of oxygen and nutrients and the removal of carbon ...