Name: longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber
Uploaded: 2020-06-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pelo Conselho Sueco de Pesquisa, Área de Pesquisa Estratégica Exodiab, Dnr 2009-1039, fundação sueca de pesquisa estratégica Dnr IRC15-0067 para ludc-IRC, a Royal Physiographic Society em Lund, Diabetesförbundet e Barndiabetesförbundet.

O Comitê regional de Ética em Lund, Suécia, aprovou o estudo de acordo com o Ato relativo à Revisão Ética da Pesquisa Envolvendo Humanos. Os experimentos em animais foram realizados em estrita conformidade com a ética sueca dos experimentos em animais e aprovados pelos comitês de ética de Malmö e Lund. NOD imunodeficente de 6 a 8 semanas. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. Rosa-tomate. Os camundongos receptores rag2-/-foram utilizado...

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET/MRI+enables+simultaneous+in+vivo+quantification+of+beta-cell+mass+and+function.">PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function.</a> Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Allogeneic+Islet+Grafts+in+Nonhuman+Primates+Using+MRI.">Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI.</a> Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).</li><li>Gotthardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+beta+cells+by+PET+imaging:+why+clinical+implementation+has+never+been+closer.">Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer.</a> Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).</li><li>Joosten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Pancreatic+beta+Cell+Mass+in+Vivo+with+Exendin+SPECT+during+Hyperglycemia+and+Severe+Insulitis.">Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis.</a> Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).</li><li>Virostko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+mouse+models+quantifies+beta+cell+mass+in+the+pancreas+and+after+islet+transplantation.">Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).</li></ol>

Um método é apresentado para estudar o processo de enxerto de células de ilhotas pancreáticas humanas, observando o envolvimento do receptor e do tecido doador. Após uma cirurgia invasiva mínima implantando ilhotas humanas na câmara anterior de um olho de rato imunodeficente, o rato se recupera rapidamente em poucos minutos após a cirurgia. O procedimento é realizado em um olho. Geralmente, de 5 a 7 dias de postimplantação em diante a córnea é suficientemente curada para realizar imagens intravitais.
<p ...

Diabetes mellitus descreve um grupo de doenças metabólicas caracterizadas por níveis elevados de glicose no sangue como resultado da produção insuficiente de insulina de perda ou disfunção de células beta de ilhotas pancreáticas, muitas vezes acompanhadas pela resistência à insulina. Diabetes tipo 1 (T1D) e tipo 2 (T2D) são doenças complexas nas quais a disfunção progressiva das células beta causa o desenvolvimento da doença. O T1D é precipitado por um ataque autoimune nas células beta, enquanto o T2D é considerado impulsionado por fatores metabólicos, embora com evidências crescentes de inflamação sistêmica de baixo grau1. O transplante de ilhotas humanas doadoras, particularmente para pacientes com T1D, oferece o potencial para fornecer controle fisiológico glicêmico. No entanto, a escassez de doadores de tecidos e o enxerto de ilhotas pobres impediram o transplante de ilhotas para se tornar uma opção terapêutica convencional. Uma proporção substancial do enxerto de ilhota funcional é perdida no período pós-transplantação imediato (24-48 h) devido ao ambiente hospedeiro hipóxico, inflamatório e imunogênico2,3. Para avaliar a eficiência dos métodos de intervenção para a melhoria da sobrevida de ilhotas, é necessário o acompanhamento contínuo desses transplantes.
Técnicas in vivo para imagem e rastrear o destino das ilhotas pancreáticas humanas transplantadas após o transplante ainda permanecem um desafio para a pesquisa sobre diabetes4,5. Até o momento, técnicas não invasivas de imagem, incluindo tomografia de emissão de pósitrons (PET), ressonância magnética (RM) ou ultrassom (EUA) mostram potencial para quantificação e avaliação funcional de ilhotas transplantadas em condições experimentais5. No entanto, dado o pequeno tamanho de ilhotas, as medições quantitativas por essas modalidades sofrem de resolução insuficiente. A câmara anterior do olho (ACE) como local de transplante para observação é uma promissora solução de imagem não invasiva que oferece efetivamente maior resolução espacial e monitoramento frequente ao longo dos longos períodos6. Este método foi explorado com sucesso para estudar a biologia da ilhota do rato (revisada em Yang et al.7), respostas imunes autoimunes8, bem como enxerto de ilhotas humanas9,,10.
Aqui, o método de transplante ACE é combinado com uma abordagem de imagem de 2 fótons para investigar a dinâmica do processo de enxerto de ilhotas pancreáticas humanas por gravações contínuas e repetidas em enxertos de ilhotas individuais por até 10 meses após o transplante. As propriedades de imagem multifotíferas de maiores profundidades de imagem e redução do fotobleaching geral e danos fotográficos superam as limitações de imagem da microscopia confocal11. A quantificação da imagem fluorescente envolve várias etapas, incluindo preparação da amostra de ilhotas, transplante de ilhotas, aquisição de imagens, filtragem de imagens para remover ruído ou fundo de ilhotas, segmentação, quantificação e análise de dados. O passo mais desafiador é geralmente particionar ou segmentar uma imagem em várias partes ou regiões. Isso pode envolver a separação do sinal do ruído de fundo, ou regiões de agrupamento de voxels com base em semelhanças em cor ou forma para detectar e rotular voxels de um volume 3D que representa vasculatura ilhota, por exemplo. Uma vez segmentadas, estatísticas como tamanhos de volume de objeto são tipicamente simples de extrair. Fornecido é um método para quantificação e extração dos dados de imagem, como segmentação e visualização de dados. Atenção especial é dada à remoção da autofluorescência em ilhotas humanas e à distinção entre vasculatura de ilhotas e cápsula de ilhota formando células receptoras.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8323001</td>
			<td>used for isofluran anasthesia during surgery and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-induction chamber 1.4 L</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8329002</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas routing switch</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8433005</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AngioSense 680 EX</td>
			<td>Percin Elmer</td>
			<td>NEV10054EX</td>
			<td>imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes assemblies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml</td>
			<td>Schering-Plough Europ&#233;</td>
			<td>64022</td>
			<td>fluid, for pain relief</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>321242C</td>
			<td>used together with Aspirator tubes assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Texas Red (TR), 70kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1830</td>
			<td>imaging agent for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cannula, blunt end , 25 G</td>
			<td>BVI Visitec/BD</td>
			<td>BD585107</td>
			<td>custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45&#8304;), tip tapered to 30 G (0.3mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81242</td>
			<td>Plunger type gas-tight syringe for islet injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Head holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-UST-2 Solid Universal Joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>UST-2</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-custom made metal plate for head-holder assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Dumont #5, straight</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>0207-5TI-PS or 0208-5-PS</td>
			<td>attached to UST-2 (custom made)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad, custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>taped to the stereotaxic platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human islet culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-CMRL 1066</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td>cell culture media for human islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HEPES</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-L-glutamin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Gentamycin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Fungizone</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ciproxfloxacin</td>
			<td>Bayer healthcare AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Imaris 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Aquisition software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>ZEN 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1010364937</td>
			<td>used to keep animals warm in the wake-up cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Isoflo</td>
			<td>Abott Scandinavia/Apotek</td>
			<td></td>
			<td>fluid, for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange</td>
			<td>BD</td>
			<td>10442204</td>
			<td>used as scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 90mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Photon/confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-LSM7 MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ti:Sapphire laser Tsunami</td>
			<td>Spectra-Physics, Mai Tai</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET710/40m (Angiosense 680)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>288003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET645/65m-2p (TR)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC528423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET525/50 (GFP)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET610/75 (tomato)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-main beam splitter T680lpxxr</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T680lpxxr</td>
			<td>Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)</td>
			<td>Smiths Medical Danmark</td>
			<td>800/100/120</td>
			<td>to connect with Hamilton syringe and eye canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Model SMZ645, for islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (Flourescence)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for islet graft imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ100 Multizoom</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>wide field and long distance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 1x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 4x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HG Manual New Intensilight</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block TEXAS RED</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>contains EX540-580, DM595 and BA600-660</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block G-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX510-560, DM575 and BA590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block B-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX450-490, DM505 and BA520)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1-ml, Omnitix</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>for Buprenorphine injection, used with 27 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber

As células beta de imagem são um passo fundamental para entender o transplante de ilhotas. Embora diferentes plataformas de imagem para o registro da biologia celular beta tenham sido desenvolvidas e utilizadas in vivo,elas são limitadas em termos de permitir resolução de células únicas e gravações longitudinais contínuas. Devido à transparência da córnea, a câmara anterior do olho (ACE) em camundongos é bem adequada para estudar biologia de células ilhotas pancreáticas humanas e de camundongos. Aqui está uma descrição de como essa abordagem pode ser usada para realizar gravações longitudinais contínuas de enxerto e revascularização de enxertos de ilhotas humanas individuais. Enxertos de ilhotas humanas são inseridos no ACE, usando NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-ratos como destinatários. Isso permite a investigação da expansão das células receptoras versus doadoras e a contribuição das células receptoras na promoção do encapsulamento e vascularização do enxerto. Além disso, é delineada uma abordagem passo a passo para análise de imagens e quantificação do volume de ilhotas ou vasculatura segmentada e cápsula de ilhota formando células receptoras.

Ilhotas humanas não rotuladas foram transplantadas no ACE de uma mulher de 8 semanas de idade. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-tomate. Rag2−/−) camundongos receptores. Para evitar a rejeição do tecido humano, os camundongos de rag2 imunodeficientes foram escolhidos como receptores. Nestes camundongos transgênicos, todas as células e tecidos expressaram uma proteína de fluorescência de tomate (mT) direcionada à membrana que p...

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Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

O objetivo deste protocolo é monitorar continuamente a dinâmica do processo de engrafamento da ilhota pancreática humana e o acolhimento contribuinte versus células doadoras. Isso é feito transplantando ilhotas humanas na câmara anterior do olho (ACE) de um NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor do mouse seguido de repetidas imagens de 2 fótons.

Imagem longitudinal in Vivo e quantificação de células hospedeiras pancreáticas humanas na câmara de olho anterior

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

O ACE é uma visão de imagem ideal. Ele suporta repeti-lo em imagens in vivo de longo prazo de células ilhotas, a fim de estudar sua função e viabilidade em uma situação de enxerto. Também pode ser estendido para estudar outros aspectos em condições fisiológicas e patológicas em tempo real.A vantagem da técnica ACE reside no fato de que as mesmas ilhotas pancreáticas humanas individuais podem ser seguidas não invasivamente com resolução subcelular por um longo período de tempo. As taxas de sucesso da terapia de substituição de células beta continuam a melhorar. No entanto, avaliar a eficiência do enxerto de ilhotas e a sobrevivência in vivo, ainda é desafiador.Esse método poderia ajudar a avaliar e otimizar os resultados dos transplantes de ilhotas. Esta abordagem não se restringe apenas às ilhotas pancreáticas. Também é adequado para estudar tecidos afetados.Por exemplo, em complicações diabéticas, como glomeruli renal ou pedaços de fígado, apenas para citar alguns. Para começar coloque o mouse em uma almofada de aquecimento quente posicione-o no porta-cabeça e coloque a máscara do nariz. Use o polegar e o dedo indicador para levantar ligeiramente a cabeça.Aperte-o com as peças metálicas nas laterais. Certificando-se de que os pedaços da orelha fixam a cabeça diretamente abaixo das orelhas. Injete subcutâneamente a solução de buprenorfina na parte de trás do mouse.Retraia suavemente as pálpebras do olho para serem transplantadas usando fórceps contundentes. Coloque o olho para fora e fixe-o livremente com um par de pinças cobertas com um tubo de polietileno. Depois de transferir as pálpebras para uma placa de Petri com PBS, pegue aproximadamente 20 a 30 ilhotas no cannular dos olhos.Usando um nível de agulha de 25 medidor para cima, insira cuidadosamente a ponta na córnea e faça uma única incisão lateral. Levante cuidadosamente a córnea com a cânula pré-carregada com ilhotas e solte lentamente as ilhotas no olho. Retraia lentamente a cânula e aplique gel ocular no olho.Após 10 minutos, retire as fórceps, segurando a pálpebra e coloque o olho de volta à sua posição normal. Para a imagem de ilhotas humanas implantadas com duas microscopia de fótons, coloque a plataforma do porta-cabeça sob o microscópio e administre gel ocular no olho como um líquido de imersão entre a córnea e a lente. Posicione o olho sob o objetivo e a imagem das ilhotas humanas implantadas, conforme descrito no manuscrito do texto.Para remover a autofluorescência, vá para a guia de processamento de imagens, escolha aritmética do canal e digite o canal um menos o canal dois. Isso cria um novo canal quatro. Renomeie-o vasculatura.Repita este processo e digite o canal três menos canal dois para criar um novo canal cinco e renomeá-lo para todos. Para definir a ilhota crie manualmente uma nova superfície e escolha editar manualmente no assistente. Mantenha o ponteiro no modo seleto e na exibição 3D.E clique em volume para visualizar seções. Na guia de desenho escolha contorno e clique em desenhar para começar a desenhar contornos ao redor da borda da ilhota, começando na posição de fatia um. Em seguida, mova-se para uma nova posição de fatia e repita contornos de desenho.Finalize com a última fatia na parte superior da ilhota e finalize clicando na guia de superfície de criação. Próximo segmento, vasculatura de ilhota e fluorescência de tomate ilhota usando máscara de ilhota. Escolha o objeto da máscara de ilhota previamente definido, vá para a guia de edição e clique na guia máscara all, que abre uma nova janela.Escolha o canal vasculatura no menu suspenso de seleção do canal e ative as opções de canal duplicado antes de aplicar máscara. Constante por dentro, fora e definir voxels fora da superfície para 0.000 que cria um novo canal seis. Renomeie esta vasculatura ilhota do canal.Repita as etapas anteriores e escolha o tomate tudo no menu suspenso da seleção do canal, para criar o novo canal, renomeá-lo, tomate ilhota. Em seguida, crie uma nova superfície no menu de cena e escolha a criação automática no assistente. Defina o canal de origem para a vasculatura de ilhota criada anteriormente e escolha subtração de fundo.Opcionalmente, use filtros. Por exemplo, escolha o volume e ajuste o filtro na janela, que pode remover objetos de serviço selecionados. Termine o assistente e nomeie o novo objeto de superfície, vasculatura de ilhota.Na islet vasculatura objeto de serviço vá para a guia de edição e clique na guia máscara all, que abre uma nova janela. Escolha o canal de tomate ilhota no menu suspenso da seleção do canal e defina voxels fora da superfície para 10.000, o que cria um novo canal. Renomeie este canal ilhota vasculatura de tomate.Para segmentar o sinal fluorescente da cápsula de tomate escolha aritmética do canal na guia de processamento de imagem e digite o canal sete menos canal oito criando o novo canal. Renomeie a cápsula de tomate. Crie uma nova superfície como descrito anteriormente e escolha canais de origem, vasculatura de tomate ilhota ou cápsula de tomate no assistente.Em seguida, execute a subtração de fundo. Abra o arquivo backscatter da ilhota e crie uma nova superfície. No assistente, escolha a criação automática e defina região de interesse.Se necessário, ajuste o limiar em intensidade absoluta. O objeto de superfície pode ser clicado dentro ou fora, para cruzar com a intensidade correspondente do canal. Quando terminar perto do feiticeiro.Finalmente, realize a quantificação, selecione um objeto de superfície criado no menu de cena e vá para a guia estatísticas. Para recuperar dados detalhados de volume, escolha a guia detalhada e selecione valores e volumes específicos no menu suspenso. Para recuperar o valor total do volume, vá para a guia detalhada e escolha valores médios.Este protocolo foi usado para transplantar ilhotas humanas não rotuladas na câmara interna do olho de camundongos receptores fluorescentes vermelhos de oito semanas. O software de imagem interativo foi então usado para extrair dados quantitativos das imagens. Em imagens de fluorescens in vivo, os enxertos de ilhotas humanas foram comprometidos por interferência significativa da autofluorescência tecidual que não foi observada em enxertos de ilhotas de camundongos.Para melhorar a relação sinal/ruído, o canal de autofluorescência foi subtraído. Em seguida, o limite da ilhota chamado máscara de ilhota e os canais correspondentes foram definidos manualmente. Finalmente, utilizou-se a segmentação do sinal de tomate na vasculatura das pálpebras e na cápsula das pálpebras e na renderização final da superfície para extrair dados quantitativos.Aqui como representante da sessão de imagem longitudinal do mesmo enxerto de ilhota humana em duas semanas, dois meses, cinco meses e oito meses após o transplante. Imagens MIP de dados brutos gravados originalmente, imagens processadas após a remoção da autofluorescência da ilhota e objetos de ilhotas segmentados são mostrados. Ao realizar a injeção das pálpebras, certifique-se de pré-carregar as ilhotas em um pequeno volume e usar braços de luz dupla flexíveis no microscópio estéreo, para destacar o espaço da câmara ocular para injetar com sucesso as ilhotas no ACE.Após a imagem in vivo, os olhos podem ser fixos e ainda mais investigados por manchas de anticorpos e histologia convencional. Esta técnica é muito útil para estudos funcionais de ilhotas humanas individuais em tempo real e em condições fisiológicas, especialmente no contexto de vascularização, viabilidade e estudos metabólicos.

Research

JoVE Journal

Medicine

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Injeção de sub-retiniana de Vetores da terapia genética e células-tronco no olho do rato

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Medicina

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

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Transplante para a câmara anterior do olho para longitudinal, não-invasivo<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging com uma única célula de resolução em tempo real

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Isolamento, cultura, e imagem de Fetal Humano pancreáticas grupos de células

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

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In Vivo Imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

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Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

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Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Estudar o cancro do pâncreas Stem características celulares para desenvolver estratégias Novo tratamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

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Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

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