Name: longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber
Uploaded: 2020-06-11T14:30:00
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Este estudio fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación, El área de investigación estratégica Exodiab, Dnr 2009-1039, la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica Dnr IRC15-0067 a LUDC-IRC, la Sociedad Fisiográfica Real en Lund, Diabetesf-rbundet y Barndiabetesf-rbundet.

El Comité Regional de ética en Lund, Suecia, aprobó el estudio de acuerdo con la Ley relativa a la revisión ética de la investigación que involucra a los seres humanos. Los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con la ética sueca de los experimentos con animales y fueron aprobados por los comités de ética de Malmá y Lund. NOD inmunodeficientes de 6 a 8 semanas de edad. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-tomate. Los ratones rec...

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET/MRI+enables+simultaneous+in+vivo+quantification+of+beta-cell+mass+and+function.">PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function.</a> Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).</li><li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Allogeneic+Islet+Grafts+in+Nonhuman+Primates+Using+MRI.">Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI.</a> Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).</li><li>Gotthardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+beta+cells+by+PET+imaging:+why+clinical+implementation+has+never+been+closer.">Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer.</a> Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).</li><li>Joosten, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Pancreatic+beta+Cell+Mass+in+Vivo+with+Exendin+SPECT+during+Hyperglycemia+and+Severe+Insulitis.">Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis.</a> Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).</li><li>Virostko, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+in+mouse+models+quantifies+beta+cell+mass+in+the+pancreas+and+after+islet+transplantation.">Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).</li></ol>

Se presenta un método para estudiar el proceso de injerto de células de islotes pancreáticos humanos observando la participación del tejido receptor y donante. Después de una cirugía mínima invasiva que implanta islotes humanos en la cámara anterior de un ojo de ratón inmunodeficient, el ratón se recupera rápidamente en cuestión de minutos después de la cirugía. El procedimiento se realiza en un ojo. Generalmente, de 5 a 7 días después de la posimplantación en adelante, la córnea está lo suficientement...

La diabetes mellitus describe un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por niveles elevados de glucosa en sangre como resultado de la producción insuficiente de insulina por pérdida o disfunción de las células beta de islotes pancreáticos, a menudo acompañadas de resistencia a la insulina. La diabetes tipo 1 (T1D) y la diabetes tipo 2 (T2D) son enfermedades complejas en las que la disfunción progresiva de las células beta causa el desarrollo de la enfermedad. T1D se precipita por un ataque autoinmune en las células beta, mientras que T2D se considera impulsado por factores metabólicos, aunque con evidencia creciente de inflamación sistémica de bajo grado1. El trasplante de islotes humanos donantes, particularmente a pacientes con T1D, ofrece la posibilidad de proporcionar control glucémico fisiológico. Sin embargo, la escasez de donantes de tejidos y el injerto deficiente de islotes han evitado que el trasplante de islotes se convierta en una opción terapéutica principal. Una proporción sustancial del injerto de islotes funcionales se pierde en el período inmediatamente posttrasplante (24-48 h) debido al entorno huésped hipoxico, inflamatorio e inmunogénico2,,3. Para evaluar la eficiencia de los métodos de intervención para la mejora de la supervivencia de los islotes, es necesario un seguimiento continuo de dichos trasplantes.
Las técnicas in vivo para imaginar y rastrear el destino de los islotes pancreáticos humanos trasplantados después del trasplante siguen siendo un desafío para la investigación de la diabetes4,,5. Hasta la fecha, las técnicas de imagen no invasiva, incluida la tomografía por emisión de positrones (PET), la resonancia magnética (RM) o la ecografía (EE.UU.) muestran un potencial para la cuantificación y evaluación funcional de islotes trasplantados en condiciones experimentales5. Sin embargo, dados los pequeños tamaños de los islotes, las mediciones cuantitativas de esas modalidades son insuficientes. La cámara anterior del ojo (ACE) como lugar de trasplante para la observación es una solución de imagen no invasiva prometedora que ofrece una resolución espacial efectivamente más alta y un monitoreo frecuente durante largos períodos de tiempo6. Este método ha sido explotado con éxito para estudiar la biología de los islotes de ratón (revisado en Yang et al.7), las respuestas inmunitarias autoinmunes8, así como el injerto de islote humano9,10.
Aquí el método de trasplante de ACE se combina con un enfoque de imágenes de 2 fotones para investigar la dinámica del proceso de injerto de islotes pancreáticos humanos mediante grabaciones continuas y repetidas en injertos de islotes individuales hasta 10 meses después del trasplante. Las propiedades de imagen multifotónica de mayores profundidades de imagen y reducción del fotoblancarido general y el daño fotográfico superan las limitaciones de imagen de la microscopía confocal11. La cuantificación de imágenes fluorescentes implica varias etapas, incluyendo la preparación de muestras de islotes, el trasplante de islotes, la adquisición de imágenes, el filtrado de imágenes para eliminar el ruido o el fondo de los islotes, la segmentación, la cuantificación y el análisis de datos. El paso más difícil suele ser particionar o segmentar una imagen en varias partes o regiones. Esto podría implicar la separación de la señal del ruido de fondo, o las regiones de agrupación en clústeres de vóxeles en función de similitudes en el color o la forma para detectar y etiquetar los vóxeles de un volumen 3D que representa la vasculatura de islotes, por ejemplo. Una vez segmentadas, las estadísticas, como los tamaños de volumen de objetos, suelen ser fáciles de extraer. Se proporciona un método para la cuantificación y extracción de los datos de imágenes, como la segmentación y la visualización de datos. Se presta especial atención a la eliminación de la autofluorescencia en los islotes humanos y a la distinción entre la vasculatura del islote y la cápsula de islote que forma células receptoras.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8323001</td>
			<td>used for isofluran anasthesia during surgery and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-induction chamber 1.4 L</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8329002</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas routing switch</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>8433005</td>
			<td>connect via tubing to U-400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AngioSense 680 EX</td>
			<td>Percin Elmer</td>
			<td>NEV10054EX</td>
			<td>imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tubes assemblies</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td>connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml</td>
			<td>Schering-Plough Europ&#233;</td>
			<td>64022</td>
			<td>fluid, for pain relief</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>321242C</td>
			<td>used together with Aspirator tubes assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-Texas Red (TR), 70kDa</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1830</td>
			<td>imaging agent for injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye cannula, blunt end , 25 G</td>
			<td>BVI Visitec/BD</td>
			<td>BD585107</td>
			<td>custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45&#8304;), tip tapered to 30 G (0.3mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81242</td>
			<td>Plunger type gas-tight syringe for islet injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Head holding adapter</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SG-4N-S</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-gas mask</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GM-4-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-UST-2 Solid Universal Joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>UST-2</td>
			<td>assemled onto metal plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-custom made metal plate for head-holder assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Dumont #5, straight</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>0207-5TI-PS or 0208-5-PS</td>
			<td>attached to UST-2 (custom made)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad, custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>taped to the stereotaxic platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human islet culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-CMRL 1066</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td></td>
			<td>cell culture media for human islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HEPES</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-L-glutamin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Gentamycin</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Fungizone</td>
			<td>GIBCO BRL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ciproxfloxacin</td>
			<td>Bayer healthcare AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Imaris 9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Aquisition software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>ZEN 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1010364937</td>
			<td>used to keep animals warm in the wake-up cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Isoflo</td>
			<td>Abott Scandinavia/Apotek</td>
			<td></td>
			<td>fluid, for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange</td>
			<td>BD</td>
			<td>10442204</td>
			<td>used as scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 90mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Photon/confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-LSM7 MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Ti:Sapphire laser Tsunami</td>
			<td>Spectra-Physics, Mai Tai</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET710/40m (Angiosense 680)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>288003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET645/65m-2p (TR)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>NC528423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET525/50 (GFP)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-ET610/75 (tomato)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-main beam splitter T680lpxxr</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>T680lpxxr</td>
			<td>Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD)</td>
			<td>Smiths Medical Danmark</td>
			<td>800/100/120</td>
			<td>to connect with Hamilton syringe and eye canula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Model SMZ645, for islet picking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope (Flourescence)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for islet graft imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ100 Multizoom</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>wide field and long distance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 1x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ Plan Apo 4x</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-HG Manual New Intensilight</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block TEXAS RED</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>contains EX540-580, DM595 and BA600-660</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block G-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX510-560, DM575 and BA590)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-Epi-FL Filter Block B-2A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>(EX450-490, DM505 and BA520)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1-ml, Omnitix</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>for Buprenorphine injection, used with 27 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal in vivo imaging and quantification of human pancreatic islet grafting and contributing host cells in the anterior eye chamber

La toma de imágenes de células beta es un paso clave hacia la comprensión del trasplante de islotes. Aunque se han desarrollado y utilizado in vivodiferentes plataformas de imágenes para el registro de la biología de células beta, están limitadas en términos de permitir la resolución de una sola célula y grabaciones longitudinales continuas. Debido a la transparencia de la córnea, la cámara anterior del ojo (ACE) en ratones es muy adecuada para estudiar la biología celular de los islotes pancreáticos humanos y de ratón. Aquí está una descripción de cómo este enfoque se puede utilizar para realizar grabaciones longitudinales continuas de injerto y revascularización de injertos de islotes humanos individuales. Los injertos de islotes humanos se insertan en el ACE, utilizando NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-ratones como receptores. Esto permite la investigación de la expansión de las células receptoras frente a las de los donantes y la contribución de las células receptoras en la promoción de la encapsulación y vascularización del injerto. Además, se describe un enfoque paso a paso para el análisis de imágenes y la cuantificación del volumen de los islotes o de la vasculatura segmentada y de las células receptoras que forman cápsulas de islotes.

Los islotes humanos no etiquetados fueron trasplantados a la ACE de la NOD femenina de 8 semanas de edad. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-tomate. RatonesreceptoresRag2 . Para prevenir el rechazo del tejido humano, se eligieron ratones noqueadores Rag2 inmunodeficientes como receptores. En estos ratones transgénicos, todas las células y tejidos expresaron una proteína de fluorescencia de tomate (mT) dirigida a la membrana que permite ...

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Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber

El objetivo de este protocolo es monitorear continuamente la dinámica del proceso de injerto de islotes pancreáticos humanos y el huésped contribuyente frente a las células del donante. Esto se logra trasplantando islotes humanos en la cámara anterior del ojo (ACE) de un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor del ratón seguido de imágenes repetidas de 2 fotones.

Longitudinal en Imágenes Vivos y Cuantificación del Injerto de Islotes Pancreáticos Humanos y Células Huésped Contribuyentes en la Cámara Ocular Anterior

Imaging beta cells is a key step towards understanding islet transplantation. Although different imaging platforms for the recording of beta cell biology ...

El ACE es una mira de imagen óptima. Es compatible con repetirlo en imágenes in vivo a largo plazo de células de islotes con el fin de estudiar su función y viabilidad en una situación de injerto. También se puede extender para estudiar otros aspectos bajo condiciones fisiológicas y patológicas en tiempo real.La ventaja de la técnica ACE radica en el hecho de que los mismos islotes pancreáticos humanos individuales pueden seguirse de forma no invasiva con resolución subcelular durante un largo período de tiempo. Las tasas de éxito de la terapia de reemplazo de células beta continúan mejorando. Sin embargo, la evaluación de la eficiencia del injerto de islotes y la supervivencia in vivo, sigue siendo difícil.Este método podría ayudar a evaluar y optimizar los resultados de los trasplantes de islotes. Este enfoque no se limita únicamente a los islotes pancreáticos. También es adecuado para estudiar los tejidos afectados.Por ejemplo, en complicaciones diabéticas, como glomérulos renales o piezas hepáticas, sólo para nombrar algunos. Para comenzar, coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento caliente colóquelo en el soporte de la cabeza y póngase la máscara nasal. Utilice el pulgar y el dedo índice para levantar ligeramente la cabeza.Fijarlo con las piezas metálicas en los lados. Asegurarse de que las piezas de la oreja fijan la cabeza directamente debajo de las orejas. Inyecte por vía subcutánea la solución de buprenorfina en la parte posterior del ratón.Retraiga suavemente los párpados del ojo para ser trasplantados usando fórceps contundentes. Saca el ojo y fíjelo libremente con un par de pinzas cubiertas con un tubo de polietileno. Después de transferir los párpados a un plato de Petri con PBS, recoja aproximadamente 20 a 30 islotes en el ojo cannular.Usando un nivel de aguja de calibre 25 hacia arriba, inserte cuidadosamente la punta en la córnea y haga una sola incisión lateral. Levante cuidadosamente la córnea con la cánula precargada con islotes, y suelte lentamente los islotes en el ojo. Retraiga lentamente la cánula y aplique gel para los ojos en el ojo.Después de 10 minutos, retire los fórceps, sosteniendo el párpado y vuelva a colocar el ojo en su posición normal. Para obtener imágenes de islotes humanos implantados con dos microscopía de fotones, coloque la plataforma del soporte de la cabeza bajo el microscopio y administre gel para los ojos en el ojo como líquido de inmersión entre la córnea y la lente. Coloque el ojo bajo el objetivo e imagine los islotes humanos implantados como se describe en el manuscrito del texto.Para eliminar la autofluorescencia, vaya a la pestaña de procesamiento de imágenes, elija aritmética de canal y escriba el canal uno menos el canal dos. Esto crea un nuevo canal cuatro. Cámbiele el nombre a vasculature.Repita este proceso y escriba el canal tres menos el canal dos para crear un nuevo canal cinco y cambiarle el nombre tomate todo. Para definir el islote, cree manualmente una nueva superficie y elija editar manualmente en el asistente. Mantenga el puntero en modo de selección y en vista 3D.Y haga clic en el volumen para visualizar las secciones. En la ficha de dibujo, elija el contorno y haga clic en dibujar para empezar a dibujar contornos alrededor del borde del islote, comenzando en la posición del sector uno. A continuación, desplácese a una nueva posición de corte y repita los contornos de dibujo.Termine con el último sector en la parte superior del islote y termine haciendo clic en la pestaña Crear superficie. Siguiente segmento, vasculatura de islotes y fluorescencia de tomate de islote usando máscara de islote. Elija el objeto de máscara de islote definido anteriormente, vaya a la pestaña de edición y haga clic en la pestaña máscara all, que abre una nueva ventana.Elija el canal de vasculatura en el menú desplegable de selección de canales y active las opciones de canal duplicado antes de aplicar la máscara. Constante en el interior, exterior y establezca los voxels fuera de la superficie a 0.000 que crea un nuevo canal seis. Cambie el nombre de esta vasculatura de islote de canal.Repita los pasos anteriores y elija el tomate todo en el menú desplegable de selección de canales, para crear el nuevo canal, cambiarle el nombre, tomate islote. A continuación, cree una nueva superficie en el menú de escena y elija la creación automática en el asistente. Establezca el canal de origen en la vasculatura de islote creada anteriormente y elija la resta de fondo.Opcionalmente, utilice filtros. Por ejemplo, elija volume y ajuste el filtro en la ventana, que puede eliminar los objetos de servicio seleccionados. Finalice el asistente y asigne un nombre al nuevo objeto de superficie, vasculatura de islotes.En el objeto de servicio vasculatura de islotes vaya a la pestaña de edición y haga clic en la pestaña máscara all, que abre una nueva ventana. Elija el canal de tomate de islote en el menú desplegable de selección de canales y establezca los voxels fuera de la superficie en 10.000, lo que crea un nuevo canal. Cambie el nombre de esta vasculatura de tomate de islote de canal.Para segmentar la señal fluorescente de la cápsula de tomate, elija la aritmética del canal en la pestaña de procesamiento de imágenes y escriba el canal siete menos el canal ocho creando el nuevo canal. Renombrarlo cápsula de tomate. Cree una nueva superficie como se ha descrito anteriormente y elija canales de origen, vasculatura de tomate de islote o cápsula de tomate en el asistente.A continuación, realice la resta de fondo. Abra el archivo de retrocayador de islotes y cree una nueva superficie. En el asistente, elija la creación automática y defina la región de interés.Si es necesario, ajuste el umbral en intensidad absoluta. El objeto de superficie se puede hacer clic en o desactivar, para realizar una comprobación cruzada con la intensidad de canal correspondiente. Cuando haya terminado, cierre el asistente.Por último, realice la cuantificación, seleccione un objeto de superficie creado en el menú de escena y vaya a la pestaña Estadísticas. Para recuperar datos de volumen detallados, elija la pestaña detallada y seleccione valores y volumen específicos en el menú desplegable. Para recuperar el valor total del volumen vaya a la pestaña detallada y elija los valores medios.Este protocolo se utilizó para trasplantar islotes humanos no etiquetados en la cámara interior del ojo de ratones receptores fluorescentes rojos hembra de ocho semanas de edad. A continuación, se utilizó un software de imágenes interactivo para extraer datos cuantitativos de las imágenes. Imágenes de fluorescens in vivo, los injertos de islotes humanos se vio comprometido por interferencia significativa de la autofluorescencia de tejido que no se observó en injertos de islotes en ratones.Para mejorar la relación señal/ruido, se restó el canal de autofluorescencia. A continuación, el límite del islote llamado máscara de islote y los canales correspondientes se definieron manualmente. Finalmente, la segmentación de la señal de tomate en la vasculatura del párpado y la cápsula del párpado y la representación superficial final se utilizó para extraer datos cuantitativos.Aquí como una sesión de imagen longitudinal representativa del mismo injerto de islote humano a las dos semanas, dos meses, cinco meses y ocho meses después del trasplante. Se muestran imágenes MIP de datos sin procesar grabados originalmente, imágenes procesadas después de la eliminación automática de la autofluorescencia del islote y objetos de islot segmentados. Al realizar la inyección del párpado, asegúrese de precargar los islotes en un volumen pequeño y utilizar brazos flexibles de doble luz en el microscopio estéreo, para resaltar el espacio de la cámara ocular con el fin de inyectar con éxito los islotes en la AEC.Después de la imagen in vivo, los ojos se pueden fijar e investigar más a fondo para detectar la tinción de anticuerpos y la histología convencional. Esta técnica es muy útil para estudios funcionales de islotes humanos individuales en tiempo real y en condiciones fisiológicas, especialmente en el contexto de la vascularización, viabilidad y estudios metabólicos.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Investigación

Medicina

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